茶皂素分離及脫皂茶粕生物發(fā)酵飼料的工藝條件優(yōu)化

王丹媚， 張雅琦， 金 華， 盛可欣， 汪 妍， 黃瑞婷， 李春俁， 張曉菲， 饒米德， 劉 鵬

(浙江師范大學化學與生命科學學院, 金華 321004)

油茶(CamelliaoleiferaAbel.)屬于山茶科(Theaceae Mirb.)、山茶屬(CamelliaL.)的常綠灌木植物[1]，其種子含油30%以上，不飽和脂肪酸質量分數(shù)高達90%，遠遠高于菜油、花生油和豆油，與橄欖油比維生素E含量高1倍，并含有山茶甙等特定生理活性物質，具有極高的營養(yǎng)價值[2,3]。油茶的根、莖、葉、種子均可入藥，其藥用功能主要為清熱解毒、活血散瘀、止痛等[4]。此外，茶籽粕中含有茶皂素、茶籽多糖、茶籽蛋白等，它們都是化工、輕工、食品、飼料工業(yè)產(chǎn)品等的原料[5]。

目前，對油茶的利用僅停留在榨油及茶皂素的粗略提取上，而含有豐富纖維素和蛋白質的茶粕多作為燃料和清塘劑[6]，未能充分開發(fā)出有效價值，造成資源的嚴重浪費?，F(xiàn)有的茶皂素提取方法如有機溶劑法、超聲波輔助法、超臨界法等[7]，大多存在提取率低、工藝復雜等問題，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。微波輔助法在乙醇/水溶液提取法的基礎上增加了微波萃取這一環(huán)節(jié)，通過增大茶皂素的溶解度來提高提取率，可在一定程度上緩解上述問題[8]。

黑曲霉(Aspergillusnigerv.Tiegh)是一類環(huán)境友好型工業(yè)發(fā)酵菌種，可產(chǎn)生纖維素酶、果膠酶等多種酶[9]，有效降解茶皂素等生物質[10]，在飼料前期脫毒處理中具有重要意義。地衣芽孢桿菌作為一種土壤中常見的兼氧型革蘭氏陽性菌[8]，對抗營養(yǎng)因子有拮抗作用[12]，可有效促進機體吸收營養(yǎng)物質，進而顯著降低養(yǎng)殖的飼料系數(shù)，提高經(jīng)濟效應[13]。

目前，國內外對脫皂茶粕生物發(fā)酵飼料的應用探究較少，鮮見采取混菌二段式發(fā)酵的相關報道。將油茶籽粕提取茶皂素的同時加工殘渣為飼料，不僅可有效減輕環(huán)境污染，也避免了資源浪費。因此，本研究以油茶粕為實驗對象，采用微波輔助法提取茶皂素，利用黑曲霉進行脫毒前處理，并通過地衣芽孢桿菌發(fā)酵成優(yōu)質飼料，探索其最佳工藝，為提高茶粕的利用價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

茶皂素標準品品(純度：HPLC≥98%)，其他試劑均為分析純，油茶籽粕，地衣芽孢桿菌種子液(23074，24236，24581)。

1.2 儀器與設備

SPARK 10M型酶標儀，G-16C型臺式高速離心機，SB120DT型超聲波清洗機，D-1型自動控制壓力蒸汽滅菌鍋。

1.3 實驗設計

采用醇提法結合微波輔助提取供試油茶籽粕中的茶皂素，通過提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)、時間(30、60、90、120、150、180 min)、料液比(1∶6、1∶9、1∶12、1∶15、1∶18)、乙醇體積分數(shù)(40%、50%、60%、70%、80%)和微波功率(400、600、1 000 W)5個單因素結合響應面分析法，探究油茶籽粕中茶皂素的最佳提取工藝。

利用黑曲霉進行飼料脫毒前處理，根據(jù)定性分析結果篩選出降解茶皂素能力較強的黑曲霉，并對時間(4、6、8、10、12 d)、溫度(25、30、35、40、45 ℃)、pH(3、4、5、6、7)和接種質量分數(shù)(3%、5%、8%、10%、15%)等因素進行優(yōu)化；在地衣芽孢桿菌菌種配對的基礎上，以產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶能力為指標篩選出高產(chǎn)菌株，設置時間(12、24、36、48、60 h)、溫度(35、40、45 ℃)、轉速(120、150、180 r/min)為主要影響因素進行產(chǎn)酶條件優(yōu)化。確定最佳時間(1、2、3、4、5 d)、pH(5、6、7、8、9)、溫度(25、30、35、40、45 ℃)和接種質量分數(shù)(1%、2%、4%、6%、8%)等因素對脫皂茶粕發(fā)酵成飼料的影響。結合響應面優(yōu)化模擬真實胃環(huán)境中飼料的消化情況，以糖和蛋白的消化率為指標確定最佳工藝條件。

1.4 實驗方法

應用醇提法[14]和微波輔助乙醇法[15]提取茶籽餅粕中茶皂素；香草醛-濃硫酸顯色法[16]測定茶皂素含量；紫環(huán)(Molish)反應[17]、發(fā)泡實驗和溶血試驗[18]測定發(fā)酵產(chǎn)物中殘留茶皂素含量以篩選黑曲霉菌種；福林酚法(Lowry)[19]測定蛋白酶活性；Yoo改良法[20]測定α-淀粉酶酶活力；蒽酮比色定糖法[21]測定糖含量；考馬斯亮藍顯色法[22]測定蛋白質含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

單因素實驗數(shù)據(jù)使用Excel 2016，GraphPad Prism 6軟件進行處理，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(Standard Deviation，SD)差異顯著性分析使用 SPSS 21.0 軟件進行，不同字母表示顯著差異(P<0.05)，響應面法實驗數(shù)據(jù)使用Design Expert 8.0.6軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 茶皂素提取工藝優(yōu)化

2.1.1 提取條件對茶皂素得率的影響

由圖1可得，茶皂素的得率隨溫度的升高顯著增大，在70 ℃時達到最佳，隨后迅速下降。在浸提時間為30～150 min時，得率波動較小，在60 min時達最大。以料液比1∶12為界點，得率向兩端逐漸降低。皂苷得率隨著乙醇體積分數(shù)的增加顯著提高，超過60%后趨于穩(wěn)定，在70%達到最大。在微波功率400～1 000 W范圍內，600 W時得率最大。綜上，茶皂素提取最佳各單因素條件分別為溫度70 ℃、時間60 min、料液比1∶12、乙醇體積分數(shù)70%和微波功率600 W。

圖1 溫度、時間、料液比、乙醇體積分數(shù)及微波功率對茶皂素得率的影響

2.1.2 茶皂素提取工藝響應面優(yōu)化

結合單因素實驗結果，利用響應面實驗對各參數(shù)進行優(yōu)化。溫度、時間、料液比、乙醇體積分數(shù)4個因素中，乙醇體積分數(shù)和料液比的響應曲面較其余因素更為陡峭，說明兩者對茶皂素得率影響更為顯著。4種影響因素的優(yōu)化值分別為溫度71 ℃、時間66 min、料液比1∶12、乙醇體積分數(shù)70%，在此條件下以600 W微波輔助提取，茶皂素得率可達9.31%。

2.2 油茶籽粕脫毒

2.2.1 黑曲霉菌種篩選

相同條件下黑曲霉AU3與ZZ-5發(fā)酵產(chǎn)物所得氣泡的綿密度和高度均存在較大差異，AU3的氣泡綿密度更低且高度在5～10 d 下降56.58%，10～15 d下降39.39%，茶皂素含量在此發(fā)酵過程中經(jīng)歷了快速減少到緩慢減少的過程，不同于ZZ-5的氣泡高度一直緩慢降低。Molish反應的紫環(huán)顏色是判斷茶皂素含量的重要指標[23]，發(fā)酵后AU3所得紫色環(huán)顏色較同期ZZ-5更淺且更小。因此，黑曲霉AU3對茶皂素的降解效果優(yōu)于菌種ZZ-5。

2.2.2 不同因素對茶皂素降解率的影響

選取黑曲霉AU3進行茶皂素降解單因素實驗，結果如圖2。黑曲霉可在10 d內有效降解茶籽餅粕中的茶皂素，發(fā)酵天數(shù)大于10 d時，黑曲霉降解率基本不變，因此最佳發(fā)酵時間為10 d。溫度為35、40 ℃時茶皂素脫除率達最高，溫度過高或過低時黑曲霉降解效果明顯減弱，綜合考慮最佳發(fā)酵溫度為35 ℃。pH為 6時降解效果最好，過酸或過堿的環(huán)境均導致降解率下降，因此最佳發(fā)酵pH為6。隨接種量的增加，茶皂素脫除率先上升后下降，在10%時達到最大，由此得出最佳黑曲霉接種質量分數(shù)為10%。

圖2 不同因素下黑曲霉降解茶皂素的發(fā)泡情況

2.2.3 黑曲霉降解茶皂素響應面優(yōu)化

經(jīng)響應面優(yōu)化，選擇3種較優(yōu)方案進行實驗，分別為pH 6，接種質量分數(shù)10%，溫度35 ℃，培養(yǎng)11 d；pH 6.5，接種質量分數(shù)12%，溫度37.5 ℃，培養(yǎng)12 d；pH 6.5，接種質量分數(shù)10%，溫度37.5 ℃，培養(yǎng)10 d。結果表明：發(fā)酵時間12 d、溫度37.5 ℃、pH 6.5、接種質量分數(shù)12%的條件下，茶皂素含量可降解至0.188%，降解率達94.91%。

表1 不同方案下剩余茶皂素含量(平均值±標準誤)

2.3 地衣芽孢桿菌發(fā)酵

2.3.1 地衣芽孢桿菌產(chǎn)酶菌種篩選

透明圈與菌落的平均直徑比值(D/d)，在一定程度上反映了菌株產(chǎn)酶活力的大小[24]。通過測量不同培養(yǎng)基中透明圈及菌落直徑得到D/d，地衣芽孢桿菌XJ423和B2在產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶能力上分別具有較大優(yōu)勢。且兩種菌在同一培養(yǎng)基上生長趨勢相似，由此確定地衣芽孢桿菌XJ423和B2為后續(xù)脫皂茶粕的發(fā)酵菌種。

2.3.2 最適產(chǎn)酶條件確定

選取地衣芽孢桿菌XJ423和B2進行油茶籽粕發(fā)酵的單因素實驗，以所得蛋白酶和淀粉酶活性之和作為衡量指標進行綜合比較，結果如表2所示，在產(chǎn)酶時間為36 h、溫度為40 ℃、轉速為150 r/min時兩值之和最大，說明該條件下菌綜合產(chǎn)酶能力最強。

表2 不同時間、溫度、轉速下蛋白酶和淀粉酶的活力(平均值±標準誤)

2.3.3 各因素對發(fā)酵茶粕糖、蛋白含量的影響

蛋白含量和糖含量是衡量高品質飼料的重要營養(yǎng)參數(shù)[25]，將菌種接種到油茶籽粕培養(yǎng)基中進行發(fā)酵條件的單因素實驗，對反應所得產(chǎn)物中的蛋白含量、糖含量進行測定，結果如圖3。各組蛋白及糖含量均呈先上升后下降的趨勢，可得最佳發(fā)酵時間為4 d、pH為7、接種質量分數(shù)為2%、溫度為35 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度、時間、pH、接種量對發(fā)酵茶粕糖含量和蛋白含量的影響

2.3.4 發(fā)酵條件響應面優(yōu)化

時間、pH、接種量、溫度4因素中，溫度和pH的響應面圖弧度較大，表明二者對茶粕發(fā)酵后蛋白質含量影響較大，接種比的響應面最為平坦，說明其對發(fā)酵茶粕蛋白質含量影響最小。由響應面優(yōu)化法預測發(fā)酵條件為時間3.6 d、pH 7.1、接種質量分數(shù)5%、溫度34 ℃時，發(fā)酵茶粕中糖含量最高；發(fā)酵條件為時間3.4 d、pH 6.6、接種質量分數(shù)6%、溫度32 ℃時，蛋白質含量最高。對兩方案進行實驗，結果表明：發(fā)酵時間為3.6 d、pH 7.1、接種質量分數(shù)5%、溫度34 ℃時，地芽孢桿菌發(fā)酵茶粕的效果最優(yōu)，通過模擬胃消化過程，測得消化率為21.62%。

3 結論

本研究采用微波輔助提取法，通過單因素實驗及響應面優(yōu)化，確定茶皂素提取最佳工藝參數(shù)為時間62 min、溫度71 ℃、料液比1∶12、乙醇體積分數(shù)72%、微波功率600 W，此條件下茶皂素得率可達9.31%，此法可有效縮短萃取時間、提高得率，為茶皂素的高效提取提供了可行方法。

采取發(fā)泡和Molish實驗定性比較茶皂素含量，黑曲霉AU3和ZZ-5對茶皂素均有一定降解效果，其中AU3能在短時間內降解大量茶皂苷，效果明顯優(yōu)于ZZ-5，因此選用AU3參與后續(xù)實驗。通過單因素實驗及響應面優(yōu)化，確定皂苷降解最佳工藝參數(shù)為時間12 d、溫度37.5 ℃、pH 6.5、接種質量分數(shù)12%，此條件下降解率可達94.91%。

選取地衣芽孢桿菌用于脫皂茶粕發(fā)酵成飼料，根據(jù)單因素實驗和響應面優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵條件為時間3.6 d、溫度34 ℃、pH 7.1、接種質量分數(shù)5%，此條件下所得飼料中糖和蛋白質含量最高。在模擬胃消化過程中，飼料中糖及蛋白消化率達21.62%。

本實驗研究了黑曲霉及2種地衣芽孢桿菌在發(fā)酵中的最佳接種比，尋找菌的最適接入時間差，采取活體飼養(yǎng)，明確發(fā)酵效果，有利于皂素工業(yè)化生產(chǎn)和優(yōu)良蛋白飼料資源的規(guī)?；_發(fā)。