過表達(dá)玉米ZmSC1基因增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性

王 龍，陳逸蓉，于 偉，劉雨晴，李愛琪，武健東

過表達(dá)玉米基因增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性

王 龍，陳逸蓉，于 偉，劉雨晴，李愛琪，武健東*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)作物抗逆育種與減災(zāi)國家地方聯(lián)合工程實驗室，合肥 230036)

旨在從玉米中克隆耐鹽相關(guān)基因，分析其分子特征并在擬南芥中研究其耐鹽性的生物學(xué)功能。以玉米B73為試驗材料，克隆全長序列，與其他物種進(jìn)行同源性比對，解析其鹽誘導(dǎo)表達(dá)模式和亞細(xì)胞定位情況，將轉(zhuǎn)入到擬南芥突變體和野生型中，觀察在鹽處理下種子萌發(fā)率和主根根長情況，利用熒光定量PCR分析相關(guān)逆境（140 mmol·L-1脅迫）基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，基因全長為423 bp，編碼141個氨基酸，ZmSC1和小麥、擬南芥中已知的TaSC1、AtSC1具有較高保守性。煙草細(xì)胞瞬時表達(dá)、玉米原生質(zhì)體亞細(xì)胞定位研究表明ZmSC1定位于細(xì)胞膜中。生物學(xué)功能研究發(fā)現(xiàn)在140 mmol·L-1的NaCl的鹽處理下，相比較于擬南芥突變體，回補(bǔ)植株擬南芥的種子萌發(fā)率和主根根長得到了明顯改善，這說明基因可以回補(bǔ)擬南芥同源基因突變體植株在鹽脅迫下的表型?；蜻^表達(dá)擬南芥植株的種子萌發(fā)率和主根根長也顯著高于野生型植株。熒光定量PCR結(jié)果顯示相較于野生型，在過表達(dá)植株中、、、等脅迫相關(guān)基因的表達(dá)量也明顯增強(qiáng)。研究結(jié)果表明、的同源基因?qū)μ岣邤M南芥的耐鹽性具有重要作用。

玉米；基因；突變體; 過量表達(dá)；耐鹽性

植物在生長過程中，常會受到各種非生物逆境的危害，從而影響植物的生長和發(fā)育。高鹽作為非生物逆境中的一種主要脅迫，會引起植物產(chǎn)生滲透脅迫和離子脅迫，從而導(dǎo)致植物生長發(fā)育受到限制。同時，植物在長期生長過程中也進(jìn)化出一系列調(diào)控蛋白和信號通路來適應(yīng)高鹽的影響，其中調(diào)控蛋白包括轉(zhuǎn)錄因子、分子伴侶、離子通道和轉(zhuǎn)運蛋白[1]。如過表達(dá)玉米轉(zhuǎn)錄因子可以提高轉(zhuǎn)基因植物的抗干旱和耐高鹽能力[2]；玉米中編碼CBL結(jié)合蛋白激酶基因受到高鹽和干旱的上調(diào)誘導(dǎo)表達(dá)[3]。

除了調(diào)控蛋白外，植物在鹽脅迫下也會通過激活信號傳導(dǎo)通路調(diào)控逆境響應(yīng)基因的表達(dá)來提供防御，其中，對絲裂原激活蛋白激酶途徑（mitogen- activated protein kinase pathway）、鈣依賴型蛋白激酶途徑（calcium-dependent protein kinase pathway）和鹽敏感通路（salt overly sensitive pathway）的研究較為深入[4-5]。途徑在植物生物和非生物脅迫反應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用[6]，MAPK級聯(lián)信號通路由3種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶所組成：分別為MAPKKK，MAPKK和MAPK，在玉米中具有74、6和19個成員。例如玉米在高鹽脅迫下，種子會在基因的調(diào)控下儲備滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來緩解危害[7]。途徑是通過激活應(yīng)急蛋白的表達(dá)而參與到不同逆境途徑中[8]，如鹽和干旱處理1 h后，擬南芥和基因的mRNA表達(dá)水平會明顯升高[9]；研究報道玉米中有40個CDPK家族編碼基因，其中有12個參與到植物的非生物脅迫途徑，分別參與到抗鹽、高低溫、干旱等逆境過程[10]，如基因可以提高植物的耐鹽性[11]。途徑也是植物提高耐鹽性的主要途徑[12]，SOS途徑主要包含SOS3、SOS2和SOS1 共3個成員，在鹽脅迫下SOS3和SOS2會形成蛋白激酶復(fù)合體從而磷酸化SOS1，SOS1是反向鈉離子運輸?shù)鞍祝患せ畹腟OS1可以降低植物內(nèi)的Na+離子濃度從而達(dá)到耐鹽的目的[13]。實際上植物對鹽脅迫的防御是一個非常復(fù)雜的過程，研究者認(rèn)為植物在受到高鹽脅迫時，有多種機(jī)制共同參與到防御過程[14]。

玉米作為重要的糧食作物，其種植面積和產(chǎn)量已超過水稻，然而玉米的耐鹽性較差，對NaCl的極限濃度為170 mmol·L-1[15]。因此挖掘耐鹽相關(guān)基因并解析其功能具有重要的理論研究價值和實際應(yīng)用意義，特別是隨著玉米基因組序列的公布[16]，使其在全基因組上進(jìn)行大數(shù)據(jù)挖掘和分析成為可能。實驗室前期通過轉(zhuǎn)錄組測序的方法分析玉米B73自交系在高鹽處理下的基因表達(dá)情況，其中一個基因表達(dá)量明顯提高，通過序列比對發(fā)現(xiàn)該基因同小麥基因同源性較高，因此該基因命名為。過表達(dá)基因可以顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性[17]，然而基因的功能還鮮見報道。因此，本研究從玉米B73自交系中克隆了該基因，并對該基因的誘導(dǎo)表達(dá)模式和定位進(jìn)行了分析，同時利用擬南芥同源基因突變體回補(bǔ)植株和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對其功能進(jìn)行了分析。此外，借助熒光定量PCR技術(shù)對基因在擬南芥中行使功能的可能作用途徑進(jìn)行初步分析，以期為后續(xù)研究該基因在玉米耐鹽功能中所發(fā)揮的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥野生型（Col-0）、突變體（突變體號為SALK_072220，實驗室已有材料）和轉(zhuǎn)基因植株生長于溫度22 ℃、光周期為16 h光照/8 h黑暗的人工溫室中；煙草生長于實驗室溫室中，溫度為25 ℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗；玉米B73自交系生長于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)溫室中，溫度為 28 ℃，光照強(qiáng)度1.5 mmol·s-1·m-2，光周期為 14 h 光照/10 h 黑暗。

1.2 方法

1.2.1 鹽脅迫處理 當(dāng)玉米生長至三葉期時期，選用150 mmol·L-1NaCl溶液進(jìn)行澆灌模擬鹽脅迫，分別于0、1、3、6和12 h后取葉片備用。

1.2.2 煙草瞬時表達(dá)分析、玉米原生質(zhì)體瞬時表達(dá)分析 載體構(gòu)建：利用Phytozome網(wǎng)站基因已知序列，結(jié)合Primer 5.0軟件設(shè)計上下游引物，分別為5′- GACTAGTATGGAGAACCTTGCTCTG CTT-3′（加粗字體為I酶切位點），5′-GCTCT AGATTAATCTTCTGAGTGGCATGTCC-3′（加粗字體為I酶切位點），通過PCR方法把融合到pCAMBIA1305載體上（I和I雙酶切），從而產(chǎn)生35S::GFP-ZmSC1融合載體，測序正確后，導(dǎo)入到農(nóng)桿菌GV3101中備用。

亞細(xì)胞定位：選用6周生長良好的本氏煙煙草，將含有35S::GFP和35S::GFP-質(zhì)粒的農(nóng)桿菌注射煙草表皮細(xì)胞中，經(jīng)過48 h暗培養(yǎng)后，置于蔡司LSM 710共聚焦熒光顯微鏡下觀察拍照。

選玉米B73種子，經(jīng)暗處理萌發(fā)10 d，培養(yǎng)成黃化苗（二葉期），將連接好的35S::GFP-質(zhì)粒導(dǎo)入經(jīng)酶解提純后玉米原生質(zhì)體中，經(jīng)過48 h暗培養(yǎng)后，置于蔡司LSM 710共聚焦熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的產(chǎn)生 利用PCR技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體pCAMBIA1301--GUS，測序正確后導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中備用。選取6周左右生長一致的擬南芥野生型和突變體植株，將含有目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液滴到未開的頂端分生組織上，所得后代經(jīng)過繁殖得到T3代純合體株系，驗證后備用。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株種子萌發(fā)率和主根根長分析 萌發(fā)率分析：將消毒過的野生型、突變體、回補(bǔ)植株和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的種子分別鋪到1/2 MS、含有140 mmol·L-1NaCl的1/2 MS平板上，春化2 d后，置于溫室中培養(yǎng)，6 d后拍照，統(tǒng)計種子的萌發(fā)率，每種材料統(tǒng)計100個種子的萌發(fā)情況，試驗重復(fù)3次。

根長統(tǒng)計分析：將消毒過的野生型、突變體、回補(bǔ)植株和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的種子分別鋪到1/2 MS上垂直培養(yǎng)3 d后，分別轉(zhuǎn)移到1/2 MS和含有140 mmol·L-1NaCl的1/2 MS平板上，垂直培養(yǎng)9 d后拍照，統(tǒng)計主根根長，每種材料統(tǒng)計100個植株，試驗重復(fù)3次。

表1 所用引物

1.2.5 RNA提取和熒光定量PCR分析 使用Trizol法提取玉米和擬南芥植株組織（各自包含3個獨立的生物學(xué)重復(fù)）的總RNA，RNA提取后利用Transgen反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA?；蛞镆姳?。利用ABI PRISM 7500 熒光定量PCR儀器進(jìn)行熒光定量PCR分析（每個基因3個獨立的技術(shù)重復(fù)），具體程序為第一步為95 ℃ 5 min，第二步為95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共41循環(huán)，使用2–ΔΔCT法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[18]

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米ZmSC1基因及其誘導(dǎo)表達(dá)模式分析

前期實驗室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果顯示在鹽處理下，一個基因表達(dá)量顯著提高，通過蛋白序列比對分析發(fā)現(xiàn)該蛋白和小麥TaSC1(AAY26392)、擬南芥中AtSC1(NP001319157)同源性很高，序列一致性分別達(dá)到91%和71%，預(yù)測其具有Uncharacterised protein family (UPF0220)保守結(jié)構(gòu)域。因此該基因被命名為（salt-stress correlative，NP001335968），全長423 bp，編碼141個氨基酸（圖1A）。根據(jù)的氨基酸序列，通過蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域在線預(yù)測軟件TMHMM，預(yù)測ZmSC1蛋白的跨膜區(qū)域(圖1B)。分析結(jié)果顯示ZmSC1總共含有4個跨膜區(qū)，這表明ZmSC1應(yīng)該是一個膜整合蛋白，可能在離子跨膜轉(zhuǎn)運過程中會發(fā)揮功能。

為了進(jìn)一步驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果，利用熒光定量PCR進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)基因確實受到高鹽脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，在高鹽處理6 h后，其表達(dá)量達(dá)到最高值，約為0 h的3.3倍，隨后下降（圖2），這表明可能參與到鹽脅迫的調(diào)控過程中。

2.2 ZmSC1定位于細(xì)胞膜

為了分析ZmSC1的亞細(xì)胞定位，構(gòu)建了35S::GFP-表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌注射的方法注射到煙草表皮細(xì)胞，48 h后觀察其熒光表達(dá)情況。結(jié)果顯示注射35S::GFP的煙草細(xì)胞在共聚焦顯微鏡中在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有表達(dá)，而注射35S::GFP-菌液的煙草細(xì)胞，只能在細(xì)胞膜上看到綠色熒光信號（圖3A）。為了進(jìn)一步證明ZmSC1是一個膜蛋白，我們將連接好的35S::GFP-質(zhì)粒導(dǎo)入經(jīng)酶解提純后玉米原生質(zhì)體中，經(jīng)過48 h暗培養(yǎng)后，只能在細(xì)胞膜上看到綠色熒光信號（圖3B），因此確定ZmSC1是膜蛋白，推測它對物質(zhì)的跨膜運輸起到一定的作用。

A. 玉米ZmSC1與TaSC1、AtSC1序列比對分析；B. 預(yù)測ZmSC1的蛋白跨膜區(qū)。

Figure 1 Bioinformatics analysis of ZmSC1

圖中數(shù)據(jù)為實驗重復(fù)的平均數(shù)值與標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。

Figure 2 Expression level analysis ofunder NaCl stress

2.3 ZmSC1基因回補(bǔ)擬南芥突變體表型

為了解析的生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了35S啟動子驅(qū)動的過表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)化擬南芥同源基因突變體（SALK_072220）和野生型(Col-0)中，從而獲得回補(bǔ)植株（Com-1，Com-2）（圖4A）和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株（OE-1，OE-2）（圖4B），所有材料繁殖T3代經(jīng)過驗證后進(jìn)行下一步功能分析。正常生長條件下，野生型、突變體和回補(bǔ)植株在種子萌發(fā)率和主根根長上沒有差異，然而在140 mmol·L-1NaCl 處理下，相對于野生型，突變體的種子萌發(fā)率和主根根長分別下降了18%和11%，這說明擬南芥基因具有耐鹽功能；而轉(zhuǎn)化了35S::ZmSC1的回補(bǔ)植株（Com-1，Com-2）的種子萌發(fā)率和主根根長得到了恢復(fù)（圖5），這說明基因在鹽脅迫的過程中發(fā)揮功能。

2.4 過表達(dá)ZmSC1基因增強(qiáng)擬南芥植株的耐鹽性

為了進(jìn)一步明確基因在鹽脅迫中的功能，我們對過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株OE-1和OE-2進(jìn)行了種子萌發(fā)率和主根根長的統(tǒng)計。結(jié)果顯示，在140 mmol·L-1NaCl 處理下，相較于野生型株系，過表達(dá)株系的種子萌發(fā)率分別提高了28.3%和26.4%，主根根長也分別增加了18.1%和18.3%（圖6），這些結(jié)果說明基因具有增強(qiáng)植物的耐鹽性功能。

A. 煙草瞬時表達(dá)分析；B. 玉米原生質(zhì)體瞬時表達(dá)分析。

Figure 3 Subcellular localization of ZmSC1

A. 回補(bǔ)植株GUS染色和PCR驗證分析；B. ZmSC1在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)量分析。

Figure 4 Verification ofcomplementation and overexpression transgenic lines

2.5 ZmSC1基因上調(diào)擬南芥植株中抗性相關(guān)基因的表達(dá)水平

在植物生物和非生物脅迫反應(yīng)中，SOS途徑、途徑、COR蛋白等具有重要的調(diào)控作用[25-28]。為了初步分析基因調(diào)控擬南芥耐鹽性的作用機(jī)制，我們利用熒光定量PCR技術(shù)分析了在鹽脅迫條件下野生型和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中脅迫相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，相較于野生型，轉(zhuǎn)基因植株中，基因的表達(dá)量提高了3.4倍，和基因的表達(dá)量分別提高2.3倍和1.8倍，、、等基因的表達(dá)量也分別有不同程度的提高（圖7）。這些結(jié)果說明通過提高抗逆相關(guān)基因的表達(dá)來增強(qiáng)擬南芥的耐鹽性。

A. 正常和鹽脅迫下各株系的萌發(fā)情況；B. 萌發(fā)率統(tǒng)計；C. 正常和鹽脅迫下情況各株系幼苗主根的生長情況；D. 根長統(tǒng)計。

Figure 5can rescue the phenotype ofmutants under NaCl stress

A. 正常和鹽脅迫下各株系的萌發(fā)情況； B. 萌發(fā)率統(tǒng)計；C. 正常和鹽脅迫下情況各株系幼苗主根的生長情況；D. 根長統(tǒng)計。

Figure 6 Overexpression ofcan enhance salt tolerance in transgenicunder NaCl stress

3 討論與結(jié)論

土壤鹽漬化是影響植物生長和發(fā)育的重要因素，玉米作為重要的糧食飼料作物，其耐鹽性較差，通過遺傳改良手段有望成為選育耐鹽品種的關(guān)鍵途徑。然而玉米的遺傳轉(zhuǎn)化難度較大，首先利用模式作物擬南芥豐富的突變體庫和異源轉(zhuǎn)化來進(jìn)行候選基因的功能驗證已成為主要的研究思路[20-21]。

實驗室已有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下基因的表達(dá)量升高。在本研究中，通過高鹽誘導(dǎo)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)基因確實受到鹽誘導(dǎo)6 h后表達(dá)量達(dá)到最高，12 h后開始下降（圖2），此外在NaCl處理下，基因回補(bǔ)擬南芥植株比擬南芥突變體具有更好的種子萌發(fā)率和主根根長（圖5），過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株在正常情況下和野生型植株沒有差異，但是在鹽脅迫下比野生型也顯示出更好的種子萌發(fā)率和主根根長（圖6），這些結(jié)果和基因的功能報道一致[18]，這也表明基因可以提高擬南芥的耐鹽性，因此基因可以作為主要耐鹽候選基因用于玉米遺傳改良中。

圖7 過表達(dá)ZmSC1在鹽脅迫下可以上調(diào)轉(zhuǎn)基因擬南芥抗逆相關(guān)基因的表達(dá)水平

Figure 7 Overexpression ofcan up-regulate the expression levels of stress-related genes in transgenicunder NaCl stress

耐鹽相關(guān)基因常通過信號通路來行使功能，在鹽脅迫下，過表達(dá)基因轉(zhuǎn)基因植株中的基因的表達(dá)量是上調(diào)的（圖7）。信號途徑中CDPK激酶是鈣依賴型的，鈣激活通過調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來提高已知耐鹽相關(guān)基因、以及的表達(dá)，從而提高植物的耐鹽性[22-24]，這和本研究的結(jié)果是一致的。在鹽脅迫下，過表達(dá)基因轉(zhuǎn)基因植株中、以及基因的表達(dá)都分別提高了3.4、1.8和1.4倍（圖7），這表明基因可能通過途徑來提高植物的耐鹽性。有趣的是在過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中，和基因的表達(dá)量也分別提高了2.3和1.8倍（圖7），而在過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中，和的表達(dá)量是沒有變化的，這說明基因和雖然具有很高的序列相似性，并都能提高植物的耐鹽性，但是其調(diào)控的信號通路可能是不同的，顯然和基因表達(dá)量的變化也暗示基因調(diào)控植株的耐鹽性也可能通過信號通路中，實際上已有報道和途徑在植物耐鹽途徑中存在交叉對話[24]。當(dāng)然，基因如何協(xié)同參與到和信號通路中還需要進(jìn)一步的實驗來驗證。

綜上所述，本研究從玉米中克隆到一個具有提高植物耐鹽性的基因,進(jìn)一步研究表明可能通過和信號通路來行使功能。研究結(jié)果為玉米耐鹽性遺傳改良提供了新基因，對玉米耐鹽新種質(zhì)的創(chuàng)建具有重要的指導(dǎo)意義。

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Overexpression of maizegene enhances salt stress tolerance in transgenic

WANG Long, CHEN Yirong, YU Wei, LIU Yuqing, LI Aiqi, WU Jiandong

(National Engineering Laboratory of Crop Stress Resistance Breeding, Anhui Agricultural University, Hefei 230036)

The purpose of this study was to clone the gene of salt-stress correlative (from maize and analyze the molecular features and biological function of salt tolerance in. The full length ofwas cloned from maize B73 and protein sequence was compared and aligned with ZmSC1 homologs in other species. In addition, the mRNA level was measured using qRT-PCR under the treatment of NaCl, and the protein localization of ZmSC1 in tobacco leaves was analyzed.gene was transferred intomutant and wild-type plants, and its effects on the seed germination rates and primary root length were analyzed. The expression level changes of stress-related genes inoverexpressing transgenic lines were analyzed under the treatment of 140 mmol·L-1NaCl. As results, the full length ofwas 423 bp, encoding 141 amino acids. Protein sequence alignment revealed that ZmSC1 had high conservation with TaSC1 and AtSC1, which are known to be involved in salt stress responses. Transient expression of the-GFP in tobacco leaf epidermal cells showed a membrane localization of ZmSC1. The pCAMBIA1301-ZmSC1 vector was constructed and further transferred into, and then the complemental lines formutant and overexpressingtransgenic lines were obtained. Under the treatment of 140 mmol·L-1NaCl, the results showed that complemental lines had higher seeds germination rate and primary root length than the mutant, suggesting thatcan rescue the phenotype ofmutant. In addition, the overexpressingtransgenic lines showed higher seed germination rate and longer primary roots than the wild type. Moreover, the higher expression level of stress-related genes (,,and) in overexpressingtransgenic lines were detected than the wild type. In conclusions, the result showed thatgene, a homologous gene ofand, can play an important role in improving salt tolerance of.

maize;; mutants; overexpression; salt stress tolerance

S513

A

1672-352X (2022)05-0694-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20221111.002

2022-11-14 10:54:49

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20221111.1101.004.html

2022-01-01

安徽省自然科學(xué)基金(2008085MC70)和安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究項目（KJ2021A0172）共同資助。

王 龍，碩士研究生。E-mail：wl15255636163@163.com

武健東，副教授。E-mail：wujiandong@ahau.edu.cn