血培養(yǎng)陰性血流感染影響因素及實(shí)驗(yàn)室檢測研究進(jìn)展

陳晗璐， 吳盛海

（1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310006；2. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 杭州 310006）

血流感染是指病原微生物侵入血流引起的播散感染，可造成感染性心內(nèi)膜炎、感染性休克、播散性血管內(nèi)凝血等嚴(yán)重的臨床后果，病死率高。血培養(yǎng)作為診斷血流感染的金標(biāo)準(zhǔn)，可以鑒定病原體，并提供抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，對指導(dǎo)臨床醫(yī)生進(jìn)行抗感染治療意義重大。隨著自動(dòng)化細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng)的引入，血培養(yǎng)的價(jià)值逐漸得到臨床的廣泛認(rèn)可。然而，血培養(yǎng)的陽性率并不高，有相當(dāng)比例的血流感染患者血培養(yǎng)結(jié)果呈陰性[1]。有學(xué)者對住院患者的血培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)血培養(yǎng)陽性率僅為8.37%～12.51%[2-3]。采血前使用抗菌藥物、苛養(yǎng)菌本身生長緩慢且對營養(yǎng)要求較高，以及一些胞內(nèi)寄生菌的感染等均可導(dǎo)致血培養(yǎng)結(jié)果呈陰性。血清學(xué)試驗(yàn)、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和下一代測序（nextgeneration sequencing，NGS）等分子生物學(xué)技術(shù)的使用，是血流感染病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室診斷的有效補(bǔ)充。

1 血培養(yǎng)結(jié)果的影響因素

1.1 分析前因素對血培養(yǎng)結(jié)果的影響

分析前因素指血培養(yǎng)樣本在送達(dá)微生物實(shí)驗(yàn)室前，對血培養(yǎng)結(jié)果有影響的所有因素，包括行血培養(yǎng)的臨床適應(yīng)癥，血培養(yǎng)樣本的采集時(shí)間和采集過程中皮膚的準(zhǔn)備和污染的預(yù)防，以及采集時(shí)血培養(yǎng)瓶的套數(shù)和采血量等。

1.1.1 抗菌藥物的使用 采血前使用抗菌藥物是降低血培養(yǎng)陽性率的獨(dú)立影響因素[4-5]。德國1項(xiàng)針對膿毒癥患者的前瞻性臨床隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，未接受抗菌藥物治療的膿毒癥患者血培養(yǎng)陽性率為50.6%（78/154），已接受抗菌藥物治療的患者血培養(yǎng)陽性率僅為27.7%（112/405）[5]。美國1項(xiàng)對行血培養(yǎng)的住院患者進(jìn)行的前瞻性隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，普通住院患者的血培養(yǎng)真陽性率遠(yuǎn)低于急診科和重癥監(jiān)護(hù)病房患者的血培養(yǎng)真陽性率，培養(yǎng)前72 h內(nèi)無抗菌藥物暴露可以有效提高菌血癥和心內(nèi)膜炎患者血培養(yǎng)陽性率[6]。雖然膿毒癥患者在進(jìn)行抗感染治療前進(jìn)行血培養(yǎng)有利于病原體的檢出，但鑒于早期廣譜抗菌藥物的使用可以有效降低膿毒癥患者的病死率和預(yù)防感染性休克，以及部分醫(yī)院試驗(yàn)條件的限制，臨床醫(yī)生往往會(huì)優(yōu)先考慮早期抗感染治療，而不是進(jìn)行血培養(yǎng)。

1.1.2 采血量不足 采集足量的血液樣本進(jìn)行血培養(yǎng)對血流感染病原體的檢出至關(guān)重要，采血量越大，血培養(yǎng)陽性率越高，血流感染的診斷率也就越高。1項(xiàng)評估了345例膿毒癥患者血培養(yǎng)采血量及其結(jié)果的研究發(fā)現(xiàn)，每多采集1 mL血液，血培養(yǎng)的陽性率可增加1%[7]。相關(guān)機(jī)構(gòu)建議的采血量為每瓶8～10 mL，但在實(shí)際操作中常難以達(dá)到[7]。采血相關(guān)培訓(xùn)的缺乏、重癥或嬰幼兒患者采血困難等因素均可導(dǎo)致血培養(yǎng)采血量不足[8]。一般情況下，實(shí)驗(yàn)室通常采取目測的方式評估采血量，但這不適用于樣本量較大的微生物實(shí)驗(yàn)室，因此有研究建議通過測量血培養(yǎng)瓶的重量來評估采血量，以提高血流感染的診斷效率[8]。

1.1.3 血培養(yǎng)樣本延遲上機(jī) 目前，絕大部分實(shí)驗(yàn)室是采用全自動(dòng)儀器進(jìn)行血培養(yǎng)監(jiān)測，血培養(yǎng)樣本延遲上機(jī)與血培養(yǎng)陽性率降低密切相關(guān)。相關(guān)指南[9]建議血培養(yǎng)樣本從采集到進(jìn)入自動(dòng)血液培養(yǎng)系統(tǒng)的時(shí)間不應(yīng)超過2～4 h，制造商也提出接種的血培養(yǎng)瓶應(yīng)該盡快運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室處理。然而，大多實(shí)驗(yàn)室無法提供24 h服務(wù)，工作時(shí)間以外采集的血培養(yǎng)樣本在進(jìn)入微生物實(shí)驗(yàn)室之前通常會(huì)在室溫下儲存較長時(shí)間。意大利1項(xiàng)大型的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，在工作時(shí)間采集并處理的血液樣本血培養(yǎng)陽性率為13.0%，而在實(shí)驗(yàn)室關(guān)閉期間采集并延遲上機(jī)的血液樣本中，只有10.8%的血培養(yǎng)結(jié)果呈陽性，且樣本采集到上機(jī)的時(shí)間每延長1 h，血培養(yǎng)陽性率會(huì)下降0.3%[9]。

1.2 生長緩慢的苛養(yǎng)微生物對血培養(yǎng)結(jié)果的影響

目前，在接種量及接種方式符合要求的情況下，自動(dòng)化血培養(yǎng)系統(tǒng)已經(jīng)能夠分離大多數(shù)可以生長的病原體，但HACEK（Haemophilus，Actinomyces，Cardiobacterium，Eikenella，Kingella）菌群、營養(yǎng)變異鏈球菌（Nutritionally Variant Streptococcus）、念珠菌等生長極為緩慢的苛養(yǎng)微生物，仍是引起血培養(yǎng)結(jié)果呈陰性的重要病原微生物。這些病原侵入血流可引起病程緩慢、臨床癥狀不典型的血流感染，引發(fā)血培養(yǎng)陰性感染性心內(nèi)膜炎（blood culture-negative endocarditis，BCNE）[10]。

1.2.1 HACEK菌群 HACEK是一組由嗜血桿菌屬、放線桿菌屬、心桿菌屬、艾肯菌屬和金桿菌屬組成的革蘭陰性桿菌群，可在人口咽和上呼吸道定植，在一定條件下可引起菌血癥和感染性心內(nèi)膜炎（infective endocarditis，IE）。但流感嗜血桿菌很少從IE患者的血液樣本中被培養(yǎng)出來，通常被排除在HACEK菌群之外[11]。瑞典1項(xiàng)針對菌血癥患者的回顧性研究結(jié)果顯示，每年因HACEK引起的菌血癥和IE的發(fā)病率分別為5.2例/百萬和1.2例/百萬[12]。在丹麥，HACEK引起的IE占此類病例的1.4%～3.0%，其中嗜血桿菌屬感染最為常見，其次是放線桿菌和金氏桿菌感染，年發(fā)病率分別為0.16例/10萬、0.11例/10萬和0.08例/10萬[11]。適當(dāng)延長血培養(yǎng)時(shí)間可增加HACEK的檢出率，在需氧條件下進(jìn)行血培養(yǎng)，HACEK通?？稍? d內(nèi)被檢測到，繼續(xù)延長血培養(yǎng)時(shí)間至>5 d并無太大意義[10，13]。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法對HACEK菌群的鑒定具有不確定性，采用PCR檢測血液樣本中的細(xì)菌需要設(shè)計(jì)針對各個(gè)種屬的特異性引物，而對16S rRNA基因擴(kuò)增后進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析，可以在沒有特異性引物的情況下鑒定每種HACEK細(xì)菌，16S rRNA測序也是鑒定HACEK細(xì)菌的可靠方法，但受到成本和設(shè)備可用性的限制[14]。

1.2.2 營養(yǎng)變異鏈球菌 營養(yǎng)變異鏈球菌是一組兼性厭氧細(xì)菌，包括孿生球菌、顆粒球菌、毗鄰貧養(yǎng)菌，是人類口腔、生殖道、泌尿道和腸道正常菌群的一部分，一定條件下可侵入機(jī)體引起菌血癥和IE。營養(yǎng)變異鏈球菌感染在鏈球菌感染相關(guān)的IE病例中約占3%～5%，與其他鏈球菌相比，營養(yǎng)變異鏈球菌引起的IE臨床病程緩慢，且具有更高的病死率[15]。齲齒是營養(yǎng)變異鏈球菌進(jìn)入血流的主要途徑，患者通常在發(fā)現(xiàn)幾個(gè)月前行牙科治療或發(fā)生齲齒[10]。營養(yǎng)變異鏈球菌的傳代培養(yǎng)需要在瓊脂中補(bǔ)充維生素B6或半胱氨酸，亦可在血瓊脂平板上點(diǎn)種金黃色葡萄球菌來支持其生長[16]。

1項(xiàng)回顧了12年中26例營養(yǎng)變異鏈球菌菌血癥病例的研究結(jié)果顯示，血培養(yǎng)報(bào)告陽性的時(shí)間為2～11 d，其中有7例報(bào)陽時(shí)間>5 d，超過大部分微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)血培養(yǎng)的時(shí)間，因此可以合理推測有其他BCNE或膿毒癥患者感染了該病原，建議實(shí)驗(yàn)室將臨床醫(yī)生高度懷疑為IE患者的血培養(yǎng)時(shí)間延長至10 d[17]。PCR-RFLP分析、16S rRNA測序等分子技術(shù)對鑒定營養(yǎng)變異鏈球菌也非常有意義，且對于BCNE，離體心臟瓣膜病原體靶基因檢測的敏感性遠(yuǎn)高于常規(guī)血培養(yǎng)[15]。

1.2.3 念珠菌 隨著移植手術(shù)的免疫抑制治療、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染、惡性血液病和癌癥等患者的增多，非致病真菌感染已成為一個(gè)嚴(yán)重的問題[18]。值得注意的是，盡管白念珠菌仍然是引起侵入性真菌感染最常見的菌種，但非白念珠菌感染的比例正逐漸上升。中國醫(yī)院侵入性真菌監(jiān)測網(wǎng)（China Hospital Invasive Fungal Surveillance Net，CHIF-NET）的5年監(jiān)測結(jié)果顯示，念珠菌菌血癥最常見的菌種是白念珠菌（32.3%），以下依次為近平滑念珠菌（28.9%）、熱帶念珠菌（17.5%）和光滑念珠菌（11.5%）[19]。

真菌感染的臨床診斷通常依靠培養(yǎng)和組織病理學(xué)檢查。由于血培養(yǎng)對血源播散性念珠菌病的敏感性<50%，且念珠菌生長緩慢，念珠菌病的治療常常會(huì)被延遲[14]。分子生物學(xué)技術(shù)可以為血培養(yǎng)結(jié)果為陰性的患者提供有價(jià)值的補(bǔ)充診斷信息，有研究利用泛真菌引物擴(kuò)增18S rRNA基因的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS），在100個(gè)血培養(yǎng)陰性樣本中檢出3個(gè)陽性結(jié)果[18]。

1.3 其他不能常規(guī)培養(yǎng)的病原體

伯納特立克次體（Coxiella Burnetii）、巴爾通體（Bartonella）和惠普爾滋養(yǎng)體（Tropheryma whipplei）是“真正的”血培養(yǎng)陰性病原體，現(xiàn)有的血培養(yǎng)技術(shù)尚不能對其進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)和鑒定。有研究結(jié)果顯示，在引起真正BCNE的病原體中，伯納特立克次體占28%～37%，巴爾通體占12%～28%，惠普爾滋養(yǎng)體占6%，且都與特定的危險(xiǎn)因素暴露或接觸史有關(guān)[20]。

1.3.1 伯納特立克次體 伯納特立克次體是引起Q熱的病原，該菌為細(xì)胞內(nèi)寄生，在真核細(xì)胞中復(fù)制，體外細(xì)胞培養(yǎng)中的倍增時(shí)間為20～45 h[21-22]。伯納特立克次體感染范圍廣泛，從節(jié)肢動(dòng)物到人類均可感染。家養(yǎng)反芻動(dòng)物是其主要宿主，也是人類暴發(fā)疫情的主要傳染源。人類最常見的感染原因是吸入了感染動(dòng)物在分娩或流產(chǎn)后產(chǎn)生的細(xì)菌氣溶膠，直接接觸受感染動(dòng)物的胎盤、流產(chǎn)物和皮毛、糞便等也可能被感染。值得注意的是，因?yàn)樵摼茉谕寥乐写婊詈荛L一段時(shí)間，且氣溶膠至少可以被風(fēng)輸送30 km，可造成遠(yuǎn)離主要受污染地區(qū)的Q熱，所以也可以造成近期沒有動(dòng)物接觸史的人感染[21]。伯納特立克次體在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)技術(shù)下不能生長，當(dāng)出現(xiàn)提示Q熱癥狀時(shí)，血清學(xué)檢測是一線診斷方法，主要檢測方法有間接免疫熒光試驗(yàn)、補(bǔ)體固定試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)[21-22]。目前，基于PCR的檢測方法也已被應(yīng)用于臨床樣本中伯納特立克次體的檢測。

1.3.2 巴爾通體 巴爾通體是一種細(xì)小的細(xì)胞內(nèi)革蘭陰性細(xì)菌，在免疫功能良好或免疫功能低下的宿主中均可引起感染[22]。該菌侵入紅細(xì)胞可以逃避免疫反應(yīng)，在宿主紅細(xì)胞內(nèi)持續(xù)存活導(dǎo)致菌血癥，是巴爾通體感染的特征之一。有研究結(jié)果顯示，這種菌血癥往往是低水平的，可持續(xù)數(shù)月，甚至數(shù)年，沒有或只有亞臨床癥狀，最終可發(fā)展為IE，但這一結(jié)論尚未得到流行病學(xué)或?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)的驗(yàn)證[4]。漢塞巴爾通體（Bartonella henselae）通常感染家貓和野貓，通過貓抓、咬或貓?jiān)閭鞑ソo人類，在感染HIV的患者中常會(huì)引起貓抓病、細(xì)菌性血管瘤和肝脂肪瘤。金氏巴爾通體（Bartonella quintana）則通過人虱傳播，引起戰(zhàn)壕熱、發(fā)熱性淋巴結(jié)病和細(xì)菌性血管瘤。金氏巴爾通體和漢塞巴爾通體是巴爾通體引起IE的2個(gè)常見菌種[4，22]。

巴爾通體感染的血培養(yǎng)結(jié)果通常為陰性，需要結(jié)合血清學(xué)、PCR、DNA測序和切除的心臟瓣膜組織的病理學(xué)檢查進(jìn)行診斷。瓣膜組織巴爾通體DNA的PCR擴(kuò)增對于巴爾通體心內(nèi)膜炎診斷具有重要意義，有較高的敏感性和特異性；PCR檢測也可以采用全血、血漿或血清樣本進(jìn)行，敏感性為58%，特異性為100%[4]。

1.3.3 惠普爾滋養(yǎng)體 惠普爾滋養(yǎng)體感染可引起一種不常見的慢性全身性疾病——惠普爾?。╓hipple's disease），其早期表現(xiàn)為多關(guān)節(jié)炎、體質(zhì)量減輕、貧血，隨后是腹痛、腹瀉和惡病質(zhì)，體格檢查常發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)病變和色素沉著?；萜諣栕甜B(yǎng)體感染可導(dǎo)致BCNE，多見于男性患者；因惠普爾滋養(yǎng)體種系與土壤細(xì)菌相近，有學(xué)者懷疑人類經(jīng)口腔途徑感染惠普爾滋養(yǎng)體[23-24]。有研究結(jié)果顯示，健康人的胃液、唾液以及污水樣本中均可檢測到此菌的DNA[24]。因此，惠普爾滋養(yǎng)體可能存在于相當(dāng)一部分人群中，但不會(huì)導(dǎo)致其患病，其PCR檢測結(jié)果需與臨床癥狀和當(dāng)?shù)亓餍胁W(xué)資料相結(jié)合來解釋[24]。

2 血流感染的實(shí)驗(yàn)室檢測進(jìn)展

傳統(tǒng)的血培養(yǎng)是將采集的血液樣本注入血培養(yǎng)瓶內(nèi)，通過自動(dòng)血培養(yǎng)儀進(jìn)行增菌培養(yǎng)，當(dāng)儀器監(jiān)測到培養(yǎng)瓶內(nèi)有微生物生長時(shí)，會(huì)發(fā)出報(bào)警提示，大部分陽性樣本會(huì)在3 d內(nèi)報(bào)陽，實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員將報(bào)陽樣本涂片行革蘭染色鏡檢，將鏡檢結(jié)果作為危急值報(bào)告給臨床醫(yī)生，同時(shí)轉(zhuǎn)種固體培養(yǎng)平板，大概需要24 h生長出純的單克隆菌落，以區(qū)分單一感染和混合感染，然后進(jìn)行常規(guī)生化鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)，10～18 h獲得最終鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果。所以，從采集血培養(yǎng)樣本到發(fā)出報(bào)告，往往需要3～5 d時(shí)間。

為了縮短樣本周轉(zhuǎn)時(shí)間，盡早得到鑒定和體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室一般會(huì)通過富集陽性血培養(yǎng)瓶中的病原體，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）和熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）進(jìn)行細(xì)菌鑒定。MALDI-TOF MS用于病原菌鑒定在我國各級醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室已廣泛開發(fā)，但對混合感染的鑒定仍存在困難[25]。PNA-FISH通過模擬DNA探針與病原內(nèi)的16S rRNA序列和酵母菌內(nèi)的18S rRNA序列進(jìn)行快速、特異的雜交，用于鑒定最常見的革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和念珠菌。因可用的PNA-FISH探針數(shù)量有限，且富集的菌量至少為105CFU/mL，限制了其臨床使用[26]。Accelerate Pheno系統(tǒng)使用自動(dòng)樣品制備和細(xì)菌固定化方法，以顯微鏡鏡檢為基礎(chǔ)，利用FISH探針進(jìn)行單細(xì)胞分析來進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)，已經(jīng)通過美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證，并在歐美等國家應(yīng)用[27]。

上述新技術(shù)的使用縮短了樣本周轉(zhuǎn)時(shí)間，在一定程度上提高了血培養(yǎng)的臨床應(yīng)用價(jià)值，但前提必須是血培養(yǎng)陽性。對于血培養(yǎng)陰性的樣本，目前只能依賴血清學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢測。

2.1 血清學(xué)檢測

血清抗體檢測是診斷感染的經(jīng)典方法，急性期和恢復(fù)期血清抗體滴度呈4倍及以上上升是診斷感染的金標(biāo)準(zhǔn)[16]。在血培養(yǎng)結(jié)果呈陰性的情況下，血清學(xué)抗體檢測是感染診斷的有效補(bǔ)充。2項(xiàng)評估BCNE血清學(xué)檢測的研究結(jié)果顯示，1 093例患者中有624例可通過血清學(xué)檢測診斷[20]。有研究結(jié)果顯示，當(dāng)存在危險(xiǎn)因素（生活在流行地區(qū)、職業(yè)接觸、食用未經(jīng)巴氏殺菌的乳制品）暴露時(shí)，可增加布魯菌病血清學(xué)檢測[10]，但不建議對軍團(tuán)菌、支原體和衣原體常規(guī)進(jìn)行血清學(xué)檢測[20]。

人感染伯納特立克次體時(shí)，免疫反應(yīng)會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Ⅰ相抗體和Ⅱ相抗體。Ⅱ相抗體可在臨床癥狀出現(xiàn)后7～15 d被檢測到，在3～6個(gè)月內(nèi)下降，檢測間隔3～6周采集的2份血清樣本的Ⅱ相抗體滴度IgG或IgM增長4倍以上可診斷為原發(fā)性感染，Ⅱ相抗體滴度IgG≥200和/或IgM≥50對原發(fā)性感染亦有重要的診斷價(jià)值。Ⅰ相抗體滴度IgG≥800則與慢性Q熱有關(guān)，且與伯納特立克次體IE陽性預(yù)測值高度相關(guān)[21]。然而，1項(xiàng)比較了來自英國、法國和澳大利亞的3個(gè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)Q熱病例血清學(xué)檢測結(jié)果的研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)對結(jié)果判讀的一致性只有35%[21]。這反映了血清學(xué)雖然是伯納特立克次體病原體的首要診斷技術(shù)，但因其解釋的主觀性，尚無法形成統(tǒng)一的判定標(biāo)準(zhǔn)。

巴爾通體也可通過血清學(xué)方法診斷，抗體滴度>800提示與IE相關(guān)，陽性預(yù)測值為95%，但抗體滴度<800并不能排除心內(nèi)膜炎[16]。值得注意的是，衣原體和巴爾通體存在交叉反應(yīng)，當(dāng)血清學(xué)診斷懷疑衣原體感染時(shí)，應(yīng)重新評估以排除巴爾通體感染[10，16]。

2.2 病原16S rRNA檢測

鑒于病原體培養(yǎng)成本高、產(chǎn)量低和周轉(zhuǎn)慢的特點(diǎn)，全血樣本核酸擴(kuò)增成為血培養(yǎng)方法的有益補(bǔ)充，可以檢測血培養(yǎng)遺漏的微生物，并縮短病原鑒定的時(shí)間，有較大的臨床價(jià)值。然而由于其高敏感性和可能存在的污染風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)謹(jǐn)慎解釋陽性結(jié)果，且檢測結(jié)果需與臨床診斷相符[28-29]。

病原16S rRNA檢測可作為臨床懷疑血流感染，但血培養(yǎng)陰性患者的補(bǔ)充檢查。有學(xué)者利用16S rRNA檢測101例重癥患者血液樣本，檢出了血培養(yǎng)遺漏的至少6個(gè)陽性結(jié)果，比使用常規(guī)血培養(yǎng)更為敏感[30]。由于采用的是16S rRNA通用擴(kuò)增引物，病原體不能被鑒定到種，須使用特定細(xì)菌的特異性引物來進(jìn)一步鑒定可疑的病原微生物[20]。有研究用質(zhì)譜技術(shù)測定每個(gè)PCR擴(kuò)增片段的質(zhì)量，計(jì)算核苷酸堿基組成，并與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，實(shí)現(xiàn)了病原菌的鑒定，這種廣譜PCR和電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜（electrospray ionization tandem mass spectrometry，ESI-MS）相結(jié)合的方法可以完成病原微生物的鑒定[31]。1項(xiàng)回顧性研究結(jié)果顯示，PCR/ESI-MS與血培養(yǎng)結(jié)果的符合率為85.7%[32]。

2.3 實(shí)時(shí)PCR

實(shí)時(shí)PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記探針，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)檢測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量的方法。有研究結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)PCR使BCNE患者血液中病原體的診斷效率提高了24.3%，新檢出的病原體主要包括腸球菌、鏈球菌、人型支原體和惠普爾滋養(yǎng)體[28]。

以IS1111為靶點(diǎn)的特異性實(shí)時(shí)熒光PCR被認(rèn)為是臨床樣本中伯納特立克次體最敏感的檢測方法，可在感染伯納特立克次體2周內(nèi)、血清抗體尚未呈陽性時(shí)檢出患者血液中的伯納特立克次體。另外，采用凍干法濃縮從臨床樣本中提取的DNA，能夠進(jìn)一步提高該檢測方法的敏感性，在原發(fā)性Q熱患者中，凍干法處理可使實(shí)時(shí)熒光PCR對血清學(xué)檢測陰性樣本的敏感性提高44%，對早期血清學(xué)檢測陽性樣本的敏感性提高30%[21]。

2.4 多重PCR

多重PCR又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，是在同一PCR反應(yīng)體系加入2對以上的引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR技術(shù)。

FilmArray系統(tǒng)采用巢式多重PCR技術(shù)，集樣品制備、擴(kuò)增、檢測和分析于一體。可檢測血流感染相關(guān)的24種病原體靶標(biāo)和3種抗菌藥物耐藥基因，雖然目前大部分相關(guān)研究集中在對于血培養(yǎng)瓶報(bào)陽后的檢測，但對血培養(yǎng)陰性的樣本，仍有一定的實(shí)用價(jià)值[33]。由于巢式PCR的高靈敏性，不能排除環(huán)境或血液樣本中存在病原體核酸而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。曾經(jīng)出現(xiàn)的腸球菌和銅綠假單胞菌假陽性結(jié)果，以及目前依舊存在的變形桿菌假陽性問題，均提示巢式PCR擴(kuò)增陽性血培養(yǎng)液核酸靶標(biāo)的局限性[34]。美國食品藥品監(jiān)督管理局于2017年批準(zhǔn)了相對較新的革蘭陽性球菌iCubate系統(tǒng)（IC-GPC），該系統(tǒng)是基于熒光信號檢測的多重PCR和微陣列雜交，除肺炎鏈球菌外，所有目標(biāo)菌鑒定和耐藥基因檢測的敏感性和特異性均>95%[34]。

2.5 NGS

基于PCR的檢測方法通常需要一定程度的先驗(yàn)信息，但這些信息并不總是存在。對于未知樣本或新的病原體，無偏移的DNA測序顯然更高效。傳統(tǒng)的測序方法不適用于混合物的分析，且成本高、耗時(shí)長，而NGS不僅能以高靈敏度和高通量對異質(zhì)混合的遺傳物質(zhì)進(jìn)行測序，還能同時(shí)獲取藥物敏感性信息，為在沒有任何先驗(yàn)信息情況下進(jìn)行全面的病原體檢測帶來了希望。然而全血樣本中病原體DNA的含量通常較低，宿主DNA與病原體DNA的比值常高達(dá)108∶1，因此將NGS直接應(yīng)用于全血樣本的病原體檢測仍具有挑戰(zhàn)性。近期有研究報(bào)道了快速消耗全血樣本中的人類DNA，并使細(xì)菌DNA富集的方法，使菌血癥的快速診斷成為可能[35]。

3 總結(jié)與展望

機(jī)體屏障功能的完整性受到破壞和機(jī)體免疫力下降均是導(dǎo)致血流感染發(fā)生的危險(xiǎn)因素，血流感染引起的膿毒癥是住院患者死亡的主要原因之一。通過持續(xù)監(jiān)測患者的臨床癥狀、生命體征、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白水平和降鈣素原水平等，可初步判斷是否發(fā)生血流感染。但進(jìn)行血培養(yǎng)獲得病原體信息依舊是診斷細(xì)菌性血流感染最重要的證據(jù)，也可以為臨床抗感染治療提供藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果。

目前，在診斷血流感染以及進(jìn)行后續(xù)抗感染治療過程中依舊存在諸多問題。（1）感染的診斷是否成立。由于手術(shù)、藥物、腫瘤以及自身免疫性疾病都會(huì)引發(fā)與血流感染類似的癥狀和體征，所以獲得明確的病原體信息顯得尤為重要，但能夠明確病原體并不是一件容易的事情，目前進(jìn)行的常規(guī)血培養(yǎng)陽性率不足20%，所以很多學(xué)者在探索如何進(jìn)一步提高陽性病原的檢出率。（2）提供靶向抗感染治療信息的及時(shí)性。早期、足量的靶向抗感染治療不僅能改善患者預(yù)后，降低病死率，也可以減少患者住院時(shí)間和醫(yī)療成本。但進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)必須采用活的病原體，而病原體的生長需要一定的周期，所以很多學(xué)者在探索如何富集足量的細(xì)菌來進(jìn)行早期的體外藥物敏感試驗(yàn)，以提示臨床進(jìn)行早期的干預(yù)治療[25]。（3）由于血流感染的診斷和治療涉及到機(jī)體、病原和抗感染藥物使用等方面，且目前采用的診斷技術(shù)或多或少存在一定的局限性，有必要進(jìn)行不斷的探索和優(yōu)化，包括質(zhì)譜技術(shù)、NGS的應(yīng)用指征及結(jié)果解釋。

除上述主流技術(shù)外，基于快速聲學(xué)分離和富集的微芯片PCR檢測系統(tǒng)[36]、基于無標(biāo)記抗體微陣列的離子共振成像系統(tǒng)[37]、基于大小識別而無標(biāo)記的彈性慣性微流控技術(shù)[38]，以及T2磁共振技術(shù)等[34]快速檢測血液中病原微生物的新技術(shù)給血流感染的快速病原學(xué)診斷帶來了新的希望。T2磁共振技術(shù)是將病原體特異性DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物與探針修飾的超順磁性納米顆粒雜交，雜交后會(huì)使納米顆粒聚集，通過T2MR誘導(dǎo)檢測信號的變化來檢測目的片段。為提高血流感染的診斷效率，在致力于開發(fā)、優(yōu)化更為有效的技術(shù)的同時(shí)，也需進(jìn)一步對感染的發(fā)生、發(fā)展，以及體內(nèi)播散機(jī)制進(jìn)行研究與探索。