循環(huán)微小RNA可作為ARDS生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

邱小宇 王曉芝 黃瀟

急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是以進(jìn)行性呼吸困難和頑固性低氧血癥為臨床特點(diǎn)的急性呼吸衰竭綜合征，發(fā)生在嚴(yán)重感染、休克、外傷、燒傷等疾病過程中，是急性肺損傷(ALI)的一種嚴(yán)重形式，在世界范圍內(nèi)引起了大量的發(fā)病率和死亡率,最近的一項(xiàng)系統(tǒng)回顧表明，急性呼吸窘迫綜合征的死亡率在36～44%之間[1-2]。近年發(fā)現(xiàn)，微小RNAs作為一種新的基因調(diào)控分子，在包括ALI在內(nèi)的多種復(fù)雜疾病中發(fā)揮著重要作用[3]，且越來越多的證據(jù)表明，miRNAs與ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。本文通過總結(jié)國內(nèi)外的相關(guān)研究，闡述miRNAs作為ARDS生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展，也對miRNAs在ARDS中的作用機(jī)制作進(jìn)一步探究與展望。

ARDS

一、ARDS的病理生理過程

急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是指由多種肺內(nèi)或肺外因素引起的，以進(jìn)行性呼吸困難和頑固性低氧血癥為臨床特點(diǎn)的急性彌漫性肺損傷，因高病死率而備受關(guān)注。作為嚴(yán)重的急性肺損傷，其發(fā)病進(jìn)程常伴隨高水平促炎因子的釋放，造成中性粒細(xì)胞大量涌入，破壞肺泡-毛細(xì)血管屏障，增加肺血管通透性，導(dǎo)致彌漫性肺泡損傷、肺泡表面活性物質(zhì)功能障礙及肺水腫[4]，進(jìn)而導(dǎo)致呼吸衰竭。ARDS的病理生理過程可分為三個(gè)階段：滲出期，增生期，在沒有恢復(fù)的情況下，一些患者可能會(huì)由前兩期發(fā)展為纖維化期，正常內(nèi)皮-上皮屏障功能障礙在上述進(jìn)程進(jìn)程中有其重要作用。

二、ARDS早期診斷

雖然目前針對ARDS的治療已經(jīng)取得重大研究進(jìn)展，但早期診斷的困難和復(fù)雜的疾病進(jìn)程，使ARDS患者的死亡率仍高達(dá)40%左右[5]，且許多幸存患者患有呼吸困難等并發(fā)癥[6-7]。早期識別診斷ARDS，預(yù)測ARDS的預(yù)后，有助于確定新的治療和干預(yù)目標(biāo)，是提高患者生存率，改善生存狀況的關(guān)鍵。因此，尋找早期診斷及與預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物，顯得尤為重要。

理想的生物標(biāo)志物應(yīng)表明與疾病病理生理事件存在明確關(guān)系，需要具備可靠性、可重復(fù)性、疾病特異性和敏感性的特點(diǎn)，并且需要取樣簡單、相對便宜、濃度幾乎沒有晝夜變化等優(yōu)點(diǎn)[8]。針對ARDS生物標(biāo)志物的檢測，主要來源于患者呼出的呼氣冷凝液、尿液、血液或血漿(血清)、支氣管肺泡灌洗液(BALF)或氣管抽吸物，單個(gè)標(biāo)記物水平的增加或降低可能表明特定類型的細(xì)胞損傷或激活。

目前已發(fā)現(xiàn)與ARDS疾病進(jìn)程相關(guān)的生物標(biāo)志物有可溶性糖基化終產(chǎn)物受體(sRAGE)、特異性表面活性蛋白(SP)、膜糖蛋白KL6、血管性血友病因子(vWf)、可溶性細(xì)胞間粘附分子-1(sICAM-1)、E-選擇素(CD62E)、血管生成素1(Ang-1)和血管生成素2(Ang-2)、高遷移率族盒核蛋白(HMGB)、脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)、尿激酶抑制劑纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)、角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(KGF)和肝細(xì)胞生長因子(HGF)，以及相關(guān)炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素8(IL-8)、白細(xì)胞介素10(IL-10)等。近年研究發(fā)現(xiàn)，微小RNAs(miRNAs)可以穩(wěn)定存在于人外周循環(huán)中，且在不同疾病狀態(tài)下呈現(xiàn)差異表達(dá)[8]，部分miRNAs可用于ARDS的嚴(yán)重程度或預(yù)后的判斷。

MicroRNAs特性

MicroRNAs(miRNAs)是一種非編碼短鏈RNA分子，長度約為19到25個(gè)核苷酸[9]，在真核生物中廣泛存在。成熟MiRNAs通過與信使核糖核酸(mRNA)特異結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)，在調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞周期、生物體發(fā)育時(shí)序等方面起重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在包括心血管疾病、腎臟疾病、糖尿病和腫瘤在內(nèi)的多種人類疾病中顯示出調(diào)節(jié)潛力。在肺部疾病方面，已有研究表明miRNAs同哮喘、炎癥、纖維化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、ARDS等疾病相關(guān)[10]。作為外泌體的一員，miRNAs可在人血清或血漿中穩(wěn)定表達(dá)，且在不同貯藏條件下具有穩(wěn)定性[11]，在存在有害刺激的情況下，血液中miRNAs的組成可以改變，使它們成為生物標(biāo)志物的絕佳候選物。MiRNAs可以從細(xì)胞、組織和體液中分離出來，如血清、血漿、眼淚或尿液[12]，檢測miRNAs的傳統(tǒng)方法包括northern印跡法、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(QRT-PCR)、微陣列法等[13]。在ARDS/ALI患者中，某些miRNA表達(dá)發(fā)生了變化，這些變化的miRNAs通過靶向特異性分子，減少過度免疫反應(yīng)，抑制細(xì)胞損傷并加速疾病的恢復(fù)[14]。因此，miRNA被提出作為ARDS/ALI的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

MicroRNAs作為ARDS早期診斷和預(yù)后及相關(guān)機(jī)制的研究

現(xiàn)將目前已證實(shí)的與ARDS診斷及預(yù)后相關(guān)的部分miRNAs及其潛在的調(diào)控機(jī)制總結(jié)如下。

一、MicroRNAs在ARDS早期診斷和預(yù)后中的價(jià)值

已有臨床研究發(fā)現(xiàn)，在ARDS進(jìn)程中，一些miRNAs表達(dá)異常，并通過調(diào)控mRNA轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，參與整個(gè)發(fā)病過程。

在Gennaro Martucci等人報(bào)道[15]的一項(xiàng)臨床研究中，將754例ARDS患者根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度(SAPSⅡ、SOFA評分、RESP評分)分為兩組：高嚴(yán)重程度組(A組)和低嚴(yán)重程度組(B組)，用高通量定量聚合酶鏈反應(yīng)篩選出13種miRNA。特別是，高嚴(yán)重程度(A組)的ARDS患者與低嚴(yán)重程度(B組)的ARDS患者相比，miR-93，-99a，-92a，-212，-20a，-19b，-18a，-17，-126，-19a和let-7a顯著上調(diào)。這表明，一些miRNAs可用ARDS嚴(yán)重程度的判斷。

由于膿毒癥引起的ALI/ARDS，是膿毒癥嚴(yán)重時(shí)所致多器官功能障礙的肺部表現(xiàn)，與膿毒癥的進(jìn)展休戚相關(guān)。Andrew J. G.等[16]在臨床研究中，檢測出了嚴(yán)重膿毒癥患者血漿中(入院24小時(shí)內(nèi))miRNAs的表達(dá)水平，并評估了差異表達(dá)的miRNAs與休克和器官衰竭發(fā)展之間的關(guān)系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血漿miR-15a、-27a和-34a表達(dá)水平的改變與嚴(yán)重膿毒癥患者休克的發(fā)展相關(guān)，其中miR-15a是區(qū)分膿毒癥患者有無休克的最具預(yù)測性的單一miRNA，AUC(Area Under Curve，ROC曲線下與坐標(biāo)軸圍成的面積)為0.7(95%可信區(qū)間為 0.57～0.84)[16]。因此，檢測膿毒癥患者血漿中miR-15a、-27a和-34a的表達(dá)水平，對于ARDS的早期診斷以及判斷ARDS的嚴(yán)重程度有重要意義。

為評估m(xù)iRNAs對ARDS/ALI預(yù)后的影響，HanYan等人[17]進(jìn)行了一項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)納入了244例由膿毒癥導(dǎo)致ALI的患者(44例嚴(yán)重膿毒癥、102例膿毒癥)和19例健康志愿者。嚴(yán)重膿毒癥誘導(dǎo)的ALI或ARDS患者的APACHE Ⅱ評分、30天死亡率和無創(chuàng)呼吸機(jī)天數(shù)均顯著高于膿毒癥患者。QRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥誘導(dǎo)的ALI患者血漿中miR-155和miR-146a相對濃度顯著升高。隨后，對26例miR-155和miR-146a顯著升高的患者進(jìn)行隨訪，其中18例(69.2%)和16例(61.5%)患者的miR-155和miR-146a的值分別有顯著降低，提示這兩個(gè)標(biāo)記物的峰值出現(xiàn)在ALI最嚴(yán)重的時(shí)期。通過ROC曲線來評估m(xù)iR155和miR-146a的表達(dá)值，以預(yù)測30天死亡率。結(jié)果表明miR-155和miR-146a預(yù)測膿毒癥患者30天死亡率的AUC分別為0.782和0.733，略低于APACHE Ⅱ評分的0.835 (P<0.05)[17]。以上研究結(jié)果表明，miR-155和miR-146a可能作為嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

二、miRNAs參與ARDS進(jìn)程相關(guān)機(jī)制的研究

ARDS的發(fā)展有幾個(gè)重要的病理生理過程，包括炎癥、免疫調(diào)節(jié)失調(diào)和肺內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞通透性增加[18]。miRNAs作為ARDS潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn),從以下幾個(gè)方面參與ARDS進(jìn)程。

1 ARDS肺內(nèi)屏障破壞與miRNAs：ARDS肺內(nèi)屏障(包括內(nèi)皮屏障和上皮屏障)的功能障礙，引發(fā)肺水腫和進(jìn)一步呼吸衰竭的發(fā)生。這主要是由血管內(nèi)皮多糖包被(GXG)和緊密連接(TJ)蛋白破壞引起的[19]。血管內(nèi)皮多糖包被(GXG)是覆蓋在血管內(nèi)皮表面帶負(fù)電荷的一層多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，是內(nèi)皮細(xì)胞的第一道屏障，通過尺寸選擇性、空間位阻和靜電斥力保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，在維持血管內(nèi)皮通透性方面起著重要作用[20-21]。緊密連接(TJ)是由多個(gè)鏈接復(fù)合體形成的防止?jié)B透的屏障，TJ蛋白由跨膜蛋白如封閉蛋白、連接粘附分子和細(xì)胞質(zhì)蛋白如小帶封閉蛋白(ZO)-1、ZO-2和ZO-3組成，是上皮屏障功能最關(guān)鍵的決定因素[22]。因此GXG和TJ蛋白的損傷是導(dǎo)致血管內(nèi)皮和肺泡上皮通透性增加的重要因素[23]。已有研究發(fā)現(xiàn)某些miRNAs與GXG、TJ蛋白具有相關(guān)性。

MiR-143最早被發(fā)現(xiàn)于對脂肪細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用，其水平在分化的脂肪細(xì)胞中增加，抑制其水平有效抑制脂肪細(xì)胞分化[23]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)它的表達(dá)失調(diào)參與了結(jié)腸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、骨腫瘤、膿毒癥多種疾病的病理生理過程。

Boris Schmitz等研究者[24]以健康青年為研究對象，探討了高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練(HⅡT)對微血管參數(shù)(包括GXG厚度和相關(guān)miRNAs)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最大運(yùn)動(dòng)能力與微血管GXG厚度呈正相關(guān)，而miR-143水平的急性升高可預(yù)測GXG厚度增加。進(jìn)一步對miR-143進(jìn)行相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)其作為一種內(nèi)皮剪切應(yīng)力依賴性miRNAs，能夠誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生剪切應(yīng)力，miR-143感受到剪切應(yīng)力的刺激釋放入血，進(jìn)而通過調(diào)節(jié)GXG相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)而來影響GXG厚度。因此，檢測血miR-143水平可判斷ARDS患者血管內(nèi)皮損傷的嚴(yán)重程度，可用于指導(dǎo)ARDS患者的治療及預(yù)后判斷。

MiR-126基因定位于表皮生長因子結(jié)構(gòu)域7(EGFL7)基因7號內(nèi)含子[25]，是一類具有細(xì)胞類型特異性的miRNA[26]，對于造血系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及胚胎組織都有一定特異性，但對于心血管系統(tǒng)特異性最高[27]。

ZhouYue等[28]通過氣管內(nèi)注射脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MiR-126對于ARDS的作用機(jī)制是通過內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)外顯體轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細(xì)胞，減少與ARDS發(fā)生相關(guān)的基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。外顯體通過促進(jìn)miRNAs從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，成為細(xì)胞間通訊的重要旁分泌機(jī)制[29],進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，氣管內(nèi)給予EPC外顯體可減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷[30]。另一項(xiàng)研究對EPCs進(jìn)行miR-126基因敲除修飾后，發(fā)現(xiàn)EPCs外顯體功能明顯減弱[31]；此外，MiRNA-126-3p和MiRNA-126-5p可顯著提高緊密連接蛋白的表達(dá)水平，阻止ARDS/ALI相關(guān)的上皮緊密連接的丟失，減少上皮屏障功能的破壞[27，32-34]，內(nèi)皮祖細(xì)胞外泌體傳遞miR-126可提高緊密連接蛋白的表達(dá)水平，并維持肺泡上皮屏障的完整性[35]。這些研究表明，miRNA-126減輕LPS所致肺損傷是通過維護(hù)肺內(nèi)屏障來實(shí)現(xiàn)。

2 ARDS炎癥反應(yīng)與miRNAs：ARDS進(jìn)程中伴隨高水平促炎因子的釋放，形成瀑布式級聯(lián)反應(yīng)，炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)大量中性粒細(xì)胞涌入肺泡腔，引起彌漫性肺損傷。盡管ARDS發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但就目前的研究表明，炎癥反應(yīng)是ARDS本質(zhì)，貫穿ARDS的整個(gè)發(fā)病過程[36]。

MiR-199a是一種新的基因調(diào)控因子，在炎癥和肺損傷中具有重要作用[30]，通過調(diào)節(jié)促炎因子的釋放，參與炎癥性肺疾病的發(fā)展[36-37]。在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠ALI模型以及LPS處理的人上皮細(xì)胞株A549和人巨噬細(xì)胞細(xì)胞系U937中，miR-199a均發(fā)生了顯著下調(diào)，其下調(diào)對LPS誘導(dǎo)的ARDS有促炎作用[38-39]。ChenZhi等人[39]收集了ALI患者的肺組織，通過微陣列分析測量異常表達(dá)RNA譜，鑒定出106個(gè)差異表達(dá)的mrna，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p在ALI患者肺組織中的表達(dá)水平顯著下調(diào)。因此，miR-199a可作為ARDS檢測的生物標(biāo)志物，其誘導(dǎo)ARDS肺損傷的機(jī)制可能是miR-199a水平降低，減少了對下游與促進(jìn)炎癥產(chǎn)生的相關(guān)靶點(diǎn)的抑制。

MiR-23參與到了細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)階段，包括細(xì)胞的增值、凋亡和變異等。分為兩種亞型：MiR-23a和MiR-23b，其中miR-23a與腫瘤、骨骼肌細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)、心臟病變等均有密切關(guān)聯(lián)。在急性炎癥反應(yīng)條件下，巨噬細(xì)胞通過抑制miR23a的表達(dá)，降低IL-6的表達(dá)和分泌，從而防止巨噬細(xì)胞的過度活化，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫功能，減輕機(jī)體的免疫損傷[40]。對小鼠的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖可激活巨噬細(xì)胞中核因子κB通路，并引起miR-23a的表達(dá)下調(diào)[41]。Cai等[38]通過外源性添加miR-23a類似物到LPS誘導(dǎo)的小鼠和細(xì)胞炎癥模型中，結(jié)果示轉(zhuǎn)染miR-23a組的細(xì)胞凋亡率與未轉(zhuǎn)染miR-23a的LPS模型組相比顯著降低(P<0.05)，因此發(fā)現(xiàn)miRNA-23a的過度表達(dá)有改善膿毒癥所致肺損傷的作用，隨著miRNA-23a的過度表達(dá)，肺細(xì)胞凋亡和損傷在體內(nèi)被下調(diào)，這一作用可通過抑制PTEN表達(dá)和激活A(yù)KT磷酸化來實(shí)現(xiàn)。因此miR23a可作為預(yù)測ARDS肺損傷的生物標(biāo)記物，其在ARDS治療與預(yù)后方面的價(jià)值有待進(jìn)一步研究。

此外，在LPS等因素刺激的ARDS動(dòng)物模型及ARDS患者中，miR-214、miR-145、miR-127、miR-146a、miR-127、miR-320等miRNAs的表達(dá)上調(diào)，miR-127、miR-125b、miR-16、miR-335、miR-499等miRNAs的表達(dá)下調(diào)[41]。這些miRNAs通過正向或負(fù)向參與炎癥通路的調(diào)節(jié)來參與ARDS的炎癥反應(yīng)。

3 ARDS免疫反應(yīng)與miRNAs：miR-143除影響GXG完整性，也與小鼠肺部膿毒癥以及脂多糖(LPS)輸注后的人類白細(xì)胞敗血癥有關(guān)[42]。膿毒癥患者的T細(xì)胞呈免疫抑制特征，促炎性miR-150和miR-342下調(diào)，抗炎miR-15a、miR-16、miR-93、miR-143、miR-223和miR-424上調(diào)；M?hnle P等[43]初步研究確定：miR-143和miR-150可作為檢測T細(xì)胞免疫抑制的候選標(biāo)記物，從而有助于開發(fā)利用miRNAs作為膿毒癥期間免疫功能受損的生物標(biāo)志物的創(chuàng)新策略。

展 望

近年來，已有越來越多的研究表明miRNAs在ARDS中的廣泛作用，既可以作為生物標(biāo)志物，亦可以作為調(diào)節(jié)因子參與到ARDS的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后進(jìn)程中。我們對miRNAs在ARDS中作用的認(rèn)識仍在不斷增加，但miRNAs作為ARDS生物標(biāo)志物的上調(diào)或下調(diào)機(jī)制仍待闡明。另外，參與調(diào)節(jié)miRNAs表達(dá)的因子或途徑眾多，miRNAs具體通過哪些因子或途徑調(diào)控ARDS的病理生理進(jìn)程仍需探討。ARDS被認(rèn)為是一種具有多種病因的復(fù)雜綜合征，因此一個(gè)或幾個(gè)微小核糖核酸，可能不能為所有ARDS患者提供強(qiáng)信號。最后，目前的研究大多基于細(xì)胞或者動(dòng)物水平，如何應(yīng)用到臨床仍是我們亟待解決的問題。