半紅樹林植物黃槿內生真菌多樣性及其抗菌活性研究

蔣圓婷，陳文鳳，田 婧，劉艷麗，陳德力，梁寒峭*

半紅樹林植物黃槿內生真菌多樣性及其抗菌活性研究

蔣圓婷1，陳文鳳1，田 婧1，劉艷麗1，陳德力2, 3*，梁寒峭1*

(1. 北京城市學院生物醫(yī)藥學部，北京 100083；2. 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所海南分所，海南省南藥資源保護與開發(fā)重點實驗室，?？?570311；3. 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193)

黃槿植物的葉、樹皮和花是中藥黃槿的入藥部位，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤的藥用價值。藥用植物內生真菌與宿主植物在基因層面存在信息傳遞，會產生與宿主植物相同或相似的代謝產物，因此黃槿內生真菌次生代謝產物可能成為新型天然活性產物。從不同地點采集的半紅樹林植物黃槿中分離純化出64株內生真菌并鑒定，通過固體發(fā)酵得到其次生代謝產物，采用牛津杯法檢測內生真菌的粗提物對5種常見致病細菌的抑菌活性，后根據(jù)分離部位的不同構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并篩選確定3株具有強抑菌活性的菌株，用于后續(xù)次生代謝產物中化學成分的研究。

黃槿內生真菌；次生代謝產物；抑菌活性；系統(tǒng)發(fā)育分析

感染性疾病始終對人類的生命健康造成危害，自從青霉素在二戰(zhàn)時期被發(fā)現(xiàn)，已拯救了無數(shù)人的性命，抗生素也因此被稱為是20世紀最偉大的發(fā)明之一[1]。然而抗生素的廣泛使用，也引發(fā)了微生物耐藥性的出現(xiàn)，目前人類正在步入有超級菌出現(xiàn)的“后抗生素時代”[2-3]。因此在繼續(xù)加強醫(yī)院防控感染和抗菌藥物合理利用的前提下，仍需加緊新型抗菌藥物的研發(fā)。現(xiàn)代藥物的30% ～ 60%與天然產物相關，通過對天然產物的改造和利用是新藥開發(fā)的重要手段之一[4-5]。但是從普通的微生物資源中難以得到結構新穎的新骨架化合物，因此藥用植物內生菌以及海洋產物逐步引發(fā)關注。

半紅樹植物黃槿是在潮間帶生存的兩棲木本植物，有重要的生態(tài)功能。由于其生長環(huán)境具有高鹽、強光照、缺氧等特點，使得黃槿生境適應性獨特，既可在海灘上成為優(yōu)勢樹種，又能在陸地環(huán)境自然繁殖。這一特點造就了黃槿內生菌特殊的代謝途徑，使其成為新型天然產物的來源之一[6-7]。黃槿具有抗炎[8]、抗氧化[9]及抗腫瘤[10]等多種生物活性，且黃槿內生真菌可以產生與宿主植物黃槿相同或相似的代謝產物，因此黃槿內生菌的次生代謝產物有可能存在新型活性物質，有待進一步研究。

本研究從黃槿的不同部位分離純化出內生真菌，采用固體發(fā)酵得到其次生代謝產物，而后通過牛津杯法進行抑菌活性篩選以及完成菌株鑒定，根據(jù)分離部位的不同構建系統(tǒng)發(fā)育樹，以期篩選出具有強抑菌活性的菌株。

1 材料與方法

1.1 植物材料及供試菌株

植物材料：黃槿（）植株于2019年8月采自海南?？?、陵水和儋州，4 ℃存放于北京城市學院生物醫(yī)藥學部實驗室（No.20191001）。

供試菌株：大腸埃希氏菌（）（CICC 21530）、枯草芽孢桿菌（）（CICC 10732）、金黃色葡萄球菌（）（CICC 21600）、腸沙門氏菌腸亞種腸炎血清型（subsp.）（CICC 21513）及福氏志賀氏菌（）（CICC 21534），均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato dextrose agar, PDA）：馬鈴薯浸粉2.5 g，葡萄糖10 g，瓊脂10 g，氯霉素0.05 g，蒸餾水500 mL。

孟加拉紅培養(yǎng)基（Rose bengal medium , RBM）：蛋白胨2.5 g，葡萄糖5 g，磷酸氫二鉀0.5 g，硫酸鎂0.25 g，孟加拉紅0.016 5 g，瓊脂10 g，氯霉素0.05 g，pH 7.0～7.4，蒸餾水500 mL。

大米固體培養(yǎng)基：大米40 g，玉米粉0.5 g，蛋白胨0.15 g，Mg2SO40.15 g，KH2PO40.25 g，蒸餾水120 mL。

胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基（Trypticase soy broth, TSB）：胰酪胨5.0 g，大豆木瓜蛋白酶水解物1.5 g，氯化鈉2.5 g，瓊脂7.5 g，pH 7.1 ～ 7.5，蒸餾水500 mL。

1.3 內生菌的分離與純化

黃槿的根莖葉用蒸餾水沖洗干凈，用吸水紙將表面水分吸干，然后在超凈工作臺上進行后續(xù)消毒處理：（1）用75%乙醇溶液浸泡2 min；（2）用活性氯濃度5%的次氯酸鈉溶液浸泡根3 min、莖葉1.5 min；（3）用無菌水漂洗4次；（4）用滅過菌的紗布蘸干水分備用。將心材部位在酒精燈上進行表面高溫消毒。

在無菌條件下，用無菌刀片將處理后的樣品切成長度為5 mm見方的小塊，并將其分別接種在PDA和RBM培養(yǎng)基上，每小塊間隔3 cm，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)3～5 d，待生長出菌落，用接種環(huán)挑取邊緣部分轉接至新鮮PDA養(yǎng)基上純化，對純種菌進行形態(tài)描述并拍照記錄。

1.4 內生真菌次生代謝產物的制備

挑取純化后的單菌種，轉接至新鮮大米固體培養(yǎng)基上，常溫下發(fā)酵20 d。取發(fā)酵后的產物，加入乙酸乙酯攪拌，隔夜靜置，超聲提取，經過濾得到發(fā)酵濾液，上述操作重復2次。經旋轉蒸發(fā)儀濃縮發(fā)酵濾液得到發(fā)酵產物浸膏，通風櫥揮干備用。

1.5 牛津杯法抑菌活性篩選

供試菌株活化。用75%酒精脫脂棉擦拭管外壁進行消毒，用砂輪于管頂端挫痕，后將管頂端置于酒精燈外焰灼燒，加數(shù)滴無菌水于管頂端，在管頂破裂后輕敲敲斷，用接種環(huán)挑取指示菌于TSB培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 ～ 2 d。后挑取菌落稀釋，按照麥氏濁度標準（0.5號），使菌濃度達到108CFU·mL-1。

采用牛津杯法測定上述分離出的黃槿內生真菌的抑菌活性。一次倒入TSB培養(yǎng)基作為下層培養(yǎng)基，待紫外照射等待冷卻后，間隔25 mm放置5個牛津杯，后二次倒入TSB培養(yǎng)基作作下層培養(yǎng)基，后取出牛津杯。用棉簽蘸取供試菌株菌懸液，均勻涂布于牛津杯孔外的平板。取0.01 g浸膏樣品，加入30%酒精溶液制成10 mg·mL-1樣品溶液，備用。

使用微量移液器分別取100和200 μL樣品，各加入2個孔內。中間放置陽性對照或陰性對照（30%乙醇水溶液）。將培養(yǎng)皿放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，12 h后用游標卡尺測量并且拍照記錄抑菌圈外徑，取同一樣品相同樣品量下的平均值，用抑菌圈外徑d（cm）表示抑菌作用的強弱。

1.6 菌株分子生物學鑒定

刮取新鮮菌絲體，置于含有20 μL DNA提取緩沖液（MTi-ClpH8.3，MgCl2，MKC，10%SDS，1% Proteinase K）的0.6 mL的微量離心管中。菌絲體用移液槍的槍頭輕輕搗碎，之后在自動孵化器中，37 ℃孵化60 min，然后95 ℃孵化10 min，最后在微量離心管中加入30 μL無菌水。

在超凈工作臺內配制50 μL反應體系混和液，根據(jù)體積計算定量（10×Buffer，25 mmol·mL-1dNTP Mix，濃度為50 μmol·mL-1上下游引物，25 mmol·mL-1MgCl2，SDW），在反應混和液中加入DNA提取物。

PCR擴增后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，產物擴增的情況用BIORAD凝膠成像系統(tǒng)照相。采用DNA純化試劑盒對PCR產物進行純化，純化后再次在瓊脂糖凝膠上電泳，UV照射下，檢測DNA濃度。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所測序。

登陸NCBI，利用BLAST將測序獲得的各菌株的序列與GenBank中的已知序列進行比對，查找相似性最高的菌種，結合形態(tài)學特征，確定分離菌株的分類地位。

1.7 系統(tǒng)發(fā)育樹和熱圖的構建

應用MEGA7.0軟件按照鄰接法（neigh-bour- Joining，N-J），自展數(shù)（bootstrap）為1 000，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Excel軟件構建熱圖。

2 結果與分析

2.1 黃槿內生真菌的分離純化

2.1.1 表面消毒結果檢驗 最后一次清洗材料的無菌水，涂布于新鮮PDA培養(yǎng)基上，未見任何菌落。說明分離得到的黃槿內生真菌是屬于植物組織本身，而非植物表面的附生菌。

表1 不同部位的黃槿內生真菌分離和純化的數(shù)量

表2 黃槿內生真菌形態(tài)特征描述

續(xù)表2

2.1.2 不同部位黃槿內生真菌分離純化結果 本研究從黃槿各部位中總計分離出64株不同的黃槿內生真菌。其中?？?天然有8株，?？?鉆孔4株，陵水-天然9株，陵水-鉆孔8株，儋州-天然11株，儋州-鉆孔12株，?？邳S槿的葉部、根部和莖部分別分離得到3、2和7株（表1）。

2.1.3 黃槿內生真菌形態(tài)特征描述結果 黃槿各部位分離出的黃槿內生真菌的編號、來源及形態(tài)特征見表2，黃槿不同部位的部分內生真菌菌株的菌落特征見圖1。

2.2 抑菌活性篩選結果

抑菌實驗采用大腸埃希氏菌（）（CICC 21530）、枯草芽孢桿菌（）（CICC 10732）、金黃色葡萄球菌（）（CICC 21600）、腸沙門氏菌腸亞種腸炎血清型（subsp）（CICC 21513）及福氏志賀氏菌（）（CICC 21534）為供試菌株，選用TSB固體培養(yǎng)基。根據(jù)抑菌圈直徑的大小來衡量菌株的抑菌活性，篩選結果見圖2，部分菌株牛津杯法抑菌試驗結果見圖3。

圖1 黃槿不同部位分離純化出的黃槿內生真菌

Figure 1endophytes isolated and purified from different parts

2.3 分子生物學鑒定

將從黃槿各部位中分離得到的64株黃槿內生真菌的序列，通過BLAST在GenBank進行同源性檢索，登陸網站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast，將不同菌株的ITS序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對。采用MEGA 7.0軟件中Alignment Explorer對同一部位分離出來的菌株與相關模式菌株進行同源性分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

其中從黃槿心材部位共分離得到52株內生真菌，經鑒定后屬于14個屬，分別為鐮刀屬（sp.）、叢赤殼屬（sp.）、毛雙孢屬（sp.）、青霉屬（sp.）、彎孢屬（sp.）、曲霉屬（sp.）、莖點霉屬（sp.）、木霉屬（sp.）、絲衣霉屬（sp.）、黑星菌屬（sp.）、旋孢腔菌屬（sp.）、腐質霉屬（sp.）、鏈格孢屬（sp.）和菌稻黑孢霉（sp.）（圖4）。從黃槿莖部共分離得到7株內生真菌，經鑒定后屬于5個屬，分別為sp.、鐮刀屬（sp.）、炭疽菌屬（sp）、曲霉屬（sp.）和間座殼屬（sp.）（圖5）。從黃槿葉部共分離得到3株內生真菌，經鑒定后屬于3個屬，分別為sp.、間座殼屬（sp.）和炭疽菌屬（sp）（圖6）。

各部位黃槿內生真菌比對結果如表3所示。

圖2 黃槿內生真菌抑菌活性篩選熱圖

Figure 2 Heat map for screening the antibacterial activity ofendophytes

圖3 部分菌株牛津杯法抑菌試驗結果

Figure 3 Results of some bacterial inhibition experiments by Oxford cup method

表3 各部位黃槿內生真菌比對結果

圖4 黃槿心材部位內生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹

Figure 4 Phylogenetic tree ofendophytes in heartwood

圖5 黃槿莖部位內生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹

Figure 5 Phylogenetic tree ofendophytes in stem

圖6 黃槿葉部位內生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹

Figure 6 Phylogenetic tree ofendophytes in leaf

3 討論

當前研發(fā)新藥，離不開對天然產物的一系列利用與改造，因此天然藥物始終是全球醫(yī)藥的重要組成部分。同時作為天然藥物中有效成分的單體化合物也逐步成為當前新藥抗菌藥物的篩選與研發(fā)對象，以希望研發(fā)出新型活性先導化合物[11]。

植物內生真菌由于長期與宿主植物處于復雜且特殊的關系，兩者均會由于環(huán)境等內外因素的影響，致使對自身的生理因素產生影響。有研究表明，處于特殊環(huán)境中的真菌，其次生代謝產物結構和作用機制會更加新穎，且活性廣泛，如植物內生真菌和海洋真菌等[12]。作為本試驗宿主植物的黃槿，其本身具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等生物活性，其內生真菌也會與之在基因層面存在信息傳遞。

本研究中，采用牛津杯法對分離得到的64株黃槿內生真菌進行抑菌試驗，其中分別有32、40、30、6和7株菌分別對5種試驗菌株產生抑菌活性。并可通過測量抑菌圈的直徑來確定菌株抑菌活性的強弱，其中有3株菌株對所有試驗菌株的抑菌圈直徑均超過15 mm，可見其抑菌效果良好。通過ITS r-DNA序列比對分析，鑒定8號和15號菌株均為鐮刀屬真菌（sp.），29號菌株為絲衣霉菌屬真菌（sp.）。后續(xù)可繼續(xù)研究具有強抑菌活性菌株的次生代謝產物中的化學成分。

藥用植物內生真菌可用于微生物轉換，來獲得結構新穎的化合物。但是由于在實驗室的環(huán)境中，從宿主植物培養(yǎng)出的內生真菌菌落中分離純化出的部分菌株，會出現(xiàn)產出孢子較少或是無法在體外環(huán)境培養(yǎng)的情況。通過觀察及文獻檢索[13]，考慮到可能由于培養(yǎng)基的配制、培養(yǎng)環(huán)境溫度的選擇以及菌株自身是否可在體外生存等因素致使對黃槿內生真菌多樣性的研究造成影響。后期研究可以通過調整培養(yǎng)參數(shù)等手段來誘使更多菌株孢子的產出，以及沉默基因的表達來豐富黃槿內生真菌的多樣性。

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Study on diversity and antimicrobial activity of endophytic fungi isolated from semi-mangrove plant

JIANG Yuanting1, CHEN Wenfeng1, TIAN Jing1, LIU Yanli1, CHEN Deli2, 3, LIANG Hanqiao1

(1. Department of Biomedicine, Beijing City University, Beijing 100083; 2. Hainan Branch Institute of Medicinal Plant Development (Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine), Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Haikou 570311; 3. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193)

The leaves, barks and flowers ofare the medicinal parts of the traditional Chinese medicine, which have the medicinal values of antibacterial, anti-inflammatory and anti-tumor. There is information transmission between medicinal plant endophytic fungi and host plants at the genetic level, which can produce the same or similar metabolites as host plants, soendophytic fungi may become one of the sources of new natural products. In this study, 64 strains of endophytic fungi were isolated and identified from different parts of semi-mangrove plant, fermented in solid state, and then oxford cup method was used to detect the bacteriostatic activities of the metabolites to five kinds of common pathogenic bacteria. According to different construction of phylogenetic tree of the separate parts, three strains had been screened to be inhibitor activity of bacteria, which can be used to study the chemical composition of metabolites in the future.

endophytes; secondary metabolites; antimicrobial activity; phylogenetic analysis

R282.71; Q939.92

A

1672-352X (2022)05-0838-10

10.13610/j.cnki.1672-352x.20221111.013

2022-11-14 14:22:01

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20221111.1112.026.html

2021-12-20

國家自然科學基金（21808004），北京城市學院科研發(fā)展基金（KYF202003）和北京城市學院2022年度研究生科研創(chuàng)新項目（Yjscx202243）共同資助。

蔣圓婷，碩士。E-mail：616756731@qq.com

陳德力，副研究員。E-mail：chende-li9999@163.com 梁寒峭，教授。E-mail：lhqbcsw@126.com