玉米醇溶蛋白/多糖基復(fù)合抗菌膜的制備及性能表征

王欣卉， 程 紅， 陳佳鵬， 王韻儀， 任 健， 宋春麗， 宋雪健

(齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1，齊齊哈爾 161006) (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院2，大慶 163319)

玉米黃粉是利用玉米在釀酒、制備淀粉糖等精深加工過(guò)程中產(chǎn)生的富含蛋白質(zhì)廢料，目前，常將含有60%蛋白質(zhì)的玉米黃粉作為動(dòng)物飼料的，導(dǎo)致其應(yīng)用附加值極低[1]。玉米黃粉中的50%～70%的蛋白質(zhì)為Zein，它是多種蛋白組成的混合物，平均分子質(zhì)量為25～45 ku，主要包括α-玉米醇溶蛋白、β-玉米醇溶蛋白、γ-玉米醇溶蛋白及δ-玉米醇溶蛋白，其中α-玉米醇溶蛋白占比75%～85%，易溶于95%的乙醇；β-玉米醇溶蛋白占比10%～15%，易溶于60%的乙醇，其余2種蛋白含量相對(duì)較低[2]。Zein作為食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)定的食品加工原料，其分子間的二硫鍵和疏水性氨基酸構(gòu)成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，具有良好的生物相容性、可降解、溶解性及成膜性[3]。因此，Zein多被應(yīng)用于醫(yī)療、食品、包埋等領(lǐng)域[4-6]。目前玉米醇溶蛋白的制備工藝主要有冷凍沉淀技術(shù)、凝膠色譜法、超臨界CO2萃取技術(shù)、膜分離技術(shù)等[7]。

玉米醇溶蛋白因其無(wú)毒無(wú)害、透明、阻油、防紫外線、不需要交聯(lián)劑可以單獨(dú)成膜，是理想的綠色環(huán)保包裝材料，但是以單一成分制備的玉米醇溶蛋白膜，脆性和穩(wěn)定性價(jià)差。因此，對(duì)玉米醇溶蛋白膜的改性研究極為重要。甘油等低分子質(zhì)量增塑劑能夠在一定程度上降低玉米醇溶蛋白膜中聚合物分子間的作用力，進(jìn)而增加膜的柔韌性，改善膜的易脆性[8]。多糖類物質(zhì)因其容易獲取，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，易于成膜等優(yōu)點(diǎn)而常被應(yīng)用于復(fù)合膜的改性研究中。將玉米醇溶蛋白和殼聚糖進(jìn)行復(fù)合制備的薄膜具有較好的阻隔性和力學(xué)性能，玉米醇溶蛋白還可以改善明膠膜的延展性[9,10]。黃煜凱[11]研究發(fā)現(xiàn)隨殼聚糖濃度的增大Zein/殼聚糖復(fù)合膜的水蒸氣透過(guò)率呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)。在殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%時(shí)，復(fù)合膜的水蒸氣透過(guò)率達(dá)到最低值，因此可以根據(jù)殼聚糖的濃度來(lái)改良玉米醇溶蛋白膜水蒸氣透過(guò)性。王大鵬等[12]研究發(fā)現(xiàn)隨著明膠濃度的增加，Zein/明膠納米纖維的直徑的增加顯著增加。進(jìn)而說(shuō)明了利用明膠對(duì)Zein進(jìn)行改性后的復(fù)合膜在生物活性傳遞及對(duì)抗菌劑的控釋方面具有潛在的應(yīng)用前景。

天然生物抗菌劑納他霉素(Natamycin)和乳酸鏈球菌素(Nisin)具有高效、廣譜、安全的抑菌功能，被廣泛應(yīng)用于抗菌膜的研究中。Mo等[13]制備了負(fù)載納他霉素的玉米醇溶蛋白/酪蛋白復(fù)合納米顆粒，并將其加入明膠膜中，以改善膜的物理化學(xué)和抗真菌性能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該抗菌膜對(duì)黑曲霉、灰霉病菌和桔青霉具有較強(qiáng)的抗真菌活性。Hager等[14]將Nisin添加到Zein中制備成涂膜液，對(duì)魚(yú)片進(jìn)行保鮮研究發(fā)現(xiàn)，在保藏期內(nèi)該方法可以有效地減低魚(yú)片中李斯特菌的滋生。納他霉素對(duì)真菌具有一定的抑制作用，但對(duì)細(xì)菌并無(wú)抑菌效果，而Nisin對(duì)細(xì)菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)具有應(yīng)的高效的抑制效果，而導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的微生物包括細(xì)菌和真菌，因此對(duì)其共同抑制來(lái)延長(zhǎng)食品的貨架期極為重要。因此，研究采用玉米醇溶蛋白作為主要的成膜基材，通過(guò)與多糖類物質(zhì)瓊脂和卡拉膠進(jìn)行復(fù)配，并將天然生物抗菌劑納他霉素和Nisin作為抗菌劑來(lái)制備綠色環(huán)?？咕b材料，有利于拓寬玉米醇溶蛋白的開(kāi)發(fā)與利用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

玉米醇溶蛋白粉(含蛋白質(zhì)92.3%)、瓊脂、卡拉膠、甘油、納他霉素、乳酸鏈球菌素、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、無(wú)籽葡萄。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

XLW型智能電子拉力試驗(yàn)機(jī)， BYT-B1型透氣性測(cè)試儀，TSY-T1H透濕性測(cè)試儀， THZ-82A水浴恒溫振蕩器， LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，CR-400/410色彩色差儀， DMN型光澤度儀， WGT-S透光率/霧度測(cè)定儀， 2WAJ阿貝折射儀。

1.3 復(fù)合抗菌膜的制備

玉米醇溶蛋白膜的制備參考任聰?shù)萚15]研究方法。實(shí)驗(yàn)采用2%(單一干物質(zhì)占乙醇溶液的比例，下同)的玉米醇溶蛋白，1%的甘油，0.25%的明膠，0.02%的納他霉素，0.05%的乳酸鏈球菌素，分別與1%的卡拉膠、1%的瓊脂及1%的瓊脂/卡拉膠(1∶1)在80 ℃的水浴條件下，用200 mL體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇溶液進(jìn)行共混，待其充分溶解后流延于23×30 cm的玻璃板上，并于37 ℃的條件下干燥10 h，進(jìn)而來(lái)制備玉米醇溶蛋白-卡拉膠復(fù)合抗菌膜(Ze-CA)，玉米醇溶蛋白-瓊脂復(fù)合抗菌膜(Ze-AG)，玉米醇溶蛋白-卡拉膠/瓊脂復(fù)合抗菌膜(Ze-CA/AG)，將制備好的復(fù)合抗菌膜于30%～50%的相對(duì)濕度條件儲(chǔ)藏。

1.3.1 復(fù)合抗菌膜的性能表征1.3.1.1 厚度測(cè)試

1.3.1.2 水溶性測(cè)試

在60 ℃的條件下將復(fù)合抗菌膜裁剪成2 cm×2 cm大小的正方形干燥至恒質(zhì)量M1，置于50 mL的蒸餾水中，浸泡15 h后取出，并于60 ℃的條件干燥至恒質(zhì)量M2，根據(jù)式(1)得出復(fù)合膜的水溶性(W)[17]。

(1)

1.3.1.3 溶脹度測(cè)試

將復(fù)合抗菌膜裁剪成2 cm×2 cm大小的正方形，稱質(zhì)量m1，將其置于50 mL的蒸餾水中，靜置5 h，取出復(fù)合膜用濾紙吸干表面的水分，稱質(zhì)量m2。根據(jù)式(2)進(jìn)行計(jì)算溶脹度(S)[18]。

(2)

1.3.1.4 機(jī)械性能測(cè)試

實(shí)驗(yàn)采用ASTM D882-09的標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)合電子拉力機(jī)對(duì)復(fù)合膜的機(jī)械性能進(jìn)行測(cè)定[19]，將膜制成2 mm×100 mm的樣品，初始夾距為50 cm，上升速度為25 mm/min。

抗拉強(qiáng)度(TS)=

(3)

斷裂伸長(zhǎng)裂伸(EA)=

(4)

1.3.1.5 透氧性能測(cè)試

參考GB/T 1038—2000壓差法對(duì)復(fù)合膜進(jìn)行測(cè)試[20]。

1.3.1.6 透濕量的測(cè)試

將復(fù)合膜裁剪成直徑為100 mm的圓形，參考GB/T 16928—1997[21]中的方法對(duì)膜的透濕量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.1.7 透光率及霧度測(cè)試

將復(fù)合膜裁剪成50 mm×50 mm的正方形，用夾具固定，根據(jù)GB/T 2410—2008[22]對(duì)其進(jìn)行測(cè)試。

1.3.1.8 光澤度測(cè)試

選取入射角度為75°的光澤度測(cè)試儀，根據(jù)GB/T 8941—2007進(jìn)行測(cè)試，標(biāo)準(zhǔn)板進(jìn)行標(biāo)定處理差值在1.2 Gs之內(nèi)即可[23]。

1.3.1.9 色差測(cè)試[24]

利用色差儀對(duì)復(fù)合膜的顏色進(jìn)行測(cè)定，L*為亮度，a*為發(fā)紅度，b*為發(fā)黃度，ΔE為總色差，其中標(biāo)準(zhǔn)版中L*=94.30、a*=0.31、b*0.32。根據(jù)式(5)進(jìn)行計(jì)算。

(5)

1.3.2 復(fù)合膜抑菌功能的研究1.3.2.1 抑制真菌實(shí)驗(yàn)

取保存好的黑曲霉菌種和根酶菌菌種，利用PDA固體培養(yǎng)基進(jìn)行活化3代，用0.9%NaCl溶液將菌落濃度稀釋至106cfu/g，并接種于PDA固體培養(yǎng)基上。將復(fù)合抗菌膜裁剪為6 mm的圓形，置于培養(yǎng)基中間，于28 ℃的條件下培養(yǎng)48 h，利用游標(biāo)卡尺對(duì)抑菌圈直徑進(jìn)行測(cè)量。

1.3.2.2 抑制細(xì)菌實(shí)驗(yàn)

取保存好的金黃色葡萄球菌菌種和大腸桿菌菌種，利用LB肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行活化3代，同上將其稀釋至106cfu/g，取1 mL菌液于100 mL肉湯培養(yǎng)基中。將復(fù)合抗菌膜裁剪為2 cm×2 cm的形狀，浸沒(méi)于培養(yǎng)基中，在37 ℃的條件下培養(yǎng)，分別在0、4、6、8、10、12、24 h時(shí)刻吸取培養(yǎng)液，在波長(zhǎng)為600 nm對(duì)其吸光度值進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)吸光度的大小來(lái)表示細(xì)菌菌落數(shù)量，兩者成正相關(guān)[25]。

1.4 復(fù)合膜的保鮮研究

分別將Ze-CA膜、Ze-AG膜、Ze-CA/AG膜制備成18 cm×25 cm的袋子，將100 g無(wú)籽葡萄裝入其中，用雙面膠進(jìn)行封口處理，每粒葡萄保留根部，并設(shè)置空白組(CK)進(jìn)對(duì)照，將葡萄置于20 ℃的條件下儲(chǔ)藏，每隔1 d進(jìn)行取樣。

1.4.1 失重率的測(cè)定

失重率的測(cè)定采用式(6)進(jìn)行計(jì)算[26]。

(6)

1.4.2 硬度的測(cè)定

利用 GY-4 型果實(shí)硬度計(jì)對(duì)果實(shí)的正反兩面進(jìn)行測(cè)定，取平均值[27]。

1.4.3 可溶性固形物含量的測(cè)定(SSC)的測(cè)定

將果實(shí)中部果肉榨汁過(guò)濾，將汁液置于阿貝折射儀上對(duì)SSC進(jìn)行測(cè)定[28]。

1.4.4 可滴定酸含量的測(cè)定(TAC)

參照GB/T 12456—2008對(duì)水果的可滴定酸含量進(jìn)行測(cè)定[29]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20.0軟件結(jié)合Duncan計(jì)算方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05表示差異顯著。所有指標(biāo)均測(cè)量3次取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合抗菌膜的性能表征分析

2.1.1 厚度分析

如圖1所示，不同種復(fù)合抗菌膜的厚度值存在顯著性差異(P<0.05)，可能是由于AG分子與Zein分子復(fù)合較好且CA分子與AG分子存在排斥現(xiàn)象，使其所有分子不能均勻分布在一個(gè)平面，進(jìn)而導(dǎo)致Ze-CA/AG膜厚度最大，而Ze-AG膜厚度最小。

注：柱形圖上的字母表示不同復(fù)合膜之間的差異性，字母相同表示差異不顯著，字母不同表示差異顯著，下同。圖1 不同種復(fù)合抗菌膜的厚度

2.1.2 水溶性及溶脹度分析

水溶性和溶脹度是包裝材料的重要性質(zhì)，是反應(yīng)包裝材料遇到水分子后的表現(xiàn)制指標(biāo)，水溶性可以用于衡量復(fù)合膜是否有利于降解，溶脹度可以體現(xiàn)對(duì)水分子的控制能力[30]。由圖2可知，不同種復(fù)合抗菌膜的水溶性存在顯著性差異(P<0.05)，Ze-AG的水溶性及溶脹度最低，說(shuō)明該膜的內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)緊密，分子間作用力強(qiáng)，水分子對(duì)其影響較小，相反水分子對(duì)Ze-CA膜的影響較大[31]。王鍵等[32]在水浴為80 ℃的條件下，利用80%乙醇對(duì)玉米醇溶蛋白、甘油、檸檬酸進(jìn)行溶解得到的復(fù)合膜表面光滑、柔軟，水溶性達(dá)到24.6%，實(shí)驗(yàn)制備的Ze-AG膜的水溶性與其接近。

圖2 不同種復(fù)合抗菌膜的水溶性及溶脹度

2.1.3 機(jī)械性能分析

復(fù)合膜的機(jī)械性能對(duì)于其應(yīng)用領(lǐng)域極為重要，抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率在一定程度上呈反比關(guān)系，復(fù)合膜的厚度對(duì)于機(jī)械性能也有一定的影響，在一定的厚度范圍內(nèi)，厚度越大機(jī)械強(qiáng)度越大[33]。實(shí)驗(yàn)制備的Ze-AG膜與其他復(fù)合膜相比較具有較強(qiáng)的抗拉強(qiáng)度，其抗拉強(qiáng)度為(7.12±0.91)MPa，主要因?yàn)閆e-AG膜分子間氫鍵、離子鍵、二硫鍵的相互作用力大[11]。不同復(fù)合抗菌膜的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率均存在顯著性差異(P<0.05)。劉校男等[34]利用料液比為1∶10的Zein和80%乙醇，甘油質(zhì)量為Zein的20%制備的復(fù)合抗菌膜的拉伸強(qiáng)度為7.6 MPa，試驗(yàn)制備的Ze-AG抗拉強(qiáng)度與其較為一致。

圖3 不同種復(fù)合抗菌膜的機(jī)械性能

2.1.4 透氧及透濕分析

透氧系數(shù)的大小與復(fù)合膜的透氣性能成正比，透氧能力也是食品包裝中最重要的參數(shù)之一，主要由于食品中存在的氧通常與氧化現(xiàn)象有關(guān)[35]。根據(jù)透氧系數(shù)可以設(shè)定被包裝食品的周?chē)鷼怏w環(huán)境，使其達(dá)到最適的氣體濃度。由圖4可知不同復(fù)合抗菌膜的透氧系數(shù)存在顯著性差異(P<0.05)，Ze-CA膜的透氧系數(shù)最大，說(shuō)明分子間的“孔隙”較大，而Ze-AG膜分子間的“孔隙”較小，進(jìn)一步表明Ze-AG膜分子間的作用力大。對(duì)氧氣的阻隔性較強(qiáng)。根據(jù)上述的溶脹度結(jié)果可知，復(fù)合膜具有較強(qiáng)的持水性能，因此采用減重法對(duì)復(fù)合膜的透濕量進(jìn)行測(cè)定，大部分的水都被復(fù)合膜所吸收，只有極少數(shù)的水分透過(guò)復(fù)合膜，因此3種復(fù)合抗菌膜的透濕量不存在顯著性差異(P>0.05)。

圖4 不同種復(fù)合抗菌膜的透氧系數(shù)及透濕量

表1 不同復(fù)合膜的光學(xué)性能分析

2.1.5 光學(xué)性能分析

包裝材料的顏色是食品包裝中的關(guān)鍵參數(shù)，直接影響消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品的接受程度。由表1可知，Ze-AG膜的亮度要明顯優(yōu)于其他2組，主要是由于Ze-AG膜的分子間各組分融合度較好，排列較為均勻、緊密，并且光澤度也高達(dá)(52.80±2.17)Gs，從而進(jìn)一步證明了Ze-AG膜的機(jī)械性能高于其他組別的原因。因?yàn)閆ein中含有一定的玉米黃素，導(dǎo)致主體顏色為黃色，并且在成膜基材中所占比較大，所以復(fù)合膜的總體顏色呈現(xiàn)出黃色。一般情況下，包裝材料的透光率和霧度成反比關(guān)系，Ze-AG膜的透光率為(25.40±1.00)%，而馬中蘇等[36]制備的肉桂醛-濃縮乳清蛋白-殼聚糖復(fù)合抗菌膜的透光率為(57.66%±0.03)%，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因是由于復(fù)合膜的整體顏色所引起的，因此在今后的研究中需要對(duì)復(fù)合膜進(jìn)行脫色處理。

2.2 復(fù)合膜的抑菌性分析

食品的腐敗變質(zhì)主要是微生物導(dǎo)致的，因此在食品的流通過(guò)程中對(duì)微生物的控制極為重要。試驗(yàn)制備的復(fù)合抗菌膜能有效地抑制微生物的滋生，如圖5～圖7所示。Ze-CA/AG膜對(duì)真菌的抑制效果要明顯優(yōu)于其他處理組，主要由于Ze-CA/AG膜分子對(duì)于抗菌劑分子的作用力小，抗拉強(qiáng)度低，使其很容易被“釋放”出來(lái)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的抑制，其中對(duì)黑曲霉和根霉的抑菌直徑為(35.155±0.85)、(23.17±0.94)mm，同時(shí)Ze-CA/AG膜對(duì)細(xì)菌的抑制效果也較高。彭新玲[37]制備的負(fù)載納他霉素的玉米醇溶蛋白/酪蛋白納米復(fù)合膜能有效地抑制黑曲霉的滋生。孫海濤[38]制備的玉米磷酸酯淀粉/秸稈納米纖維素/聚乙二醇膜/Nisin/ε-聚賴氨酸復(fù)合膜能有效地抑制大腸桿菌的滋生。這與本試驗(yàn)制備的復(fù)合抗菌膜的抑菌性一致。

圖5 不同復(fù)合抗菌膜的抗真菌圈直徑

圖6 不同復(fù)合抗菌膜對(duì)大腸桿菌的抑制效果

圖7 不同復(fù)合抗菌膜對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果

2.3 復(fù)合抗菌膜的保鮮效果分析

2.3.1 不同復(fù)合抗菌膜對(duì)葡萄失重率的影響

葡萄失重率是衡量葡萄品質(zhì)的重要指標(biāo)，同時(shí)水分也是影響葡萄口感的重要因素。由圖8可知，葡萄失重率隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，對(duì)于減緩葡萄失重率的增加復(fù)合膜組要明顯優(yōu)于空白組，并且在保鮮期內(nèi)失水率Ze-CA/AG膜組

圖8 不同復(fù)合抗菌膜對(duì)葡萄失重率的影響

2.3.2 不同復(fù)合抗菌膜對(duì)葡萄硬度的影響

葡萄果實(shí)的硬度可以直接影響到消費(fèi)者的需求，同時(shí)也在其流通過(guò)程中，對(duì)其品質(zhì)的評(píng)價(jià)提供了重要的參考依據(jù)。由圖9可知，在儲(chǔ)藏第6天時(shí)Ze-CA/AG膜組的果實(shí)硬度最大為(6.52±0.21)kg/cm2，而其他實(shí)驗(yàn)組在控制果實(shí)硬度下降也要好于空白組，硬度值的降低比例較小。原因可能是復(fù)合膜可以抑制葡萄的呼吸作用，減緩了葡萄果實(shí)中呼吸作用底物有機(jī)酸的消耗[40]。

圖9 不同復(fù)合抗菌膜對(duì)葡萄硬度的影響

2.3.3 不同復(fù)合抗菌膜對(duì)葡萄可溶性固形物含量的影響

SSC是指溶容性糖類物質(zhì)或其他可溶性物質(zhì)，其含量的高低可以評(píng)價(jià)果實(shí)的品質(zhì)。由圖10可知，隨著水分的流失及果實(shí)的進(jìn)一步成熟，SSC含量會(huì)存在小幅度的上升而后開(kāi)始下降。Ze-CA膜組SSC下降的比例最小為19.82%，Ze-CA/AG膜組次之為26.11%，Ze-AG膜組為29.47%，CK組最大為42.35%。復(fù)合膜能抑制葡萄果實(shí)進(jìn)行無(wú)氧呼吸，減緩糖酵解途徑的發(fā)生，使干物質(zhì)消耗量減少[41]。

圖10 不同復(fù)合抗菌膜對(duì)葡萄SSC的影響

2.3.4 不同復(fù)合抗菌膜對(duì)葡萄可滴定酸含量的影響

TAC是指葡萄中的游離態(tài)的酸，是葡萄品質(zhì)的重要構(gòu)成性狀之一，是影響其果實(shí)風(fēng)味及品質(zhì)的重要因素[42]。由圖11可知，相比較CK組，復(fù)合抗菌膜能有效地減緩葡萄中TAC的降低，復(fù)合膜中的抗菌劑可以有效抑制葡萄腐敗菌的滋生，減緩組織氧化分解速度和可滴定酸的消耗。

圖11 不同復(fù)合抗菌膜對(duì)葡萄TAC的影響

3 結(jié)論

Zein具有來(lái)源廣泛、易于成膜等優(yōu)良的理化性能，因此，研究采用2%的Zein，1%的甘油，0.25%的明膠，分別與1%的卡拉膠、1%的瓊脂及1%的卡拉膠/瓊脂進(jìn)行共混制備復(fù)合膜，并且為了提升復(fù)合膜的保鮮效果，向成膜組分中加入了0.02%的Natamycin，0.05%的和Nisin，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)制備的Ze-CA膜、Ze-CA/AG膜及Ze-AG膜具有較好的機(jī)械性能、阻隔性能和光學(xué)性能等理化指標(biāo)，同時(shí)還能有效地抑制黑曲霉、根霉、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的滋生，Ze-CA/AG膜的抑菌效果要好于其他2組復(fù)合膜。試驗(yàn)將復(fù)合膜應(yīng)用于葡萄的保鮮研究中發(fā)現(xiàn)，3種復(fù)合膜都能有效地減緩果實(shí)失重率的增加及硬度值、SSC、TAC的下降，有利于延長(zhǎng)葡萄的貨架期。接下來(lái)將對(duì)玉米醇溶蛋白/多糖/天然生物抗菌劑復(fù)合膜的微觀結(jié)構(gòu)及抗菌劑的遷移機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。