清香型白酒釀造中乳酸乙酯和乙酸乙酯合成代謝調(diào)控的研究進(jìn)展

李書婷，黃志久，吳正云，賈代榮，楊 波，張文學(xué)

（1.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都 610065；2.醉清風(fēng)酒業(yè)股份有限公司，四川瀘州 646000）

乙酸乙酯與乳酸乙酯是清香型白酒的主要香味物質(zhì)，它們的含量和比例與清香型酒的風(fēng)味品質(zhì)密切相關(guān)[1]。乙酸乙酯偏低和乳酸乙酯偏高是影響清香型白酒品質(zhì)的常見問題[2]。就乳酸乙酯而言，在白酒生產(chǎn)過程中，空氣、酒曲、酒醅以及開放的發(fā)酵方式都可能帶入乳酸菌，從而產(chǎn)生大量乳酸，導(dǎo)致乳酸乙酯含量上升[3-4]。目前降低乳酸乙酯含量的研究主要關(guān)注發(fā)酵環(huán)境和餾酒條件的優(yōu)化[5]。在乙酸乙酯含量提高方面，主要采取篩選優(yōu)良酵母菌株的方式?？傮w上看，從代謝調(diào)控角度探討降低乳酸乙酯含量和提高乙酸乙酯含量的研究相對(duì)較少。本文綜述了近年來清香型白酒中乳酸乙酯與乙酸乙酯合成代謝調(diào)控方面的研究進(jìn)展，為提升清香型白酒品質(zhì)提供理論參考。

1 白酒中乳酸乙酯和乙酸乙酯的合成途徑

釀酒過程中，白酒中的乳酸乙酯和乙酸乙酯可通過化學(xué)反應(yīng)或生物合成。生物合成又分為醇?；D(zhuǎn)移酶途徑和酯化酶途徑。

1.1 化學(xué)反應(yīng)

白酒發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生酸、醇等底物，酸與醇發(fā)生酯化反應(yīng)生成酯類和水。酯化反應(yīng)屬于可逆反應(yīng)，一般情況下反應(yīng)不徹底并且速度極緩慢。在白酒發(fā)酵后期，酸、醇大量積累，有利于酯化反應(yīng)的進(jìn)行。白酒生產(chǎn)和貯藏過程中，可以通過延長(zhǎng)發(fā)酵周期促使白酒中酯化反應(yīng)達(dá)到平衡[6]。

1.2 醇酰基轉(zhuǎn)移酶途徑

醇?；D(zhuǎn)移酶(Alcohol acetyl transferase)廣泛存在于酵母、植物和細(xì)菌中[7]，能催化不同醇與?；o酶A 生成相應(yīng)的酯類物質(zhì)。目前關(guān)于植物來源的醇?；D(zhuǎn)移酶研究已比較充分[8]。與釀酒相關(guān)的醇?；D(zhuǎn)移酶主要存在于酵母[9]（包括釀酒酵母、克魯維氏酵母、巴氏酵母等）中，目前的研究主要集中于釀酒酵母。釀酒酵母在發(fā)酵過程中不能合成乳酰CoA[10]，通過此途徑合成的乳酸乙酯產(chǎn)量微乎其微。但對(duì)于乙酸乙酯而言醇?；D(zhuǎn)移酶途徑是主要合成途徑[11-12]（圖1）。與乙酸乙酯合成相關(guān)的醇?；D(zhuǎn)移酶主要有Atf1p、Atf2p、Lg Atf1p[13-15]。研究表明，釀酒酵母中Atf1的敲除導(dǎo)致乙酸乙酯的形成減少40%，Atf2 的敲除僅導(dǎo)致乙酸乙酯減少13%，顯示Atf1p 在乙酸乙酯的形成中作用更大[11，16]。此外，位于酵母線粒體中的醇?；D(zhuǎn)移酶Eat1p 也可催化乙酰CoA 與乙醇反應(yīng)生成乙酸乙酯[17]。Mans等[18]用CRISPR-Cas9 破壞釀酒酵母中Eat1p 同源物，乙酸乙酯的產(chǎn)量減少了50%。

圖1 胞中乙酸乙酯合成的醇?；D(zhuǎn)移酶途徑[17，19]

1.3 酯化酶途徑

酯化酶是催化合成低級(jí)脂肪酸酯酶類的總稱，包括脂肪酶、酯合成酶和磷酸酯酶[20]。在白酒釀造中，酯化酶的產(chǎn)生菌主要是霉菌（紅曲霉、毛霉、根霉等），其次為酵母菌（釀酒酵母、假絲酵母、球擬酵母等）[21]。目前關(guān)于酯化酶的研究大多集中于濃香型白酒中的己酸乙酯，武建國(guó)等[22]在酒醅中加入紅曲酯化酶發(fā)酵后，己酸乙酯含量增加了124.8～162.5 mg/100 mL；許春艷等[23]發(fā)現(xiàn)紫色紅曲霉YJX-8 酯化酶對(duì)己酸的酯化較對(duì)丁酸、乙酸的酯化作用更強(qiáng)；胡沂淮等[24]以洋河大曲中篩選到的紫紅曲霉生產(chǎn)得到酯化紅曲粗酶制劑，具有較高的己酸乙酯催化活性。酯化酶也能催化乙酸、乳酸等小分子酸與乙醇反應(yīng)生成乙酸乙酯和乳酸乙酯等[21]。酯化酶的催化選擇性在一定程度上受底物濃度和環(huán)境因子的影響，如對(duì)不同香型大曲酯化酶催化特性的研究顯示，當(dāng)乙酸濃度為25 g/L、pH4 時(shí)，催化合成乙酸乙酯的活力最高；當(dāng)乳酸濃度為5 g/L、pH7 時(shí)，催化合成乳酸乙酯的活力最高[25]。由于酯化酶的種類繁多且催化特異性規(guī)律不完全清晰，目前很少有從酯化酶途徑探討白酒中乳酸乙酯與乙酸乙酯代謝調(diào)控的研究。深入探究各種酯化酶的催化特性和作用機(jī)制，對(duì)白酒酯類物質(zhì)代謝調(diào)控的深入理解和實(shí)際應(yīng)用有積極意義[26]。

2 乳酸乙酯與乙酸乙酯合成代謝的調(diào)控

乳酸乙酯在蒸酒前期溫度較低、酒度較高時(shí)餾出較少；乙酸乙酯分子極性較小，較難溶于水，可以完全溶于乙醇，在蒸酒前期餾出相對(duì)較多[27-28]。因此可以采用高酒度摘酒方式降低成品酒中的乳酸乙酯含量。但此種方式會(huì)造成蒸餾后期其他重要風(fēng)味物質(zhì)的丟失，成品酒口感欠佳，減少原酒產(chǎn)量[3]。從代謝調(diào)控角度考慮，增加乙酸乙酯和減少乳酸乙酯含量的方式有以下幾種。

2.1 改變前體物質(zhì)的含量

乳酸乙酯通常是由乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸和酵母菌代謝產(chǎn)生的乙醇作為前體物質(zhì)合成，因此可以考慮通過降低前體物質(zhì)乳酸的含量減少乳酸乙酯[29]的生成。乳酸降解菌（或稱為乳酸利用菌）是能夠利用乳酸作為碳源或者電子受體的一類微生物，最終降解產(chǎn)物有酯類、酸類和醇類[30]。目前已報(bào)道的乳酸降解菌有芽孢桿菌屬、丙酸桿菌屬、擬桿菌屬和梭菌屬等[30-32]。不同種屬的菌株對(duì)乳酸的降解率差異很大，目前與芽孢桿菌有關(guān)的研究相對(duì)較多。鎮(zhèn)達(dá)等[33]從大曲、黃水、酒醅中篩選到了16株可利用乳酸的芽孢桿菌；李偉等[34]從清香型大曲中篩選到兩株芽孢桿菌B4-1 和B36-1，乳酸利用量分別達(dá)到1.91 g/L 和1.26 g/L；宋克偉等[35]將從清香型大曲中篩選到的枯草芽孢桿菌B001 添加到酒醅中進(jìn)行發(fā)酵，乳酸乙酯降低了25%，并在感官品評(píng)中體現(xiàn)了清香型白酒爽凈、柔順等特點(diǎn)；楊望軍[3]將從酒醅中篩選到的兩株芽孢桿菌制成固體麩曲應(yīng)用于生產(chǎn)，乳酸乙酯降低率分別為11.25 %和15.83%。從白酒生產(chǎn)環(huán)境中分離篩選乳酸降解菌添加到白酒發(fā)酵中，能夠降低乳酸和乳酸乙酯含量，改善酒體品質(zhì)，具有很好的應(yīng)用前景[36]。

乙酸乙酯含量的提升可通過增加前體乙酸實(shí)現(xiàn)。王文陽等[37]在酒醅中添加3.0 mg 醋酸/g 醅的醋酸發(fā)酵液，白酒中的乙酸和乙酸乙酯含量分別提高了138.35 %和85.43 %；張華東等[38]在高粱汁培養(yǎng)基內(nèi)接種不同濃度的醋酸菌懸濁液，探討其對(duì)釀酒酵母酯醇代謝的影響，當(dāng)醋酸菌接種量為3×109CFU/mL 時(shí)，乙酸乙酯含量增加12 %。醋酸菌是好氧微生物，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，氧氣耗盡，醋酸菌逐漸凋亡，因此添加醋酸菌懸濁液對(duì)提高乙酸乙酯含量的效果不及直接添加醋酸發(fā)酵液。

2.2 通過菌株選育提高乙酸乙酯含量

一般認(rèn)為白釀酒造中的酵母菌與乙酸乙酯形成有密切關(guān)系，通過篩選高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母菌株提高白酒中乙酸乙酯含量的研究報(bào)道較多。陳雪等[39]篩選到一株高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母菌株，制成麩曲應(yīng)用于高粱固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，使乙酸乙酯的含量提高了19.5 %；程偉等[40]在清香型酒醅中篩選得到1株高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母菌jmz-01，產(chǎn)乙酸乙酯能力為248.9 mg/L；許銀等[41]將篩選到的酵母菌Y87與麩皮按質(zhì)量比3∶100 添加到酒曲中，乙酸乙酯含量提高36.6 %；劉小改等[42]將篩選到的酵母菌J-4用于發(fā)酵，乙酸乙酯含量提高了50.7%。盡管篩選菌株的方法能有效提高成品酒中乙酸乙酯的含量，但其具體機(jī)制的研究報(bào)道很少。前文所述，醇酰基轉(zhuǎn)移酶是乙酸乙酯合成的主要途徑，猜測(cè)高產(chǎn)乙酸乙酯的菌株可能具有更高的醇?；D(zhuǎn)移酶活性。

除篩選優(yōu)良菌株之外，使用基因工程技術(shù)改造菌株也可以達(dá)到提高乙酸乙酯產(chǎn)量的效果，其主要原理是加強(qiáng)合成乙酸乙酯的醇?；D(zhuǎn)移酶途徑。Cui 等[43]在釀酒酵母中過表達(dá)醇?；D(zhuǎn)移酶基因ATF1，產(chǎn)乙酸乙酯達(dá)270.24 mg/L，是親本的27.21倍；Dong等[44]過表達(dá)釀酒酵母ATF1，使乙酸乙酯的產(chǎn)量從25.04 mg/L 提高到78.76 mg/L；Li 等[45-46]構(gòu)建過量表達(dá)ATF1 和ATF2 的釀酒酵母菌株，乙酸乙酯產(chǎn)量分別達(dá)到1353.45 mg/L 和73.40 mg/L，是出發(fā)菌株的43.16 倍和2.34 倍；馬紅霞等[47]將過表達(dá)醇乙?；D(zhuǎn)移酶的釀酒酵母MY15 應(yīng)用于清香型白酒釀造,乙酸乙酯的總量提高了70%；Kruis 等[48]在釀酒酵母中過表達(dá)Eat 基因家族，15 個(gè)過表達(dá)菌株中有10 株顯示乙酸乙酯的產(chǎn)量增加。盡管通過基因工程改造菌株能大幅度提高白酒中乙酸乙酯的含量，但目前此種方式在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用受到相關(guān)法規(guī)的限制。

2.3 添加乳酸菌及其代謝抑制劑降低乳酸乙酯含量

乳酸菌是釀酒過程中產(chǎn)生乳酸的主要微生物，因此可以考慮在酒醅中抑制乳酸菌生長(zhǎng)從而減少乳酸的含量。龔士選[49]在西鳳酒入池酒醅中加入3～5 kg/萬斤酒醅的延胡索酸進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，乳酸乙酯從150 mg/100 mL 降低至50～80 mg/100 mL，降乳效果明顯，且酒質(zhì)柔和，風(fēng)格突出。乳酸菌生長(zhǎng)的抑制劑很多，但選擇性不強(qiáng)，可能擾亂正常的釀造發(fā)酵過程。如能尋找或開發(fā)出特異性的乳酸菌抑制劑，對(duì)于白酒生產(chǎn)中乳酸乙酯含量的降低更具有實(shí)際意義。

增強(qiáng)非乳酸代謝途徑也是減少乳酸含量的方式之一。如添加琥珀酸脫氫酶的輔基黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD），可以促進(jìn)琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，加速三羧酸循環(huán)，使代謝流向非乳酸生成途徑。白希智等[50]將FAD 與大曲粉按比例混勻，添加到酒醅中，發(fā)酵40 d后，乳酸乙酯降低27.26%，己酸乙酯略有增加，對(duì)其他香味物質(zhì)無明顯影響，感官品評(píng)結(jié)果良好。目前在乳酸代謝抑制方面的主要方式是增強(qiáng)三羧酸循環(huán)，使丙酮酸更多流向非乳酸代謝途徑，但這一方式在厭氧發(fā)酵條件下的應(yīng)用受到限制。

3 結(jié)語

本文綜述了清香型白酒中乳酸乙酯與乙酸乙酯的合成途徑，并從代謝前體和關(guān)鍵酶活性的角度，總結(jié)了乳酸乙酯與乙酸乙酯合成代謝調(diào)控的3種方式?？傮w上看，除通過基因工程技術(shù)增強(qiáng)醇?；D(zhuǎn)移酶活性提升乙酸乙酯含量外，其他方式基本屬于工藝優(yōu)化等初步探討，相關(guān)調(diào)控機(jī)制的理解和應(yīng)用還有待進(jìn)一步深入探究。