單寧酸沉淀淀粉行為的研究

劉子雋， 胡秀婷

(南昌大學(xué)食品學(xué)院，南昌 330047)

淀粉是天然可再生資源，是人類獲取能量的主要來(lái)源。由于淀粉來(lái)源豐富、價(jià)格低廉及其本身的特殊性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、食品工業(yè)、化學(xué)工業(yè)等領(lǐng)域[1]。目前，淀粉的分離純化主要依賴于沉淀法，已報(bào)道的淀粉沉淀劑主要為甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，其中，乙醇因其可食用性被廣泛使用[2]。乙醇等有機(jī)溶劑沉淀淀粉的原理在于可以改變?cè)矸廴芤后w系的極性，使淀粉在溶液中的溶解度降低，從而使沉淀析出[2]。但有機(jī)溶劑沉淀法具有沉淀效率低、成本高、安全性低(易燃易爆)等缺點(diǎn)。近年研究發(fā)現(xiàn)聚乙二醇也可作為淀粉的沉淀劑，其沉淀機(jī)理為聚乙二醇和淀粉在水溶液中具有不相容性[3,4]；雖然聚乙二醇作為固體沉淀劑其沉淀效率遠(yuǎn)高于乙醇[4]，但固體沉淀劑聚乙二醇的分子量對(duì)沉淀效果具有顯著影響，然而聚乙二醇作為聚合物，分子量分布不均一，這導(dǎo)致操作重復(fù)性較差[5]。

單寧酸是一種存在于天然植物中的多酚類化合物[6]，可通過(guò)氫鍵或疏水作用與蛋白質(zhì)分子反應(yīng)使蛋白質(zhì)沉淀，故可作為蛋白質(zhì)的沉淀劑[7,8]。此外，也有研究表明單寧酸與多糖會(huì)發(fā)生類似于與蛋白質(zhì)相同的反應(yīng)過(guò)程，使多糖沉淀析出[9]，如單寧酸對(duì)魔芋葡聚糖具有顯著的親和力，可形成不溶性沉淀[10,11]；向小麥淀粉中添加單寧酸，也可使小麥淀粉從水溶液中沉淀析出[12]。

研究表明單寧酸可能作為淀粉的沉淀劑，然而，單寧酸沉淀淀粉的過(guò)程鮮有系統(tǒng)報(bào)道。因此，本研究以淀粉得率為指標(biāo)，研究淀粉濃度、單寧酸添加量、環(huán)境溫度等因素對(duì)單寧酸沉淀淀粉過(guò)程的影響，并初步探究單寧酸沉淀淀粉的機(jī)理，為淀粉的分離純化工藝提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米淀粉(實(shí)驗(yàn)室自制)；大米淀粉(市售)；單寧酸(分析純)；鹽酸(分析純)；氫氧化鈉(分析純)；用0.2 mol/L的醋酸溶液和醋酸鈉溶液配制pH為4.0的緩沖液(現(xiàn)配現(xiàn)用)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

LXJ-IIB低速離心機(jī)，F(xiàn)LOM超純水機(jī)，SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵，F(xiàn)iveEasy Plus pH計(jì)；Bede D1 HR X射線衍射儀，MicroCal PEAQ-ITC等溫滴定量熱儀。

1.3 方法

1.3.1 淀粉濃度、單寧酸添加量對(duì)淀粉沉淀過(guò)程的影響

配制淀粉溶液：稱取一定量的淀粉，溶于緩沖液中，在90 ℃下水浴糊化1 h，得到質(zhì)量濃度為1.0%、2.0%、4.0%的淀粉溶液。

取糯米淀粉溶液與普通大米淀粉溶液，加入單寧酸粉末，使單寧酸與淀粉質(zhì)量比分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0。在室溫下磁力攪拌1 h，使單寧酸在樣品溶液中溶解完全，靜置24 h后，將樣品溶液于離心機(jī)中在8 000 r/min下離心15 min，除去上清液，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀，于烘箱55 ℃干燥24 h后稱重，計(jì)算不同質(zhì)量比下淀粉的得率。淀粉得率計(jì)算公式為：

式中：Y為淀粉沉淀得率/%；M為干燥后淀粉沉淀質(zhì)量/g；m為淀粉溶液中淀粉干基質(zhì)量/g。

1.3.2 沉淀時(shí)間對(duì)淀粉沉淀過(guò)程的影響

向質(zhì)量濃度2.0%淀粉溶液中加入單寧酸，待單寧酸充分溶解后，將淀粉-單寧酸混合體系放置于室溫下靜置2、4、8、12、24 h。將靜置不同時(shí)間的樣品溶液于離心機(jī)中在8 000 r/min下離心15 min，并用無(wú)水乙醇洗滌沉淀，于烘箱55 ℃干燥24 h后稱重，計(jì)算不同沉淀時(shí)間下的淀粉得率。

1.3.3 沉淀溫度對(duì)淀粉沉淀過(guò)程的影響

分別向質(zhì)量濃度為2.0%的糯米淀粉溶液與普通大米淀粉溶液中加入單寧酸，待其充分溶解后，分別放置于25、4 ℃下靜置24 h后，將樣品溶液于離心機(jī)中在8 000 r/min下離心15 min，并用無(wú)水乙醇洗滌沉淀，于烘箱55 ℃干燥24 h后稱重，計(jì)算不同溫度下的淀粉得率。

1.3.4 體系pH對(duì)淀粉沉淀過(guò)程的影響

向質(zhì)量濃度為2.0%的淀粉溶液，通過(guò)添加NaOH溶液或HCl溶液調(diào)節(jié)體系中的pH，使其pH的范圍為3.0～11.0，然后加入單寧酸。最后將不同pH的樣品溶液放置室溫靜置24 h，將樣品溶液于離心機(jī)中在8 000 r/min下離心15 min，并用無(wú)水乙醇洗滌沉淀，于烘箱55 ℃干燥24 h后稱重，計(jì)算不同pH條件下的淀粉得率。

1.3.5 金屬離子對(duì)淀粉沉淀過(guò)程的影響

向質(zhì)量濃度為2.0%的淀粉溶液中加入0.20 mol/L氯化鋁、硫酸亞鐵、硫酸銅、硫酸鋅溶液后再加入單寧酸，充分?jǐn)嚢枋箚螌幩崛芙馔耆?。將樣品溶液放置室溫靜置24 h后，將樣品溶液于離心機(jī)中在8 000 r/min下離心15 min，并用無(wú)水乙醇洗滌沉淀，于烘箱55 ℃干燥24 h后稱重，計(jì)算淀粉得率。

1.3.6 X射線衍射(XRD)分析

向2.0%的淀粉溶液中加入單寧酸，于室溫下靜止24 h后，置于離心機(jī)中在8 000 r/min下離心15 min后，將沉淀放于烘箱55 ℃干燥。取少量干燥后的復(fù)合物樣品充分研磨至粉末狀態(tài)，放入X射線衍射儀中進(jìn)行檢測(cè)，得到XRD圖譜。測(cè)定條件為電壓40 kV，電流40 mA。衍射角(2θ)掃描范圍設(shè)為5°～50°，步長(zhǎng)為每秒0.02°。利用Origin軟件進(jìn)行分析。

1.3.7 等溫滴定量熱(ITC)分析

采用MicroCal PEAQ-ITC測(cè)定單寧酸與普通大米淀粉、糯米淀粉的相互作用。淀粉和單寧酸均使用醋酸緩沖溶液溶解。將10 g/L的單寧酸溶液每次3 μL分13次滴入200 μL的滴定池中，該滴定池裝有pH 4.0的緩沖液或0.4 g/L的淀粉溶液。每次滴入持續(xù)24 s，每次滴定間隔時(shí)間為180 s，實(shí)驗(yàn)過(guò)程攪拌速度307 r/min。滴定池溶液的溫度設(shè)置為(25±0.1)℃。根據(jù)設(shè)置滴定時(shí)間，對(duì)每次滴加單寧酸時(shí)的吸熱或放熱的數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄。利用MicroCal PEAQ-ITC Analysis軟件計(jì)算單寧酸與淀粉相互作用的熱力學(xué)參數(shù)，建立“one set of sites”模式來(lái)擬合等溫線，該模型假設(shè)淀粉上的所有的綁定位點(diǎn)都是相同的。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉濃度、單寧酸添加量對(duì)淀粉沉淀過(guò)程的影響

圖1是在淀粉質(zhì)量濃度分別為1.0%、2.0%、4.0%時(shí)，向淀粉溶液中添加不同質(zhì)量的單寧酸后，淀粉得率的變化。如圖1所示，單寧酸添加量對(duì)淀粉得率具有顯著的影響。以淀粉質(zhì)量濃度為2.0%為例，在相同的單寧酸與淀粉質(zhì)量比條件下，單寧酸對(duì)普通大米淀粉的沉淀效果優(yōu)于糯米淀粉，這可能是因?yàn)槠胀ù竺椎矸壑兄辨満扛哂谂疵椎矸?。?duì)于普通大米淀粉，隨著單寧酸與淀粉的質(zhì)量比不斷增加，普通大米淀粉和糯米淀粉得率顯著增加，在質(zhì)量比為0.6時(shí)，普通大米淀粉得率為92.0%，而當(dāng)單寧酸與淀粉質(zhì)量比到達(dá)0.6時(shí)，進(jìn)一步添加單寧酸不會(huì)導(dǎo)致普通大米淀粉得率的顯著增加。因此，認(rèn)為在單寧酸與普通大米淀粉質(zhì)量比為0.6時(shí)，普通大米淀粉得率達(dá)到最大值。對(duì)于糯米淀粉，在質(zhì)量比為0.8時(shí)，糯米淀粉得率為86.5%，而繼續(xù)增加單寧酸與淀粉的比例，發(fā)現(xiàn)沉淀得率無(wú)顯著性增加。因此，認(rèn)為當(dāng)單寧酸與糯米淀粉質(zhì)量比為0.8時(shí)，單寧酸對(duì)糯米淀粉的沉淀效果最好。而在乙醇沉淀2.0%淀粉溶液的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在乙醇與淀粉溶液體積為5∶1時(shí)，淀粉得率達(dá)到最大值，為79.9%[13]。由此可見，單寧酸對(duì)淀粉的沉淀效率遠(yuǎn)高于乙醇。

圖1 單寧酸沉淀普通大米淀粉和糯米淀粉過(guò)程

此外，在單寧酸與淀粉質(zhì)量比為0.1～0.2的范圍內(nèi)，沉淀得率都處于較低水平，這可能是因?yàn)樵谠摲秶鷥?nèi)，淀粉與單寧酸主要形成的是可溶性復(fù)合物，而隨著單寧酸與淀粉的質(zhì)量比的進(jìn)一步增加，復(fù)合物開始聚集，并逐漸形成不溶性復(fù)合物沉淀。當(dāng)改變淀粉的質(zhì)量濃度，沉淀淀粉所需的單寧酸量亦有顯著性變化，這表明沉淀淀粉所需的單寧酸量對(duì)淀粉的質(zhì)量濃度具有依賴性。

2.2 沉淀時(shí)間對(duì)淀粉沉淀過(guò)程的影響

由圖2可知，隨著沉淀時(shí)間的增加，普通大米淀粉與糯米淀粉沉淀得率逐漸增加，即當(dāng)沉淀時(shí)間由2～6 h時(shí)，2種淀粉得率均迅速上升，并在6 h基本達(dá)到最大值；而繼續(xù)延長(zhǎng)沉淀時(shí)間，淀粉得率沒有顯著增加。因此，單寧酸沉淀淀粉最佳時(shí)間為6 h。與文獻(xiàn)報(bào)道中乙醇沉淀長(zhǎng)時(shí)間(靜置過(guò)夜或24 h)相比[14]，單寧酸沉淀淀粉效率更高。

圖2 沉淀時(shí)間對(duì)淀粉得率的影響

2.3 沉淀溫度對(duì)淀粉沉淀過(guò)程的影響

如圖3所示，在相同溫度下，普通大米淀粉的沉淀得率均高于糯米淀粉，這可能是由于普通大米淀粉與糯米淀粉中的支鏈淀粉與直鏈淀粉含量不同，導(dǎo)致2種淀粉與單寧酸結(jié)合的程度不同。當(dāng)沉淀溫度由4 ℃升至25 ℃，兩種淀粉溶液體系中的淀粉沉淀得率無(wú)顯著性差異，說(shuō)明在單寧酸沉淀淀粉過(guò)程中，溫度變化并不是影響淀粉沉淀的主要因素。但考慮能源消耗的因素，選擇25 ℃為沉淀淀粉的最佳溫度。與醇沉淀粉的過(guò)程大多都在低溫下進(jìn)行相比，單寧酸沉淀淀粉過(guò)程能量消耗更少。有研究在4 ℃和37 ℃下使用聚乙二醇沉淀淀粉時(shí)發(fā)現(xiàn)，聚乙二醇對(duì)溫度變化也不敏感，沉淀得率沒有顯著性差異[15]。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，推測(cè)這可能是固體沉淀劑的特有性質(zhì)。

圖3 不同溫度(4、25 ℃)對(duì)淀粉得率的影響

2.4 體系pH對(duì)淀粉沉淀過(guò)程的影響

如圖4所示，pH對(duì)普通大米淀粉、糯米淀粉的得率具有顯著影響，且得率都隨著pH的升高而降低。在pH 3.0～5.0條件下，淀粉得率較大，而在pH 6.0～11.0條件下，得率相比酸性條件降低。導(dǎo)致這些現(xiàn)象的原因可能是：隨pH的變化，單寧酸酚羥基的電離程度發(fā)生了改變使得沉淀過(guò)程也發(fā)生變化。研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，單寧酸質(zhì)子化程度會(huì)影響單寧酸與其他生物分子相互作用的方式和強(qiáng)度[16]。單寧酸的pKa值范圍在7.5～13.5之間，在pH 3.0～5.0條件下，單寧酸上的羥基幾乎完全被質(zhì)子化，使得淀粉與單寧酸之間的相互作用加強(qiáng)，從而使得淀粉得率增加。

圖4 pH對(duì)淀粉得率的影響

2.5 金屬離子對(duì)淀粉沉淀過(guò)程的影響

單寧酸可通過(guò)其結(jié)構(gòu)單元上的酚羥基與金屬離子進(jìn)行配位，發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，從而對(duì)單寧酸沉淀蛋白質(zhì)的過(guò)程產(chǎn)生影響[17]。因此，本文亦研究了金屬離子的添加對(duì)單寧酸沉淀淀粉影響。從圖5中可以發(fā)現(xiàn)，加入金屬離子后，普通大米淀粉和糯米淀粉的得率沒有顯著差異，這表明金屬離子的存在對(duì)單寧酸沉淀淀粉無(wú)影響。這可能是由于單寧酸與金屬離子之間的配位鍵作用并不影響單寧酸與淀粉的相互作用。

圖5 金屬離子對(duì)淀粉得率的影響

2.6 單寧酸-淀粉復(fù)合物X射線衍射分析

不同類型的淀粉具有不同的晶型，在X射線衍射圖譜中的衍射峰不同。根據(jù)其晶型主要分為四類：A型、B型、C型以及V型。A型、B型、C型圖譜在天然淀粉中比較常見，V型淀粉是一種特殊的晶型，一般是由糊化后的淀粉與小分子客體分子絡(luò)合形成，主要在7°、13°、20°出現(xiàn)衍射峰[18]。圖6為糊化后的淀粉、單寧酸、單寧酸沉淀的大米淀粉和糯米淀粉的X射線衍射圖譜。糊化后的淀粉的特征峰消失，出現(xiàn)了非晶特性；單寧酸處于無(wú)定形狀態(tài)；單寧酸沉淀的普通大米淀粉與糯米淀粉在7°、13°、20°處均未出現(xiàn)衍射峰，表明單寧酸未與淀粉形成V型復(fù)合物。多酚分子可通過(guò)疏水作用進(jìn)入淀粉的空腔內(nèi)進(jìn)行特異性結(jié)合從而形成V型復(fù)合物[18]。而淀粉與單寧酸未形成V型復(fù)合物，這表明單寧酸與淀粉可能不存在疏水相互作用。

注：a為糊化后的淀粉；b為單寧酸沉淀的糯米淀粉；c為單寧酸；d為單寧酸沉淀的普通大米淀粉。圖6 X射線衍射圖譜

2.7 等溫滴定量熱分析

ITC是表征分子相互作用的最有效的方法之一，可用于研究多酚與蛋白質(zhì)、多糖等的相互作用，它的優(yōu)點(diǎn)是能夠靈敏的測(cè)量配體和聚合物相互作用的焓變化，并提供重要的數(shù)據(jù)，如結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)、吉布斯自由能、焓值、熵值等。放熱或吸熱是分子間相互作用的普遍特性，在共價(jià)鍵的形成和非共價(jià)鍵的重組和形成中均可觀察到。ITC的基本原理是將配體逐漸滴入大分子(受體)中，同時(shí)參比池和樣品池的溫度保持不變，若在滴定過(guò)程中發(fā)生相互作用，則會(huì)釋放或吸收熱量，每次滴入后峰面積即為滴定所產(chǎn)生的熱量[19,20]。隨著反應(yīng)逐漸完全，受體的結(jié)合位點(diǎn)都被占據(jù)，峰的高度可能不再變化。本實(shí)驗(yàn)中，ITC記錄了單寧酸滴入緩沖液(pH 4.0)、普通大米淀粉溶液及糯米淀粉溶液的熱流變化。如圖7a所示，單寧酸滴入醋酸緩沖溶液中形成了小型的吸熱峰，這說(shuō)明單寧酸的稀釋過(guò)程是一個(gè)吸熱反應(yīng)。而當(dāng)單寧酸滴入淀粉溶液后，發(fā)現(xiàn)該過(guò)程焓值變化小于零，該現(xiàn)象說(shuō)明單寧酸滴入淀粉溶液的過(guò)程是一個(gè)放熱反應(yīng)；并且放出的熱量隨著滴入單寧酸的比例增加而減少，這說(shuō)明淀粉與單寧酸的結(jié)合位點(diǎn)在逐漸減少。

普通大米淀粉、糯米淀粉與單寧酸的熱量-質(zhì)量比曲線如圖7b、圖7c所示，通過(guò)對(duì)曲線的擬合得到普通大米淀粉、糯米淀粉與單寧酸相互作用的熱力學(xué)參數(shù)。單寧酸與普通大米淀粉結(jié)合的化學(xué)計(jì)量數(shù)(N)為(0.64±0.12)，這表明在單寧酸與普通大米淀粉的質(zhì)量比約為0.64時(shí)，普通大米淀粉上的結(jié)合位點(diǎn)基本達(dá)到飽和，在質(zhì)量比為0.6處淀粉得率最高；單寧酸與糯米淀粉結(jié)合的化學(xué)計(jì)量數(shù)(N)為(0.89±0.16)，說(shuō)明糯米淀粉分子上的結(jié)合位點(diǎn)在兩者質(zhì)量比約為0.89時(shí)達(dá)到了飽和，與2.1的結(jié)果一致，糯米淀粉得率在二者質(zhì)量比為0.8時(shí)最高。普通大米淀粉與單寧酸的結(jié)合常數(shù)(K)為(357±116)，糯米淀粉與單寧酸的結(jié)合常數(shù)(K)為(438±172)，結(jié)合常數(shù)都處于較小水平，這表明兩者之間的親和力較弱。

圖7 單寧酸在25 ℃下的等溫滴定量熱分析曲線

此外，計(jì)算發(fā)現(xiàn)：普通大米淀粉與單寧酸反應(yīng)過(guò)程中焓值(ΔH)為(-2.04±0.06)cal/g，熵值(ΔS)為1.12 × 10-3cal/(g·K)，吉布斯自由能(ΔG)為-4.13 cal/g；糯米淀粉與單寧酸反應(yīng)過(guò)程中焓值(ΔH)為(-0.98±0.03)cal/g，熵值(ΔS)為0.99 ×10-3cal/(g·K)，吉布斯自由能(ΔG)為-1.28 cal/g。根據(jù)Ross的研究，認(rèn)為混合體系內(nèi)主要存在兩種結(jié)合反應(yīng)：一種是熵驅(qū)動(dòng)反應(yīng)，即ΔH>0(吸熱反應(yīng))，ΔS>0(熵增)，TΔS>ΔH，體系中主要是熵效應(yīng)導(dǎo)致該混合體系內(nèi)ΔG<0，該反應(yīng)屬于熵驅(qū)動(dòng)，主要驅(qū)動(dòng)力為分子間的疏水作用；另一種反應(yīng)是以焓驅(qū)動(dòng)為主要推動(dòng)的焓-熵補(bǔ)償反應(yīng)，即ΔH<0(放熱反應(yīng))，ΔS>0(熵增)，|TΔS|<|ΔH|，體系中熵效應(yīng)與放熱共同導(dǎo)致體系的ΔG<0，該反應(yīng)的主要驅(qū)動(dòng)力為氫鍵或靜電相互作用[21]。由此可見，單寧酸與淀粉之間的相互作用屬于以焓驅(qū)動(dòng)為主的焓-熵補(bǔ)償?shù)倪^(guò)程，而淀粉屬于中性物質(zhì)。因此，單寧酸與淀粉之間的相互作用力是以氫鍵為主的非共價(jià)相互作用力，且該反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的。當(dāng)多酚與淀粉形成非包合物時(shí)，主要通過(guò)形成氫鍵進(jìn)行相互作用[22-25]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。如Chai等[25]通過(guò)XRD發(fā)現(xiàn)淀粉分子與茶多酚之間也未形成V型復(fù)合物，推測(cè)茶多酚可能是以氫鍵為橋梁與淀粉分子作用 。因此，推測(cè)單寧酸沉淀淀粉的機(jī)理為：?jiǎn)螌幩崤c水分子競(jìng)爭(zhēng)淀粉，并與淀粉分子形成穩(wěn)定的氫鍵，從而使淀粉沉淀析出。

3 結(jié)論

單寧酸的添加量、沉淀時(shí)間、體系pH等因素對(duì)單寧酸沉淀淀粉過(guò)程有顯著性影響；而沉淀溫度和金屬離子對(duì)淀粉沉淀過(guò)程無(wú)顯著影響。淀粉濃度越高，沉淀淀粉所需單寧酸的添加量越大；pH越低，單寧酸沉淀淀粉效率越高；綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和成本，單寧酸沉淀淀粉的最佳溫度為25 ℃，最佳時(shí)間為6 h。XRD與ITC分析表明單寧酸可能與水分子競(jìng)爭(zhēng)淀粉分子形成氫鍵，從而導(dǎo)致淀粉從水溶液中沉淀析出。