在線固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)太湖水體微囊藻毒素技術(shù)研究

姜 晟，郁建橋，鐘 聲，董南巡，許志波，沈 斐

1.江蘇省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，江蘇 南京 210036 2.江蘇省太湖野外水質(zhì)與藍(lán)藻綜合觀測(cè)站，江蘇 蘇州 215164 3.蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215009 4.無(wú)錫市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，江蘇 無(wú)錫 214023

太湖地處長(zhǎng)江中下游平原，水域面積約2 338 km2，是我國(guó)第三大淡水湖[1]。太湖富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題從20世紀(jì)80年代開(kāi)始加劇[2]，突出表現(xiàn)為藍(lán)藻水華頻發(fā)，水環(huán)境質(zhì)量變差。2007年一度導(dǎo)致無(wú)錫市飲用水危機(jī)，引起了國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注[3]。藍(lán)藻釋放的微囊藻毒素(MCs)具有肝臟毒性和神經(jīng)毒性[4]，對(duì)腎、腎上腺、肺、胃等器官也有不同程度的損害[5]。微囊藻毒素是具有生物活性的單環(huán)七肽化合物，含有2個(gè)可變的氨基酸基團(tuán)，組合形成多種異構(gòu)體，目前研究較多的為MC-LR、MC-RR、MC-YR 3種(L、R、Y分別代表亮氨酸、精氨酸、色氨酸)[6]。世界衛(wèi)生組織(WHO)和中國(guó)《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838—2002)、《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5749—2006)已經(jīng)明確規(guī)定了水中MC-LR的濃度限值[7-9]，同時(shí)將高效液相色譜法作為推薦的標(biāo)準(zhǔn)分析方法[10]。

近年來(lái)，隨著檢測(cè)儀器與分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，水體微囊藻毒素分析方法不斷推陳出新[11-13]，在線固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)逐步被用于環(huán)境監(jiān)測(cè)工作中，郭娟[14]、張春燕[15]、施儉[16]等先后研究并應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品、水源水、飲用水中的微囊藻毒素含量進(jìn)行了檢測(cè)分析，證明了該方法適用于水中痕量微囊藻毒素的連續(xù)、在線、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。與傳統(tǒng)分析方法相比[17]，在線固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用法的自動(dòng)化程度高、定性定量準(zhǔn)確、分析效率大幅提升，水樣的在線凈化、富集以及隨后的全自動(dòng)分析過(guò)程顯著降低了背景噪聲和人為操作對(duì)分析結(jié)果的影響，提高了方法檢出限和分析結(jié)果的可靠性與重現(xiàn)性，簡(jiǎn)化了水樣預(yù)處理的步驟流程。但由于儀器本身購(gòu)置和運(yùn)行成本較高，微囊藻毒素也并非現(xiàn)行地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基本項(xiàng)目，所以目前在國(guó)內(nèi)尚未得到廣泛應(yīng)用，針對(duì)自然水體中實(shí)際樣品開(kāi)展長(zhǎng)期連續(xù)檢測(cè)分析的研究報(bào)道則更為少見(jiàn)。江蘇省太湖野外水質(zhì)與藍(lán)藻綜合觀測(cè)站作為太湖流域水環(huán)境監(jiān)測(cè)站網(wǎng)的前沿樞紐，更加關(guān)注藍(lán)藻水華監(jiān)測(cè)技術(shù)發(fā)展動(dòng)向，于2016年首次使用在線固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)太湖水體微囊藻毒素含量進(jìn)行了為期一年的連續(xù)觀測(cè)和分析，將方法研究與業(yè)務(wù)應(yīng)用緊密結(jié)合，針對(duì)太湖實(shí)際水樣摸索建立了一套穩(wěn)定高效、準(zhǔn)確可行、相對(duì)先進(jìn)的地表水微囊藻毒素分析方法，并且開(kāi)展了長(zhǎng)時(shí)段、大規(guī)模的實(shí)際水樣檢測(cè)分析，取得了較為令人滿(mǎn)意的效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：在線固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜系統(tǒng)(UPLC H-Class Xevo TQD，美國(guó))。

濾膜：親水性聚丙烯濾膜(Acrodisc Syringe Filter 13 mm 0.2 μm GHP，美國(guó))。

試劑：甲醇(UPLC級(jí)，99.95%，中國(guó))，丙酮(GC級(jí)，≥97%，德國(guó))，正己烷(HPLC級(jí)，≥98%，德國(guó))，甲酸(色譜級(jí)，≥98%，中國(guó))，氨水(色譜級(jí)，≥25%，中國(guó))，乙腈(GC級(jí)，99.8%，德國(guó))，所有試劑使用時(shí)未經(jīng)其他操作。

標(biāo)準(zhǔn)樣品：微囊藻毒素-LR標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度95%，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，出廠日期為2015-10)，微囊藻毒素-RR標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度95%，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，出廠日期為2015-12)，微囊藻毒素-YR標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度≥95%，Enzo Life Sciences公司，美國(guó),出廠日期為2016-01)；標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：MC-LR、MC-RR、MC-YR均為2 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)使用液：使用時(shí)用超純水稀釋成濃度為0.01～50 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 樣品采集與預(yù)處理

2016年2—12月，開(kāi)展太湖水體微囊藻毒素觀測(cè)工作，在全湖共布設(shè)點(diǎn)位24個(gè)(圖1)，監(jiān)測(cè)頻次為每月1次，采樣深度為水面與水下0.5 m，采水器采集水樣后倒入500 mL棕色廣口瓶，密閉并置于船艙陰涼避光處妥善保存。返回實(shí)驗(yàn)室即進(jìn)行預(yù)處理，利用一次性針孔注射器配合親水性聚丙烯濾膜對(duì)水樣進(jìn)行過(guò)濾[12]，濾后樣品取15 mL于Waters專(zhuān)用進(jìn)樣小瓶中，單次分析進(jìn)樣量為5 mL。

圖1 太湖水體微囊藻毒素監(jiān)測(cè)點(diǎn)位分布Fig.1 Distribution monitoring points in Taihu Lake

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC ?BEH C18色譜柱(2.1×50 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：含0.5%甲酸的乙腈-甲醇混合溶液(體積比為90∶10)；柱溫：50 ℃；進(jìn)樣體積：5 mL。采用梯度洗脫，梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

電噴霧離子源正離子掃描(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，毛細(xì)孔電壓:3.5 kV，離子源溫度:150 ℃，去溶劑氣溫度：450 ℃，去溶劑氣(氮?dú)?流速：900 L/h，錐孔氣(氮?dú)?流速：50 L/h。其他質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表2，標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖2。

表2 3種MCs的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 MS/MS parameters of 3 MCs

圖2 3種MCs多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子流與總離子流色譜圖(3種物質(zhì)濃度為1 μg/L)Fig.2 Multiple reaction monitoring (MRM) chromatogram of 3 MCs and total ion chromatogram(T1C) (concentration of three substances:1 μg/L)

1.4 在線固相萃取條件

在線SPE柱：Waters Oass? HLB Direct connect HP 20 μm(2.1 mm×30 mm)；進(jìn)樣量5 mL；流動(dòng)相A：0.2%氨水溶液，流動(dòng)相B：0.5%甲酸水溶液，流動(dòng)相C：0.5%甲酸的乙腈-甲醇混合溶液(體積比為90∶10)，流動(dòng)相D：甲醇-正己烷-丙酮混合溶液(體積比為33∶33∶33)，梯度洗脫條件見(jiàn)表3。

表3 固相萃取洗脫條件Table 3 SPE elution conditions

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的驗(yàn)證

2.1.1 線性范圍和檢出限

配制MCs濃度分別為0.05、0.1、1、10、50 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)物的峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(μg/L)為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線，得到線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，各目標(biāo)化合物在線性濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)反射率擬合模型系。根據(jù)環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法檢出限[18]可知，該方法檢出限符合并優(yōu)于世界衛(wèi)生組織(WHO)和《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838—2002)的限值要求(1.0 μg/L)。方法檢出限計(jì)算公式如下：

MDL=S×t(n-1,0.99)

(1)

式中：MDL為方法檢出限，n為樣品的平行測(cè)定次數(shù)，S為n次測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，t為自由度為(n-1)、置信度為99%時(shí)的t分布的單邊臨界值;當(dāng)n=7時(shí)，t為3.143。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 3種MCs線性關(guān)系、相關(guān)性系數(shù)、線性范圍、檢出限Table 4 Linear regression equations, correlation coefficients and detection limits for 3 MCs

2.1.2 回收率和精密度

在湖水樣品中分別添加0.05、1、20 μg/L 3種不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述方法進(jìn)行前處理，每個(gè)水樣平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率、精密度，結(jié)果見(jiàn)表5。可見(jiàn)，低、中、高3個(gè)濃度的樣品回收率為85.40%～115.44%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7%，表明該分析方法具有較好的回收率、精密度，在實(shí)際水樣檢測(cè)方面具有良好的適用性、可信度。

表5 3個(gè)加標(biāo)水平下3種MCs的回收率和精密度(n=6)Table 5 Recoveries and RSDs of 3 MCs from surface water of Taihu lake

2.2 結(jié)果分析

1)全部水樣均未發(fā)現(xiàn)藻毒素超標(biāo)現(xiàn)象。3種微囊藻毒素中，MC-LR全湖年均值為0.166 μg/L，全年最大值為0.756 μg/L，未超過(guò)《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838—2002)及《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5749—2006)限值(1.0 μg/L)要求；MC-RR全湖年均值為0.089 μg/L；MC-YR全湖年均值為0.126 μg/L。

2)由圖3可見(jiàn)，全年各月藻毒素濃度變化趨勢(shì):7月太湖水體中MC-LR、MC-YR 2種藻毒素含量為全年最高，MC-RR全湖月均值最高的月份為3月、次高為7月，2月3種藻毒素含量皆為全年最低，其他各月有所波動(dòng)。總體而言，與藍(lán)藻水華暴發(fā)、消亡時(shí)間規(guī)律保持一致。

3)將太湖各湖區(qū)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，由圖4可以發(fā)現(xiàn)，西部沿岸是太湖水體藻毒素含量較高的水域。受藍(lán)藻光合作用特性影響，表層水體的藻毒素含量與水下0.5 m樣品相比也相對(duì)更高。這2個(gè)特點(diǎn)均與太湖藍(lán)藻水華的水平和垂直空間分布規(guī)律保持一致[19]。

圖3 2016年太湖水體MCs變化趨勢(shì)Fig.3 Trends of Microcystins in Taihu Lake in 2016

圖4 2016年太湖水體MCs空間分布狀況Fig.4 Spatial distribution of Microcystins in Taihu Lake in 2016

3 結(jié)語(yǔ)

提出并建立了一種適用于太湖的水體微囊藻毒素分析檢測(cè)方法，該方法靈敏度高、前處理步驟簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短，線性關(guān)系、回收率、重現(xiàn)性等方法學(xué)指標(biāo)較好，檢出限優(yōu)于現(xiàn)行國(guó)際、國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)要求，十分符合太湖水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測(cè)需要。

利用該方法對(duì)2016年2—12月太湖24個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)位的實(shí)際水樣進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，樣品中水體微囊藻毒素未檢測(cè)到超標(biāo)現(xiàn)象，全湖藻毒素含量7月最高、2月最低，西部沿岸藻毒素含量高于其他各主要湖區(qū)，表層水體藻毒素含量相對(duì)更高，藻毒素濃度及變化趨勢(shì)與藍(lán)藻水華生長(zhǎng)分布規(guī)律密切相關(guān)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1] 王蘇民, 竇鴻生. 中國(guó)湖泊志[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1998：3-21.

[2] DONG X H, BENNION H, YANG X D, et al. Tracking Eutrophication in Taihu Lake using the Diatom Record：Potential and Problems[J]. Journal of Paleolimnology, 2008,40：413-429.

[3] 秦伯強(qiáng), 王小東, 湯祥明等. 太湖富營(yíng)養(yǎng)化與藍(lán)藻水華引起的飲用水危機(jī)——原因與對(duì)策[J]. 地球科學(xué)進(jìn)展, 2007, 22(9)：896-906.

QIN Boqiang, WANG Xiaodong, TANG Xiangming, et al. Drinking Water Crisis Caused by Eutrophication and Cyanobacterial Bloom in Lake Taihu：Cause and Measurement [J]. Advances in Earth Science, 2007, 22(9)：896-906.

[4] GADHI S P, GONG Z Y, BRAMANVAN R B. Environmental Toxicity and Chemistry, 2013, 32(7)：1 574-1 581.

[5] 許秋瑾, 高光, 陳偉民. 微囊藻毒素的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)公共衛(wèi)生, 2002, 18(6)：761-763.

XU Qiujin, GAO Guang, CHEN Weimin, et al. Research Progress of Microcystin [J]. Chinese Journal of Public Health, 2002, 18(6)：761-763.

[6] 李彥文, 黃獻(xiàn)培, 吳小蓮，等. 固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定土壤中3種微囊藻毒素[J]. 分析化學(xué), 2013, 41(1)：88-92.

LI Yanwen, HUANG Xianpei, WU Xiaolian, et al. Simultaneous Extraction and Determination of Three Microcystins from Soil Using Solid Phase Extraction and Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry [J]. Chinese Journal of Analytical Chemist, 2013, 41(1)：88-92.

[7] WHO. Cyanobacterial Toxins：Microcystin-LR. WHO Guidelines for Drinking Water Quality[R]. Geneva：World Health Organization, 1998.

[8] 國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局. 地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：GB 3838—2002 [S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2002.

[9] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. 生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：GB 5749—2006 [S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2006.

[10] 全國(guó)食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì). 水中微囊藻毒素的測(cè)定：GB/T 20466—2006 [S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2006.

[11] 熊杰, 錢(qián)蜀, 謝永紅，等. 直接進(jìn)樣-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析水中微囊藻毒素[J]. 中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè), 2014, 30(3)：119-124.

XIONG Jie, QIAN Shu, XIE Yonghong, et al. Determine Microcystin-LR in Water Sample by Direct Injection-HPLC-Tandem Mass Spectrometry [J]. Environmental Monitoring of China, 2014, 30(3)：119-124.

[12] 趙起越, 趙紅帥, 劉保獻(xiàn)，等. 直接進(jìn)樣-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定地表水中9種微囊藻毒素[J]. 分析化學(xué), 2015, 43(4)：594-598.

ZHAO Qiyue, ZHAO Hongshuai, LIU Baoxian, et al. Simultaneous Determination of 9 Microcystins in Surface Water by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry [J]. Analytical Chemistry, 2015, 43(4)：594-598.

[13] 吳麗, 李欣, 李剛. 直接進(jìn)樣-超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定地表水中微囊藻毒素-LR[J]. 新疆環(huán)境保護(hù), 2014, 36(2)：36-40.

WU Li, LI Xin, LI Gang. Determination of Microcystin-LR in Surface Water by Direct Injection and Ultra High Performance Liquid Chromatography-Triple Quadropole Mass Spectrometry [J]. Environmental Protection of Xinjiang, 2014, 36(2)：36-40.

[14] 郭娟, 趙研, 張晶，等. 飲用水中的9種農(nóng)藥殘留及微囊藻毒素的在線固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定[J]. 衛(wèi)生研究, 2012, 41(2)：235-239.

GUO Juan, ZHAO Yan, ZHANG Jing, et al. Determination of Pesticide Residues and Microcystin In Drinking Water Using On-line SPE Liquid Chromatography-Mass Spectrometry [J]. Journal of Hygine Research, 2012, 41(2)：235-239.

[15] 張春燕, 趙興茹, 鄭學(xué)忠. 在線固相萃取超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水中微囊藻毒素[J]. 環(huán)境化學(xué), 2012, 31(10)：1 663-1 664.

ZHANG Chunyan, ZHAO Xingru, ZHENG Xuezhong, et al. Determination of Microcystins by Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with On-Line Solid Phase Extraction in Water [J]. Environmental Chemistry, 2012, 31(10)：1 663-1 664.

[16] 施儉, 景澍閩, 陸峰等. 在線固相萃取-二維高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水中微囊藻毒素-LR[J]. 凈水技術(shù), 2013, 32(3)：52-54, 58, 66.

SHI Jian, JING Shumin, LU Feng, et al. Determination of Microcystin-LR in Water by Online SPE Coupled with Two Dimensional HPLC-MS/MS [J]. Water Purification Technology, 2013, 32(3)：52-54, 58, 66.

[17] 聶晶晶, 李元, 李琴,等. 微囊藻毒素檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè), 2007, 23(2)：43-48.

NIE Jingjing, LI Yuan, LI Qin, et al. Progress on Techniques of Determining Microcystins [J]. Environmental Monitoring in China, 2007, 23(2)：43-48.

[18] 中華人民共和國(guó)環(huán)境保護(hù)部. 環(huán)境監(jiān)測(cè) 分析方法修訂技術(shù)導(dǎo)則：HJ 168—2010 [S]. 北京：中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社, 2010.

[19] 姜晟, 李旭文, 牛志春，等. 空間分布頻率分析法在太湖水華遙感監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè), 2014, 30(1)：196-199.

JIANG Sheng, LI Xuwen, NIU Zhichun, et al. Study on the Spatial Distribution Frequency Analysis Method of Monitoring Water Bloom with Remote Sensing Data in Tai Lake [J]. Environmental Monitoring of China, 2014, 30(1)：196-199.