UPLC-MS/MS 法測定白酒中三氯蔗糖含量的不確定度分析

黃永橋，吳新文，張世芹，簡銀池，毛敏霞

（貴州省檢測技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州貴陽 550014）

三氯蔗糖（Sucralose）又名蔗糖素，是一種非營養(yǎng)型強(qiáng)力甜味劑，為蔗糖甜度的600 倍，無能量，熱量值為零，為減肥人群及血糖異常人群所喜愛，被廣泛應(yīng)用于飲料、調(diào)味料、糕點等食品中[1-3]。研究表明，三氯蔗糖可以影響人體代謝，具有一定的慢性毒性、生殖毒性，會增加患癌癥的風(fēng)險，并且對生態(tài)環(huán)境存在潛在影響[4-6]。GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定配制酒中三氯蔗糖的最大允許限量為0.25 g/kg，但在白酒中不得添加。

目前三氯蔗糖的檢測方法有：液相色譜法[7-8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-10]、氣相色譜法[11]、滴定法[12]和離子色譜法[13-14]等。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有較強(qiáng)的選擇性和抗干擾能力、較高的靈敏度等優(yōu)點?，F(xiàn)有三氯蔗糖的檢測方法為GB 22255—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測定》，現(xiàn)階段采用液質(zhì)聯(lián)用法測定白酒中三氯蔗糖的不確定度評定的報道較少。研究參照現(xiàn)有測量分析過程中不確定度評定方法和要求，對超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定白酒中三氯蔗糖含量的不確定度進(jìn)行分析評定[15-16]。根據(jù)分析測量過程中不確定度的來源，建立的數(shù)學(xué)模型并對其進(jìn)行不確定度評估，計算合成相對不確定度，得到最終的擴(kuò)展不確定度，以期為測量結(jié)果的準(zhǔn)確性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：市售蒸餾白酒樣品。

試劑及耗材：乙腈（色譜純），德國Merck 公司；甲酸（色譜純），上海安普實驗科技股份有限公司；三氯蔗糖（純度＞99%），上海安譜實驗科技股份有限公司。

儀器設(shè)備：Agilent 1290 超高效液相色譜儀、Agilent 6470 QQQ 三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜（配有ESI源），美國Agilent 公司；LT2002 電子天平，常熟市天量儀器有限公司；UMV-2 多管渦旋混合器，北京普立泰科儀器有限公司；Milli-Q 超純水機(jī)，美國Millipore 公司；0.22 μm 有機(jī)濾膜，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制：準(zhǔn)確稱取三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.0001 g），純水溶解并定容至10 mL，得到濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

1.2.2 儀器條件

1.2.2.1 色譜條件

ZORBAX Eclipse Plus-C18(50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國Agilent 公司)色譜柱；流動相A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈，流速：0.3 mL/min，柱溫：40 ℃，進(jìn)樣體積：2.0 μL，梯度洗脫程序：0.0～0.5 min，20 %B；0.5～1.0 min，20 %～80 %B；1.0～2.0 min，80 %B；2.0～2.5 min，80 %～20 %B；2.5～3.5 min，20%B。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，負(fù)離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測；毛細(xì)管電壓：4.5 kV；霧化器壓力：45 psi；干燥氣流速：7 L/min；干燥氣溫度：325 ℃；鞘氣流速：10 L/min；鞘氣溫度：300 ℃；三氯蔗糖質(zhì)譜參數(shù)：錐孔電壓130 V，母離子m/z 397，定量離子m/z 360.8，碰撞能量8 eV，母離子m/z 395，定量離子m/z 358.8，碰撞能量6 eV。

1.2.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g 試樣（精確至0.01 g）置于50 mL燒杯中，沸水浴上蒸干，殘渣用11%乙腈溶液溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，定容后過膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.2.4 建立不確定度數(shù)學(xué)模型

式中：X——試樣中三氯蔗糖的含量，μg/kg；

C——三氯蔗糖質(zhì)量濃度，ng/mL；

V——試樣溶液定容體積，mL；

m——試樣質(zhì)量，g；

1.2.5 測量不確定度來源

測量三氯蔗糖的不確定度來源主要有標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度和樣品前處理引入的不確定度，標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度包括：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、標(biāo)準(zhǔn)儲備液、標(biāo)準(zhǔn)中間液和標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合；樣品前處理引入的不確定度包括：樣品稱樣、樣品前處理、測量重復(fù)性和加標(biāo)回收率。

注：文中后續(xù)陽性樣品表示經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)白酒樣品中含有三氯蔗糖，陰性樣品表示經(jīng)檢驗未發(fā)現(xiàn)白酒樣品中含有三氯蔗糖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的不確定度urel(S)

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書上的信息，三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度為98.79 %，不確定度為±1 %，符合均勻分布，包含因子k=，因此相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制引入的不確定度urel(S2)

2.1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度urel(w)

稱量所用分析天平檢定證書給出允差為±0.1 mg，符合均勻分布，k=，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品稱量為10 mg，引入相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制過程中器具引入的不確定度urel(std1)

標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制過程引入不確定度有10 mL單標(biāo)線容量瓶（A 級）的容量允差和實驗室溫度變化引起的溶劑和玻璃容器體積膨脹。根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》中可知，10 mL 單標(biāo)線容量瓶（A 級）容量允差為±0.020 mL，實驗室溫度在（20±5）℃之間變動時，查得水和玻璃的膨脹系數(shù)分別為0.000208/℃和0.0000250/℃，玻璃的體積膨脹系數(shù)相較水的體積膨脹系數(shù)可忽略不計，符合均勻分布k=，則10 mL 單標(biāo)線容量瓶（A 級）的容量允差不確定度urel(n1)和水的體積膨脹不確定度urel(n2)為：

因此，標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制過程中器具引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

綜上，標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)中間液配制引入的不確定度urel(S3)

吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.10 mL 于100 mL 容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，得到1.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

配制過程引入不確定度有1 mL分度吸量管（A級）的容量允差、10 mL 單標(biāo)線容量瓶（A 級）的容量允差和因?qū)嶒炇覝囟茸兓鸬娜軇w積膨脹。根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》中可知，1 mL 分度吸量管（A 級）容量允差和10 mL單標(biāo)線容量瓶（A 級）容量允差為±0.008 mL 和±0.020 mL，實驗室溫度在（20±5）℃之間變動時，水的體積膨脹系數(shù)為0.000208/℃，符合均勻分布k=，標(biāo)準(zhǔn)中間液配制過程引入的不確定度見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)中間液配制過程引入的不確定度

因此，標(biāo)準(zhǔn)中間液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制引入的不確定度urel(S4)

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)中間液5 μL、10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL 于10 mL 容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，混勻，得到質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

配制過程引入不確定度有不同量程移液器的容量允差、10 mL 單標(biāo)線容量瓶（A 級）的容量允差和因?qū)嶒炇覝囟茸兓鸬娜軇w積膨脹。根據(jù)JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》、JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》和實驗室溫度在（20±5）℃之間變動時水的體積膨脹系數(shù)，符合均勻分布k=，標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程引入的不確定度見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程引入的不確定度

因此，標(biāo)準(zhǔn)工作液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel(C)

配制的標(biāo)準(zhǔn)工作液經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測定，重復(fù)測定3 次，以質(zhì)量濃度對其峰面積通過直線擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程：y=159478c-111279，相關(guān)系數(shù)0.998。測定結(jié)果見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)工作液峰面積測定結(jié)果

選取陽性樣品重復(fù)測定6 次，將峰面積帶入線性方程校正其含量，測得陽性樣品中三氯蔗糖平均含量為C0=12.18 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算按公式（2），相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算按公式（3）。

k——線性方程斜率，k= 159478；

b——線性方程截距，b=- 111279；

n——樣品平行測定次數(shù)，n=6；

p——標(biāo)準(zhǔn)工作液各濃度點重復(fù)測定的次數(shù)，每個濃度點重復(fù)測定3次，p=18；C0——樣品溶液的平均質(zhì)量濃度，C0=12.18 ng/mL；

經(jīng)計算，樣品測定引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(C)為0.180 ng/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C)為0.0148。

2.3 樣品前處理引入的不確定度urel(P)

2.3.1 稱樣引入的不確定度urel(P1)

稱取5 g 白酒試樣（精確至0.001 g），根據(jù)JJG 1036—2008《電子天平檢定規(guī)程》，最大允許誤差為±0.005 g，符合矩形分布k=，則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.2 樣品定容引入的不確定度urel(P2)

樣品最終使用11%乙腈溶液溶定容至25 mL，根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》，25 mL 單標(biāo)線容量瓶（A 級）容量允差為±0.030 mL，20 ℃時乙腈和水的體積膨脹系數(shù)分別為0.00137/℃和0.000208/℃，用于定容的11 %乙腈溶液溶的體積膨脹系數(shù)為0.000336/℃，服從矩形分布k=，則25 mL 單標(biāo)線容量瓶（A 級）的容量允差不確定度urel(n3)和11 %乙腈溶液溶的體積膨脹不確定度urel(n4)為：

因此，樣品定容過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

綜上，樣品前處理引入的不確定度為：

2.4 測量重復(fù)性引入的不確定度urel(A)

同時稱取陽性樣品6份，按照1.2前處理方法進(jìn)行前處理，計算6 次重復(fù)性結(jié)果和平均值。結(jié)果分別為59.5 μg/kg、59.9 μg/kg、59.7 μg/kg、61.9 μg/kg、60.0 μg/kg、62.4 μg/kg，平均值為60.6 μg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算按公式（4）。

經(jīng)計算，測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(A)為0.00829。

2.5 回收率引入的不確定度urel(R)

取陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，按1.2 樣品前處理進(jìn)行處理，平行測定6 次，加標(biāo)回收率統(tǒng)計結(jié)果見表4。

表4 加標(biāo)回收試驗結(jié)果(n=6)

加標(biāo)回收率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

為確定在三氯蔗糖含量的計算中是否需要折算平均回收率，根據(jù)CNAS—GL006《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》，用t檢驗來確定平均回收率與1.0是否有顯著性差異：

查JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》t 分布表，取95 %置信度，n-1 自由度的臨界值t95（5）為2.57，故t＞t95（5），說明平均回收率與1.0 具有顯著性差異，因此在結(jié)果計算中需采用回收率對結(jié)果進(jìn)行修正。

2.6 分析過程中不確定度分量及合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X)

經(jīng)過對白酒中三氯蔗糖分析過程中不確定度進(jìn)行分析和計算，過程中各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度來源、類型和數(shù)值見表5。

表5 不確定度分量

白酒中三氯蔗糖分析過程中的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.7 擴(kuò)展不確定度

依據(jù)JJF 1135—2005《化學(xué)分析測量不確定度評定》，取95%置信水平，擴(kuò)展因子k=2，白酒中三氯蔗糖含量的平均值為60.6 μg/kg，則擴(kuò)展不確定度：

2.8 測量結(jié)果及不確定度報告

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定白酒中三氯蔗糖含量，根據(jù)不確定度評定結(jié)果，當(dāng)稱樣量為5 g，置信度為95 %時k=2，測定結(jié)果為：（60.6±6.5）μg/kg，k=2。

3 結(jié)論

采用UPLC-MS/MS 法測定白酒中三氯蔗糖含量，通過對測定過程中不確定度來源進(jìn)行分析并量化，結(jié)果表明，影響白酒中三氯蔗糖測定結(jié)果不確定度的因素主要有：標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品前處理、測量重復(fù)性和加標(biāo)回收率，其中測量重復(fù)性和加標(biāo)回收率的不確定度對合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的貢獻(xiàn)較小，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合不確定度評定結(jié)果最大。因此，在測定白酒中三氯蔗糖時應(yīng)注意操作的規(guī)范性，選擇適當(dāng)量程的量具，準(zhǔn)確配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，定容準(zhǔn)確，減少測量過程不確定度，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和可信度。