PCR 法檢測(cè)WSSV 出現(xiàn)假陽性和非特異性條帶的原因分析及解決方法

吳學(xué)芳，李 微

(1.昆山市玉山鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，江蘇 昆山 215316；2.昆山市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇 昆山 215300)

套式PCR法檢測(cè)白斑綜合征病毒(WSSV)因操作簡(jiǎn)便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而被縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。但基層實(shí)驗(yàn)室由于缺少專職實(shí)驗(yàn)操作員、管理較為松散等原因，經(jīng)常出現(xiàn)假陽性和非特異性條帶問題。近年來，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部每年開展水生動(dòng)物防疫系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力驗(yàn)證工作，要求已經(jīng)建成運(yùn)行的縣級(jí)水生動(dòng)物防疫站至少參加一種疫病的實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證項(xiàng)目。白斑綜合征(WSD)由于發(fā)病率高、引起水產(chǎn)動(dòng)物死亡率高從而成為眾多縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室選擇的檢測(cè)項(xiàng)目。

昆山市水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心自2015年起開展WSSV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作，參照《白斑綜合征(WSD)診斷規(guī)程第2部分：套式PCR檢測(cè)法》(GB/T 28630.2-2012)嚴(yán)格執(zhí)行。然而，在實(shí)驗(yàn)過程中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)假陽性和非特異性條帶。筆者與江蘇省內(nèi)多家縣級(jí)水生動(dòng)物防疫站交流后發(fā)現(xiàn)，以上兩個(gè)問題在多家實(shí)驗(yàn)室普遍存在。本文對(duì)套式PCR法檢測(cè)WSSV假陽性和非特異性條帶兩個(gè)問題形成的原因加以分析，并提出預(yù)防和解決方法，旨在為廣大基層實(shí)驗(yàn)室提供參考。

一、假陽性

1.形成原因

套式PCR的原理是采用兩步法進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，第二步PCR以第一步PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板。這種方法檢測(cè)靈敏度非常高，即使在反應(yīng)體系中出現(xiàn)了極其微量的模板污染，也會(huì)造成假陽性。

(1)首次假陽性。由于縣級(jí)防疫實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)人員并非專職實(shí)驗(yàn)操作員，一般為當(dāng)?shù)厮a(chǎn)技術(shù)推廣部門的工作人員兼職負(fù)責(zé)，所以在操作過程中，可能會(huì)出現(xiàn)槍頭非一次性使用、動(dòng)作幅度過大、手套未及時(shí)更換、PCR陽性產(chǎn)物不慎溢出等不當(dāng)操作，這些都是導(dǎo)致假陽性的原因。

(2)非首次假陽性。往往出現(xiàn)一次假陽性后，隨著短期內(nèi)實(shí)驗(yàn)次數(shù)的增加，假陽性發(fā)生的概率也會(huì)隨之加大，這是由于在首次出現(xiàn)假陽性后，實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)、儀器設(shè)備和試劑耗材均有可能被污染，空氣中也可能存在目的片段氣溶膠顆粒。

2.預(yù)防措施

假陽性一旦出現(xiàn)則很難消除，做好預(yù)防工作是十分必要的，具體做好以下3點(diǎn)。

(1)規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作?？h級(jí)防疫站要加強(qiáng)對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員的理論培訓(xùn)和實(shí)操培訓(xùn)，使其增強(qiáng)意識(shí)和提升操作能力，盡可能地減少污染發(fā)生。特別要加強(qiáng)對(duì)移液器規(guī)范使用的培訓(xùn)，很多污染都是由于移液器使用不當(dāng)造成的。

(2)嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)分區(qū)。嚴(yán)格區(qū)分樣品處理室、反應(yīng)體系配制室、PCR擴(kuò)增室和電泳室等。實(shí)驗(yàn)分區(qū)的好處是一旦出現(xiàn)污染，可控制在某一單獨(dú)區(qū)域或少數(shù)區(qū)域，而其他區(qū)域仍可正常使用，大大提高后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成功率。

(3)重視消毒。在每次PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)束后都要消毒，地面和工作臺(tái)面用含氯消毒液擦拭，儀器設(shè)備要用75%酒精擦拭。此外，在實(shí)驗(yàn)開始前，要對(duì)用到的吸頭、離心管等進(jìn)行高溫高壓滅菌消毒。

3.解決方法

發(fā)現(xiàn)WSSV假陽性現(xiàn)象后，可采取以下幾條措施加以解決。

(1)整體空間用紫外燈照射。消毒液和高溫高壓滅菌消毒僅能滅活WSSV，并不能破壞目的片段DNA分子。在出現(xiàn)假陽性后，縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室可使用移動(dòng)式紫外燈對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域分別進(jìn)行照射消毒，使DNA分子斷裂，從而降低假陽性發(fā)生的概率。

(2)加強(qiáng)通風(fēng)。在假陽性出現(xiàn)后，實(shí)驗(yàn)員往往會(huì)繼續(xù)開展多次實(shí)驗(yàn)以求達(dá)到正確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這樣就會(huì)造成一定空間內(nèi)目的片段DNA分子濃度的不斷升高，假陽性現(xiàn)象不但沒有消除，還會(huì)愈加嚴(yán)重。在發(fā)生這種情況時(shí)，除無菌操作間外，其他區(qū)域要及時(shí)打開門窗通風(fēng)，保證通風(fēng)數(shù)小時(shí)以上，以達(dá)到稀釋污染物的目的。

二、非特異性條帶

1.形成原因

套式PCR法檢測(cè)WSSV，雖然特異性較高，但有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性條帶的擴(kuò)增現(xiàn)象，這些非特異性條帶一般為多條，濃度較低。由于實(shí)驗(yàn)采用國(guó)標(biāo)法，所以排除引物設(shè)計(jì)不合理和退火溫度不合適這兩個(gè)因素，主要考慮以下因素。

(1)模板不純。DNA提取方法不合適或者實(shí)驗(yàn)操作不當(dāng)，引起模板中含有組蛋白、Taq酶抑制劑等雜質(zhì)。

(2)酶失活。Taq酶保存不當(dāng)，造成酶活性降低或者失活。

(3)引物問題。引物質(zhì)量不好或者兩條引物濃度一條高一條低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增。

2.預(yù)防和解決方法

相較于假陽性，非特異性條帶問題可較好預(yù)防和解決。實(shí)驗(yàn)人員平時(shí)要注重Taq酶的低溫保存，酶要存放于-20℃，并每年重新采購(gòu)，以防過期失活。稀釋引物時(shí)，要嚴(yán)格按照國(guó)標(biāo)法規(guī)定的濃度進(jìn)行稀釋，不得隨意更改濃度。引物應(yīng)分裝后低溫保存，切忌反復(fù)凍融造成降解。

實(shí)驗(yàn)室日常運(yùn)行過程中要規(guī)范管理，保證室內(nèi)環(huán)境的清潔，并安排專人負(fù)責(zé)儀器設(shè)備的維護(hù)和試劑管理。PCR實(shí)驗(yàn)需由經(jīng)過系統(tǒng)培訓(xùn)的人員完成。在出現(xiàn)假陽性或非特異性條帶問題后，要及時(shí)分析原因，消除不利因素，以保證獲得正確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提高為養(yǎng)殖生產(chǎn)服務(wù)的能力。