基因檢測(cè)在精準(zhǔn)醫(yī)療中的應(yīng)用與管理

侯英勇，錢(qián)夢(mèng)佳，程韻楓，3，郭 瑋，彭明婷，肖艷群，王向東，顧建英

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032

2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032

3.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院血液科，上海 200032

4.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032

5.北京醫(yī)院國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心，北京 100005

6.上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 200126

7.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院整形外科，上海 200032

基因是指具有遺傳效應(yīng)的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）片段。其結(jié)構(gòu)、功能等與生命體的各項(xiàng)體征密切相關(guān)。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，基因序列信息逐漸成為臨床疾病分子診斷精確的判定依據(jù)?；驒z測(cè)技術(shù)為運(yùn)用各種分子生物學(xué)方法，并結(jié)合生物化學(xué)、遺傳學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、信息學(xué)等多學(xué)科綜合研究、解密基因這一生命密碼的基本手段。鑒于基因檢測(cè)技術(shù)已逐步推廣，經(jīng)病理學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的專(zhuān)家共同探討后，本文概述了基因檢測(cè)在精準(zhǔn)醫(yī)療中的應(yīng)用與管理。

1 基因檢測(cè)的應(yīng)用

1.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種酶促化學(xué)反應(yīng)，可將待測(cè)目的基因在很短的時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增50萬(wàn)倍乃至上百萬(wàn)倍，提高了基因診斷的靈敏度，降低了分析難度。常規(guī)PCR平臺(tái)可應(yīng)用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性、基因點(diǎn)突變或缺失、雜合型缺失及甲基化等。實(shí)時(shí)熒光定量PCR可應(yīng)用于各型肝炎、艾滋病、禽流感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評(píng)價(jià)，也可用于單核苷酸多態(tài)性、基因點(diǎn)突變或缺失、雜合型缺失及甲基化等檢測(cè)。擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR（amplification refractory mutation system PCR，ARMS-PCR）可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因突變樣本的高特異性和高靈敏度檢測(cè)，通過(guò)熒光凈升曲線(xiàn)和Ct（cycle threshold）值判讀結(jié)果［1］。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)多款A(yù)RMSPCR相關(guān)產(chǎn)品上市，以滿(mǎn)足臨床上對(duì)單基因及多基因聯(lián)合檢測(cè)的需求。數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）不依賴(lài)標(biāo)準(zhǔn)品或參考品而能直接定量目標(biāo)基因拷貝數(shù)，可用于檢測(cè)復(fù)雜背景下的目標(biāo)基因序列，并高度耐受PCR反應(yīng)抑制劑［2］。ddPCR技術(shù)可達(dá)到千分級(jí)甚至萬(wàn)分級(jí)的靈敏度，但檢測(cè)通量較低。

1.2 熒光原位雜交熒光原位雜交（FISH）是借助熒光探針標(biāo)記基因序列以便于觀察的檢測(cè)技 術(shù)［3］。FISH可以實(shí)現(xiàn)DNA片段與基因之間相對(duì)位置、方向的準(zhǔn)確定位，可檢測(cè)隱匿或微小染色體畸變及復(fù)雜核型，且費(fèi)用較低，但判讀主觀性強(qiáng)，依賴(lài)于檢測(cè)人員的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，且通量較小。FISH可應(yīng)用于基因組研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、人類(lèi)產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)研究、病毒感染分析等。

1.3 一代測(cè)序一代測(cè)序?yàn)椴捎秒p脫氧鏈終止法的經(jīng)典測(cè)序技術(shù)。一代測(cè)序利用雙脫氧核苷酸能參與DNA復(fù)制卻因缺乏3′羥基而終止DNA合成的特性，在DNA合成反應(yīng)體系中少量加入一種雙脫氧核苷酸，該雙脫氧核苷酸就會(huì)隨機(jī)摻入新合成的DNA鏈中，使反應(yīng)體系中產(chǎn)生長(zhǎng)短不一的DNA鏈（這些DNA的3′端堿基即為該雙脫氧核苷酸所含的堿基），最后進(jìn)行4種含對(duì)應(yīng)雙脫氧核苷酸的DNA復(fù)制，將反應(yīng)后的DNA通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，從下往上進(jìn)行讀序。一代測(cè)序讀取堿基準(zhǔn)確率高、重復(fù)性好，且測(cè)序成本較低，但同時(shí)檢測(cè)靈敏度也較低、通量較小。Sanger測(cè)序平臺(tái)可應(yīng)用于基礎(chǔ)生物學(xué)、生物技術(shù)、診斷等領(lǐng)域，如常見(jiàn)腫瘤用藥相關(guān)靶基因突變檢測(cè)、遺傳性疾病相關(guān)基因檢測(cè)、藥物基因多態(tài)性檢測(cè)，也可用于各型肝炎的基因分型和耐藥位點(diǎn)的檢測(cè)等。

1.4 二代測(cè)序高通量測(cè)序又稱(chēng)為二代測(cè)序，能夠?qū)资f(wàn)到幾百萬(wàn)DNA分子同時(shí)進(jìn)行平行測(cè)序，然后通過(guò)生物信息學(xué)分析得到原始圖像數(shù)據(jù)或電化學(xué)信號(hào)，最終得到待測(cè)樣品的核酸序列或拷貝數(shù)等信息。二代測(cè)序的檢測(cè)規(guī)模和通量大幅度提高，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛。二代測(cè)序目前廣泛應(yīng)用于基因組DNA序列測(cè)定（微生物基因組測(cè)序、線(xiàn)粒體基因組測(cè)序等）和DNA擴(kuò)增子測(cè)序等，得到的基因組信息豐富，并可進(jìn)行變異分型和未知變異分析。

2 基因檢測(cè)全流程質(zhì)量控制管理

國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)辦公廳印發(fā)的新型抗腫瘤藥物臨床應(yīng)用指導(dǎo)原則（2020年版）明確指出，對(duì)于有明確靶點(diǎn)的藥物，須經(jīng)靶點(diǎn)檢測(cè)后方可使用。檢測(cè)所用的儀器設(shè)備、診斷試劑和檢測(cè)方法須獲得國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)。因此，本文針對(duì)基因檢測(cè)實(shí)施的各個(gè)環(huán)節(jié)，包括實(shí)驗(yàn)室人員配備、設(shè)備配置、環(huán)境準(zhǔn)備、取樣、核酸提取、文庫(kù)制備、生物信息分析、報(bào)告解讀等，制定全流程的質(zhì)量控制基本要求。全流程質(zhì)控的根本目的是減少錯(cuò)誤的發(fā)生，從每個(gè)環(huán)節(jié)確保靶點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)性。

2.1 實(shí)驗(yàn)室人員、設(shè)備與環(huán)境要求

2.1.1 實(shí)驗(yàn)室分區(qū)與規(guī)劃進(jìn)行基因檢測(cè)的場(chǎng)所一般由多間實(shí)驗(yàn)室組成，實(shí)驗(yàn)室根據(jù)執(zhí)行的功能不同應(yīng)有明確的區(qū)域劃分，主要遵循4個(gè)原則。（1）各區(qū)獨(dú)立：實(shí)驗(yàn)室各個(gè)區(qū)域的物理空間及實(shí)際使用過(guò)程中，都應(yīng)當(dāng)處于完全分隔狀態(tài)，并且各區(qū)域之間不能有空氣的直接流通；（2）單一流向：基因檢測(cè)通常涉及核酸純化富集和產(chǎn)物擴(kuò)增等過(guò)程，任何樣本源性污染、擴(kuò)增產(chǎn)物污染或氣溶膠污染均可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)，因此各實(shí)驗(yàn)區(qū)域間宜有一定的通風(fēng)壓力差，保證合理的空氣流向，防止污染；（3）因地制宜，新建實(shí)驗(yàn)室除合理、規(guī)范外，也須易于管理；（4）方便工作：實(shí)驗(yàn)室區(qū)域選擇及空間設(shè)計(jì)應(yīng)盡可能方便日常檢測(cè)工作，包括人員流動(dòng)、大型儀器設(shè)備進(jìn)出落地等。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)要求臨床開(kāi)展基因檢測(cè)首先需要有合理規(guī)范的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室作為硬件支撐。臨床實(shí)驗(yàn)室不是醫(yī)院的檢驗(yàn)科或病理科，而是所有為臨床提供醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)服務(wù)的實(shí)驗(yàn)室?！夺t(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》對(duì)實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)和規(guī)范提出了多項(xiàng)基本要求。此外，2010年發(fā)布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》對(duì)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置、分區(qū)、儀器配備、人員培訓(xùn)等提出了規(guī)范化要求。檢測(cè)技術(shù)涉及臨床基因擴(kuò)增技術(shù)時(shí)，實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員須通過(guò)相關(guān)技術(shù)理論與技能培訓(xùn)并取得臨床基因擴(kuò)增檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室人員上崗證。開(kāi)展臨床分子病理檢測(cè)需要使用特定的檢測(cè)試劑，同時(shí)需要進(jìn)行有效監(jiān)管。

2.2 取樣環(huán)節(jié)的優(yōu)化與質(zhì)控基因檢測(cè)前階段是指從臨床醫(yī)師開(kāi)具醫(yī)囑至將所獲樣本進(jìn)行保存的過(guò)程。該階段涉及檢驗(yàn)申請(qǐng)單的規(guī)范化填寫(xiě)，受檢者信息采集和知情同意書(shū)簽訂，樣本采集、運(yùn)送、接收，核酸樣本制備和保存等多個(gè)環(huán)節(jié)，是參與者身份最多最復(fù)雜的環(huán)節(jié)，因此需要嚴(yán)格要求流程中各環(huán)節(jié)人員遵守相關(guān)的規(guī)范化程序。

由于核酸的穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)完整性對(duì)檢測(cè)結(jié)果有決定性影響，因此樣本采集、運(yùn)輸和保存是分析前質(zhì)量控制最重要的環(huán)節(jié)。用于檢測(cè)的臨床樣本類(lèi)型眾多，包括手術(shù)切除或活檢組織、胸腔積液、脫落細(xì)胞、外周血等，不同類(lèi)型的樣本處理和保存的方法不相同，應(yīng)結(jié)合實(shí)際情況，確保用于檢測(cè)的核酸樣本滿(mǎn)足質(zhì)量控制要求。

2.3 核酸提取的優(yōu)化與質(zhì)控用于提取DNA的腫瘤組織樣本，應(yīng)盡可能確定腫瘤細(xì)胞的百分比，選取以腫瘤細(xì)胞為主，且沒(méi)有明顯的壞死、黏液和炎性改變的組織進(jìn)行檢測(cè)［4］。核酸提取后，應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)：（1）采用紫外吸收法測(cè)定吸光度（260/280 nm處）的數(shù)值，通過(guò)數(shù)值大小判斷DNA中是否存在RNA、蛋白質(zhì)或提取過(guò)程殘留試劑的污染；（2）采用熒光染料法特異性結(jié)合DNA測(cè)定其有效濃度，建議總量在20～40 μg或40 μg以上，以方便下游檢測(cè)；（3）通過(guò)電泳法可以評(píng)估DNA長(zhǎng)度 （特別是游離DNA長(zhǎng)度）是否符合預(yù)期要求，并通過(guò)條帶分布的彌散性判斷DNA降解程度。符合各項(xiàng)要求的DNA存于TE（TRIs-EDTA）溶液中待用或長(zhǎng)期保存。

RNA的提取質(zhì)控與DNA基本相同，須特別注意的是提取過(guò)程中要嚴(yán)格防止RNA酶對(duì)其降解，可采用高溫滅菌處理的耗材及RNA保護(hù)劑保存RNA樣本。

從各種類(lèi)型樣本中獲取的核酸的質(zhì)量是基因檢測(cè)成功的關(guān)鍵因素，應(yīng)綜合核酸濃度、純度、完整性、長(zhǎng)度等因素進(jìn)行質(zhì)量分析，明確接受和拒絕標(biāo)準(zhǔn)。若質(zhì)控失敗，則應(yīng)考慮重新提取甚至重新選擇樣本。

2.4 文庫(kù)制備的優(yōu)化與質(zhì)控基于二代測(cè)序技術(shù)的基因檢測(cè)方法，需要對(duì)DNA樣本進(jìn)行一系列處理，制備可在相應(yīng)儀器上進(jìn)行檢測(cè)的產(chǎn)物，通常稱(chēng)之為“文庫(kù)”。文庫(kù)制備方法對(duì)于所涉及的試劑、引物探針、實(shí)驗(yàn)條件都有明確的質(zhì)量控制規(guī)范和要求，并且構(gòu)建好的文庫(kù)也需要進(jìn)行濃度、長(zhǎng)度等質(zhì)量控制，明確接受和拒絕標(biāo)準(zhǔn)。例如：通過(guò)雜交捕獲法建庫(kù)時(shí)，首先需要通過(guò)超聲、酶切等方式將基因組DNA處理成滿(mǎn)足測(cè)序長(zhǎng)度要求的小片段（游離DNA無(wú)需進(jìn)行片段化），而片段化的DNA滿(mǎn)足建庫(kù)用量需求、長(zhǎng)度符合預(yù)期是進(jìn)行下游建庫(kù)的質(zhì)控前提。雜交捕獲法適用于靶向基因測(cè)序，在目標(biāo)基因富集過(guò)程中，受特定基因序列GC含量、重復(fù)區(qū)域、擴(kuò)增偏好性的影響，可能產(chǎn)生部分非特異性的富集，這部分比例過(guò)高將降低目標(biāo)區(qū)域的有效數(shù)據(jù)量，因此對(duì)引物探針的優(yōu)化和校驗(yàn)尤為重要。

2.5 生物信息分析流程的搭建與質(zhì)控對(duì)于二代測(cè)序基因檢測(cè)數(shù)據(jù)，需要結(jié)合生物信息學(xué)分析手段才能得到檢測(cè)結(jié)果。由于生物信息分析手段多樣，可選用的軟件較多，并且不同檢測(cè)流程的算法也有差異，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)實(shí)際分析流程制定嚴(yán)格的質(zhì)控程序。

生物信息分析可分為測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)控處理及過(guò)濾、質(zhì)控合格序列的變異位點(diǎn)鑒定分析2個(gè)主要步驟［5］。實(shí)驗(yàn)室首先需要建立數(shù)據(jù)分析流程（pipeline）的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，必須包含每次監(jiān)測(cè)和評(píng)估運(yùn)行性能的指標(biāo)和質(zhì)控參數(shù)，以及定期監(jiān)測(cè)的指標(biāo)和質(zhì)控參數(shù)，可包括但不限于標(biāo)準(zhǔn)品的突變類(lèi)型及百分比。生物信息分析流程建立后，需要采用已知變異類(lèi)型和變異頻率的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，評(píng)估其特異度和靈敏度是否達(dá)到實(shí)驗(yàn)室要求，并將驗(yàn)證結(jié)果簽名后留底備案［4］。

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)記錄生物信息分析過(guò)程中使用的軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)的升級(jí)或版本更新情況，以保證生物信息分析的可追溯性和檢測(cè)結(jié)果的再現(xiàn)性。應(yīng)定義生物信息分析整體流程的版本號(hào)，當(dāng)軟件更新時(shí)進(jìn)行記錄，對(duì)更新后的流程重新進(jìn)行性能確認(rèn)并升級(jí)版本號(hào)，以便在檢測(cè)記錄中引用。此外，實(shí)驗(yàn)室需要建立一個(gè)異常記錄文檔，用來(lái)記錄偏離生物信息分析標(biāo)準(zhǔn)流程的檢測(cè)。

2.6 報(bào)告解讀的優(yōu)化與質(zhì)控基因檢測(cè)完成后，需由相關(guān)專(zhuān)業(yè)人員出具真實(shí)可信的檢測(cè)報(bào)告。報(bào)告中檢測(cè)結(jié)果的解釋由臨床實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)，臨床意義的解釋由臨床醫(yī)師負(fù)責(zé)，分析后的質(zhì)量控制主要為報(bào)告的正確解讀［6］。

首先，報(bào)告內(nèi)容應(yīng)準(zhǔn)確、清晰、明確和客觀，不可摻雜虛假內(nèi)容，包括采集到的患者詳細(xì)信息、樣本類(lèi)型及質(zhì)量情況、檢測(cè)試劑性能和內(nèi)容、檢測(cè)平臺(tái)及數(shù)據(jù)分析軟件版本、原始結(jié)果、檢測(cè)方法局限性、本次檢測(cè)的質(zhì)控參數(shù)信息、操作及復(fù)核人員和檢測(cè)日期等信息都應(yīng)詳細(xì)注明［7］。建議在報(bào)告首頁(yè)，針對(duì)報(bào)告內(nèi)容作檢測(cè)小結(jié)，可包括體細(xì)胞變異、胚系變異、具有臨床意義變異、可能獲益藥物等信息，使臨床醫(yī)師能快速了解報(bào)告的核心內(nèi)容。

其次，結(jié)果的解釋?xiě)?yīng)由相應(yīng)專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行書(shū)寫(xiě)?；蛎Q(chēng)可參考HUGO基因命名委員會(huì)（HUGO Gene Nomenclature Committee，HGNC）。基因變異的書(shū)寫(xiě)格式可參考人類(lèi)基因組 變 異 協(xié) 會(huì)（Human Genome Variation Society，HGVS）的建議；體細(xì)胞變異可參考分子病理學(xué)協(xié)會(huì)（Association for Molecular Pathology， AMP）、美 國(guó)臨 床腫 瘤 學(xué) 會(huì)（American Society of Clinical Oncology，ASCO）和美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)（the College of American Pathologists，CAP）在2017年發(fā)布的腫瘤體細(xì)胞變異解釋標(biāo)準(zhǔn)指南，報(bào)告各個(gè)檢測(cè)到的變異位點(diǎn)及臨床意義；胚系突變可參考美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）在2015 年發(fā)布的遺傳變異分類(lèi)指南，對(duì)檢測(cè)到的變異位點(diǎn)的致病性予以相應(yīng)的臨床解釋?zhuān)?］。

3 小 結(jié)

通過(guò)探討基因檢測(cè)在精準(zhǔn)醫(yī)療中的應(yīng)用與管理，明確基因檢測(cè)應(yīng)用方法，同時(shí)對(duì)基因檢測(cè)每一步驟的質(zhì)量控制及改進(jìn)優(yōu)化提出要求，希望能為所有從事精準(zhǔn)醫(yī)療檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室提供參考，進(jìn)而不斷提高及改進(jìn)檢測(cè)質(zhì)量，更好地為精準(zhǔn)醫(yī)療服務(wù)。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。