2株海豚鏈球菌的分離鑒定及藥敏特性分析

張鳳賢

(河北省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，河北 石家莊 050035)

鱘魚屬于硬骨魚綱、硬鱗總目、鱘形目，具有個(gè)體大、生長(zhǎng)快、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[1]，其肉厚骨軟，味道鮮美，肉和卵的蛋白質(zhì)含量高，是高級(jí)營(yíng)養(yǎng)品，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。當(dāng)前鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)得到迅速發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，在養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量不斷擴(kuò)大的同時(shí)，養(yǎng)殖環(huán)境也發(fā)生了巨大變化，高密度養(yǎng)殖、水體惡化，細(xì)菌病不斷發(fā)生，直接影響鱘魚養(yǎng)殖的發(fā)展。根據(jù)報(bào)道和文獻(xiàn)研究，目前，鱘魚細(xì)菌病的主要致病菌有：金黃桿菌(Chryseobacteriumsp.)[2]、停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)[3]、海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)[4-5]、遲鈍愛(ài)德華氏菌[6]、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[7]、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)[8]、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)[9]等。

海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)屬于芽孢桿菌綱，乳桿菌目，鏈球菌科，鏈球菌屬，具有感染宿主廣、傳染性強(qiáng)、死亡率高等特點(diǎn)，為球形或卵圓形，直徑0.2～0.8 μm，為革蘭氏陽(yáng)性菌，在水體中普遍存在，是人魚共患病原菌。在20世紀(jì)70年代海豚鏈球菌開(kāi)始被人們認(rèn)知，20世紀(jì)90年代鏈球菌屬細(xì)菌對(duì)魚類疾病的感染危害加重，成為全球重要的魚類病原菌，易感染的魚類有：鱘魚、虹鱒、羅非魚、黃鰭鯛、黃顙魚、鯧鲹等，且從當(dāng)年魚種至成魚均受害，海豚鏈球菌感染流行于夏季，死亡率高[10]。

2020年河北省鱘魚養(yǎng)殖面積約113 hm2，年產(chǎn)量約6 900多噸，且大規(guī)模養(yǎng)殖主要集中在石家莊、邯鄲和保定地區(qū)[11]。近幾年，石家莊地區(qū)鱘魚海豚鏈球菌感染屢有發(fā)生，所以對(duì)海豚鏈球菌感染及海豚鏈球菌藥物敏感特性研究對(duì)于該地區(qū)實(shí)際生產(chǎn)中海豚鏈球菌感染鱘魚的防治具有非常重要的意義。

本文結(jié)合國(guó)務(wù)院獸醫(yī)主管部門批準(zhǔn)的水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥，采用微量肉湯法對(duì)分離獲得的病原菌菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選出敏感抗生素，用于實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖中指導(dǎo)養(yǎng)殖戶對(duì)鱘魚海豚鏈球菌感染疾病合理使用抗生素治療。

1 材料與方法

1.1 材料

腦心浸液(BHI)肉湯培養(yǎng)基、BHI營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司，細(xì)菌生化鑒定管及配套相關(guān)試劑購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司，藥敏分析試劑板購(gòu)自南京菲恩醫(yī)療科技有限公司，PCR相關(guān)試劑購(gòu)自TakaRa公司?；疾△\魚分別取自河北省石家莊市井陘縣及平山縣兩個(gè)鱘魚養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化 2021年7月和8月，河北省石家莊市井陘縣和平山縣分別有一鱘魚養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生鱘魚發(fā)病大量死亡的情況，發(fā)病鱘魚臨床癥狀主要表現(xiàn)為：嘴部發(fā)紅發(fā)黑，肛門紅腫，鰓蓋及鰭條基部出血；解剖可見(jiàn)腹部出血、肝脾腫大。對(duì)2個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)分別選取具有典型發(fā)病癥狀的鱘魚，無(wú)菌條件下解剖，無(wú)菌接種環(huán)取其肝臟、脾臟、腎臟組織，分別劃線于BHI固體培養(yǎng)基進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)，25 ℃，培養(yǎng)72 h，選取優(yōu)勢(shì)菌落，純化培養(yǎng)3次，各獲得1株純化菌株，并分別命名為JX-1和PS-3。將純化菌株JX-1和PS-3分別挑取單菌落于BHI液體培養(yǎng)基中，25 ℃，振蕩培養(yǎng)24～48 h，保存甘油菌(25%甘油濃度)于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 病原菌的形態(tài)和生理生化特性鑒定試驗(yàn) 觀察菌株JX-1和PS-3在BHI固體培養(yǎng)基上的菌體形態(tài)特征，并進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察；利用細(xì)菌生化鑒定管，根據(jù)鑒定管使用說(shuō)明書對(duì)2菌株分別進(jìn)行生理生化特性鑒定。

1.2.3 病原菌的16S rDNA序列分析 對(duì)菌株JX-1和PS-3進(jìn)行基因組DNA提取，然后采用通用引物(27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R: 5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得16S rDNA序列產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物送派諾森生物科技有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI Blast數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定種屬。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 采用微量肉湯稀釋法分別對(duì)菌株JX-1和PS-3進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，根據(jù)國(guó)務(wù)院獸醫(yī)主管部門批準(zhǔn)的水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥品種(恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹、磺胺甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶)定制專用藥敏分析試劑板，具體操作方法依照藥敏分析試劑板使用說(shuō)明書進(jìn)行。當(dāng)試劑板中陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)菌生長(zhǎng)良好時(shí)，肉眼觀察能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度，作為該藥物對(duì)受試菌的最小抑菌濃度(MIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株JX-1和PS-3的形態(tài)和生理生化特性

菌株JX-1和PS-3在BHI固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)乳白色、圓形、針尖大小的菌落，邊緣整齊，表面光滑，不透明。經(jīng)革蘭氏染色為革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌(見(jiàn)封三圖1)。

菌株JX-1和PS-3的生理生化特性鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，菌株JX-1和PS-3可分解利用甘露醇，不能分解利用肌醇、山梨醇、蜜二糖、核糖醇和棉子糖；不能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚；不產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶；有動(dòng)力；可產(chǎn)生鳥(niǎo)氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶；發(fā)酵不產(chǎn)生硫化氫；不產(chǎn)生尿素酶；不可以利用檸檬酸鹽；MR、VP試驗(yàn)陰性。

根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]，菌株JX-1和PS-3的形態(tài)特征和生理生化特性與海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)高度相似。

2.2 菌株JX-1和PS-3的16S rDNA序列分析結(jié)果

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，與NCBI Blast數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)菌株JX-1和PS-3與海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)的同源性均大于99.0%。

綜合菌株JX-1和PS-3的形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析結(jié)果，確定菌株JX-1和PS-3為海豚鏈球菌。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)菌株JX-1和PS-3的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，獲得各藥物對(duì)2菌株的最小抑菌濃度MIC(見(jiàn)表2)。

表2 各藥物對(duì)菌株P(guān)S-3和JX-1的MIC μg/mL

由表2最小抑菌濃度MIC可知，菌株JX-1對(duì)硫酸新霉素、甲砜霉素、鹽酸多西環(huán)素、磺胺甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶高度敏感，對(duì)氟苯尼考中度敏感，對(duì)恩諾沙星、氟甲喹耐藥；菌株P(guān)S-3對(duì)甲砜霉素、鹽酸多西環(huán)素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶高度敏感，對(duì)硫酸新霉素、氟苯尼考中度敏感，對(duì)恩諾沙星、氟甲喹耐藥。根據(jù)表2數(shù)據(jù)可知，恩諾沙星對(duì)JX-1的MIC是16.00 μg/mL，對(duì)PS-3的MIC是8.00 μg/mL，2菌株對(duì)恩諾沙星均耐藥；硫酸新霉素對(duì)JX-1的MIC≤0.125 μg/mL，對(duì)PS-3的MIC是1.00 μg/mL，JX-1對(duì)硫酸新霉素高度敏感，PS-3對(duì)硫酸新霉素中度敏感；2菌株對(duì)其他抗生素的敏感性差異不大。

3 討論

海豚鏈球菌作為當(dāng)前河北省石家莊地區(qū)鱘魚主要感染鏈球菌種類，其特性研究和防治對(duì)鱘魚類生產(chǎn)養(yǎng)殖工作非常重要。

本文通過(guò)對(duì)菌株JX-1和PS-3的生理生化特性研究，發(fā)現(xiàn)2菌株可分解利用甘露醇，不能分解利用肌醇、山梨醇、蜜二糖、核糖醇和棉子糖，不能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，不產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，有動(dòng)力，可產(chǎn)生鳥(niǎo)氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶，發(fā)酵不產(chǎn)生硫化氫，不產(chǎn)生尿素酶，不可以利用檸檬酸鹽，MR、VP試驗(yàn)陰性。其他特性待進(jìn)一步研究。

通過(guò)藥敏試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株JX-1對(duì)硫酸新霉素、甲砜霉素、鹽酸多西環(huán)素、磺胺甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶高度敏感，對(duì)氟苯尼考中度敏感，對(duì)恩諾沙星、氟甲喹耐藥；菌株P(guān)S-3對(duì)甲砜霉素、鹽酸多西環(huán)素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶高度敏感，對(duì)硫酸新霉素、氟苯尼考中度敏感，對(duì)恩諾沙星、氟甲喹耐藥。根據(jù)國(guó)務(wù)院獸醫(yī)主管部門批準(zhǔn)的水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果可以更好地指導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖中感染海豚鏈球菌的治療，有效預(yù)防和控制濫用藥和過(guò)量用藥現(xiàn)象的發(fā)生。

由最小抑菌濃度可知，作為石家莊地區(qū)兩個(gè)相鄰區(qū)域獲得的2株病原菌JX-1和PS-3對(duì)各抗生素的耐藥性差異不大，JX-1對(duì)硫酸新霉素高度敏感，而PS-3對(duì)硫酸新霉素中度耐藥，說(shuō)明相鄰地域的致病菌的耐藥性差異不大。

4 結(jié)論

在石家莊市兩相鄰地區(qū)分離獲得的2株海豚鏈球菌，對(duì)抗生素的藥物敏感性差異較小，在水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)際生產(chǎn)中，對(duì)于石家莊區(qū)域內(nèi)鱘魚海豚鏈球菌的感染，可以利用甲砜霉素、鹽酸多西環(huán)素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶等抗生素進(jìn)行治療，且感染早期用藥效果更佳。