外泌體非編碼RNA與心肌缺血再灌注損傷的研究進展

張業(yè)燊，何鵬程，譚寧，劉遠輝

作者單位：1 510000 廣州,廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 廣東省人民醫(yī)院 廣東省心血管病研究所心內(nèi)科

急性心肌梗死（AMI）是全球高發(fā)病率、高死亡率的主要疾病之一，心肌再灌注治療是AMI最重要的處理措施之一，包括溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）等，可最大限度挽救缺血心肌，縮小心肌梗死（心梗）范圍，降低心梗后的死亡率。然而，心肌缺血再灌注損傷（MIRI）可顯著增加AMI患者不良事件的發(fā)生。研究表明[1]，50%的心肌梗死面積是由缺血再灌注損傷導(dǎo)致。MIRI的發(fā)生涉及一系列的病理生理過程，包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、內(nèi)皮功能障礙、微血栓栓塞等[2]。截止目前，MIRI的發(fā)生機制尚不明確，尚無有效防治MIRI的方法。因此，探討MIRI的發(fā)病機制及其潛在的治療靶點具有重要意義。

外泌體是一種來源于細(xì)胞的細(xì)胞外囊泡，在細(xì)胞間信息交流、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面中扮演著重要作用。近年來，外泌體在疾病診斷、治療方面的作用已成為研究熱點，越來越多研究證明了外泌體在MIRI中的重要作用。本文就外泌體非編碼RNA在心肌缺血再灌注損傷中研究進展進行綜述，以期為臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供參考。

1 外泌體結(jié)構(gòu)、來源

外泌體是機體細(xì)胞分泌的一種有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)、電鏡下呈圓形或橢圓形的膜性囊泡，其粒徑介于30～100/150 nm之間[3]，廣泛存在于血液、腦脊液、心包積液等體液中。外泌體中富含核酸、蛋白、非編碼RNA等[4]，通過傳遞這些生物活性物質(zhì)進行細(xì)胞間的信息交流。外泌體的生成機制復(fù)雜，不同來源的外泌體具有相似的產(chǎn)生機制。目前普遍認(rèn)為，外泌體的產(chǎn)生過程包括細(xì)胞膜的內(nèi)陷和多囊泡胞內(nèi)體的形成。多囊泡胞內(nèi)體包含的腔內(nèi)小泡通過多囊泡胞內(nèi)體與細(xì)胞膜融合，腔內(nèi)小泡排出胞外并最終形成直徑為40～160 nm的外泌體[4]。外泌體攜帶的內(nèi)含物受細(xì)胞所處的局部微環(huán)境的調(diào)節(jié)[5]。此外，外泌體表面常表達一些表面蛋白（如CD9、CD63、CD81、Alix、Tsg101、熱休克蛋白等），常用作外泌體鑒定的標(biāo)記蛋白[6]。除了表達這些特征性表面蛋白外，不同細(xì)胞來源的外泌體還可表達特異性表面蛋白。如心肌細(xì)胞來源外泌體表達特定的標(biāo)記蛋白，如flotilin-1蛋白、caveolin 3蛋白、肌節(jié)蛋白和線粒體蛋白等；內(nèi)皮細(xì)胞來源外泌體含基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9等特異標(biāo)記蛋白[7]，這些表面標(biāo)記蛋白在細(xì)胞與細(xì)胞間的信息交流中發(fā)揮著重要作用。

2 外泌體在細(xì)胞信號交流的作用

20世紀(jì)80年代首次發(fā)現(xiàn)外泌體時被認(rèn)為是細(xì)胞的垃圾站，隨后的研究不斷證實外泌體廣泛參與多種疾病的過程（如腫瘤、心血管、代謝性疾病等）。眾多研究已經(jīng)證實，心肌細(xì)胞、血小板、脂肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞等都可分泌外泌體。目前外泌體功能研究主要集中在其攜帶的生物活性物質(zhì)上，尤其是miRNA、lncRNA、circRNA等，揭示了其在疾病發(fā)生發(fā)展過程中扮演的角色、細(xì)胞間信息傳遞等方面的作用[4]。在心臟中，心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞、血管上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等是外泌體的主要分泌細(xì)胞[8,9]，在心肌梗死患者和動物模型中，外周血中心肌細(xì)胞來源外泌體顯著增加[10]。大量研究證實，心臟組成細(xì)胞分泌的外泌體參與心臟疾病的病理過程，包括心肌損傷、心臟纖維化、炎癥反應(yīng)等[11-13]。此外，心臟組成細(xì)胞分泌的外泌體可運輸?shù)狡渌M織或器官，發(fā)揮信息傳遞作用；而其他組織器官分泌的外泌體也可運輸?shù)叫呐K組織，參與心臟疾病的病理過程。研究發(fā)現(xiàn)[14]，心肌梗死時心肌細(xì)胞釋放含有microRNA的外泌體至血液中，外泌體通過血液循環(huán)向骨髓傳遞microRNA以動員骨髓單核細(xì)胞，從而介導(dǎo)心臟修復(fù)。由此可知，外泌體在心臟疾病的病理生理過程中扮演著重要角色。

3 外泌體非編碼RNA在心肌缺血再灌注損傷中的作用

3.1 外泌體microRNA與心肌缺血再灌注損傷微小RNA（microRNA）是外泌體中含量最豐富，也是目前研究較多的一類外泌體非編碼RNA。MicroRNA是一種約24 nt的內(nèi)源性小非編碼RNA，其可通過結(jié)合靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（UTR）或開放閱讀框（ORF）區(qū)域介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，從而參與多種生理和病理過程[15]。在心臟中，多種心臟組成細(xì)胞（如心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）以及間充質(zhì)干細(xì)胞可以分泌攜帶microRNA的外泌體，參與心臟疾病的調(diào)控。MIRI是各種病理過程的綜合結(jié)果，其中炎癥反應(yīng)起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)[16]，心肌缺血再灌注時，間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體通過傳遞miR-182作用于巨噬細(xì)胞中Toll-like受體4（TLR4），使巨噬細(xì)胞向抗炎表型的M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而減輕缺血再灌注小鼠的梗死面積和炎癥反應(yīng)。而M2巨噬細(xì)胞又可分泌攜帶miRNA-148a的外泌體作用于心肌細(xì)胞，抑制硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）并激活TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路，減輕心肌細(xì)胞鈣超載以緩解MIRI[17]。Qiao等[18]研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞來源外泌體miR-24-3p可以抑制單核細(xì)胞募集以減輕MIRI。此外，Chen等[19]發(fā)現(xiàn)，心肌內(nèi)注射心臟祖細(xì)胞來源外泌體可以減輕心肌再灌注后的氧化應(yīng)激，其機制是通過外泌體傳遞保護性microRNA。

內(nèi)皮功能障礙是MIRI的另一重要機制，可引起的冠狀動脈（冠脈）微循環(huán)障礙以致擴大心肌梗死面積。因此，改善內(nèi)皮功能障礙、促進血管新生成為MIRI防治的又一重要措施。最近研究表明，生物工程修飾的心臟祖細(xì)胞來源外泌體富含促血管生成miR-322，心肌內(nèi)注射該外泌體可以通過調(diào)控Nox2-ROS信號軸促進血管再生，從而改善心肌損傷[20]。由此可知，心肌缺血再灌注時，各種細(xì)胞分泌的外泌體呈“網(wǎng)絡(luò)狀”調(diào)控，影響MIRI的各個病理過程。

目前，越來越多的動物治療性實驗證明外泌體在心肌梗死和MIRI的作用。Zhang等[21]對外泌體與心肌缺血再灌注損傷的動物治療性實驗進行薈萃分析，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體可以減小心肌缺血再灌注損傷后心肌梗死面積、改善心功能等。Yang等[22]薈萃分析也發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死動物模型中，干細(xì)胞來源外泌體可減小心肌梗死面積、改善心功能。臨床研究發(fā)現(xiàn)對患者肢體遠端進行缺血再灌注預(yù)處理可提高血清細(xì)胞外囊泡濃度，細(xì)胞外囊泡中表達具有心臟保護性外泌體microRNA，并可降低冠脈搭橋術(shù)后血清肌鈣蛋白I水平[23]。但目前尚無臨床研究證實外泌體microRNA可改善心肌缺血再灌注損傷，其臨床應(yīng)用有待進一步研究和臨床試驗。因此，包含具有保護功能microRNA的外泌體可能成為未來MIRI的一種新治療手段。

3.2 外泌體circRNA與心肌缺血再灌注損傷環(huán)狀RNA（circRNA）是一類由線性RNA前體在細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)過反向拼接形成的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)分子，因此不受RNA外切酶的影響，表達更穩(wěn)定。CircRNA最主要的功能之一就是作為microRNA“海綿”，在細(xì)胞質(zhì)中競爭性吸附microRNA而調(diào)控靶基因的表達[24]。此外，circRNA可直接在胞核中影響基因轉(zhuǎn)錄或與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，少數(shù)circRNA可作為模板翻譯成短肽[25]。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在外泌體中含量豐富并能穩(wěn)定存在，目前已有較多研究發(fā)現(xiàn)外泌體circRNA參與腫瘤的轉(zhuǎn)移、血管生成等過程。Shang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，直腸癌細(xì)胞來源外泌體可向直腸癌細(xì)胞傳遞circPACRGL，circPACRGL可以吸附miR-142-3p/miR-506-3p促進轉(zhuǎn)化生長因子β1的表達，從而促進腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等；進一步研究發(fā)現(xiàn)，circPACRGL可以通過miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1軸使腫瘤組織中中性粒細(xì)胞由N1向N2極化。中性粒細(xì)胞在MIRI炎癥反應(yīng)過程中扮演著重要角色，且N1型中性粒細(xì)胞具有促炎作用，而N2型中性粒細(xì)胞具有抗炎作用[27]。在心臟中，外泌體來源circRNA是否也能調(diào)控心肌缺血再灌注時中性粒細(xì)胞表型極化，還有待進一步研究。Ge等用小鼠缺血再灌注損傷后心臟組織來源細(xì)胞外囊泡進行RNA-seq發(fā)現(xiàn)[28]，有119個circRNA表達下調(diào)，66個circRNA表達上調(diào)，說明外泌體circRNA可能參與MIRI的病理過程。自2015年Li等[29]首次發(fā)現(xiàn)外泌體circRNA以來，目前有較多研究報道circRNA參與缺血再灌損傷過程（如circHIPK3、circPAN3、circDLPAG4/HECTD1等），而外泌體來源circRNA在MIRI中的作用尚鮮有報道。因此，后續(xù)研究中，應(yīng)更多關(guān)注外泌體circRNA在MIRI中的作用。

3.3 外泌體lncRNA與心肌缺血再灌注損傷長鏈非編碼RNA（lncRNA）也是外泌體中一類重要的生物活性物質(zhì)，其長度＞200 nt。眾多研究表明，lncRNA參與許多重要的病理生理過程，尤其是lncRNA可以包裹在外泌體中，由外泌體攜帶至靶細(xì)胞，從而發(fā)揮其功能[30]。內(nèi)皮細(xì)胞與心肌細(xì)胞間的交互作用，在MIRI中起著重要作用。中藥通心絡(luò)預(yù)處理心肌細(xì)胞來源外泌體高表達Linc-ROR，心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞攝入外泌體后Linc-ROR吸附miR-145-5p，進而激活eNOS通路，減少心肌缺血再灌注時心肌細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[31]。同樣Su等[32]發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞來源外泌體LINC00174可通過抑制P53介導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬和凋亡，從而減輕MIRI。此外，MIRI時重要的炎癥細(xì)胞—多形核細(xì)胞在鈣敏感受體（CaSR）刺激下分泌外泌體，其中的lncRNA ENSRNOT00000039868可調(diào)控AKT信號通路，減輕MIRI[33]。以上研究表明，外泌體lncRNA在缺血再灌注損傷過程中也起著一定的作用，但其在MIRI時各種心臟組成細(xì)胞間的通訊作用并未完全揭示，有待進一步研究和探索。

4 總結(jié)與展望

外泌體中攜帶的非編碼RNA在心血管疾病中扮演著重要角色，在心血管疾病的早期診斷、治療等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。深入研究外泌體中非編碼RNA在MIRI中的作用，有利于進一步揭示MIRI的發(fā)生發(fā)展機制，為MIRI的防治提供新的思路和方法。近年來，外泌體來源microRNA在MIRI中的研究如火如荼，但外泌體來源circRNA、lncRNA等在MIRI中的研究尚鮮有報道。因此，深入對這些非編碼RNA的研究將有助于進一步了解外泌體的生物功能和對MIRI的調(diào)控機制。此外，目前已有大量研究證實外泌體可通過傳遞這些非編碼RNA發(fā)揮抗心肌凋亡、促進血管新生、抑制炎癥反應(yīng)等作用，外泌體作為藥物載體的研究也越來越多，通過生物工程技術(shù)使外泌體攜帶有功能的microRNA、circRNA、lncRNA用于防治MIRI，將為MIRI的治療翻開新的篇章。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突