肝纖維化過程中Toll樣受體4在肝臟的表達(dá)分布及意義

王登妮，徐軍全，宋維芳，張曉陽，王明亮，梁永剛，宋彬妤

(1.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院科技中心，汾陽 032200;2.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院病理科，天津 300211)

肝纖維化過程中Toll樣受體4在肝臟的表達(dá)分布及意義

王登妮1，徐軍全1，宋維芳1，張曉陽2，王明亮1，梁永剛1，宋彬妤1

(1.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院科技中心，汾陽 032200;2.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院病理科，天津 300211)

目的 動態(tài)觀察大鼠肝纖維化過程中Toll樣受體4(Toll－like receptor 4，TLR4)蛋白在肝臟的表達(dá)，探討TLR4與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法 以四氯化碳皮下注射復(fù)制大鼠肝纖維化模型，設(shè)立正常對照組和模型1周組、2周組、4周組、6周組。常規(guī)HE染色和天狼猩紅膠原染色觀察肝臟病變;檢測肝組織羥脯氨酸和血漿內(nèi)毒素含量;免疫組化和Western blot檢測TLR4在肝組織中的表達(dá)，檢測α－SMA觀察活化的肝星狀細(xì)胞(HSCs)。結(jié)果 與正常對照組比較，CCl4作用2周時，肝組織羥脯氨酸含量開始明顯增多(P＜0.01);模型組各組血漿內(nèi)毒素含量呈梯度上升(P＜0.01)，且與肝組織羥脯氨酸含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01);CCl4作用1周后肝組織TLR4的表達(dá)即明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，4周時和6周時有所下降(與2周組相比，P＜0.05)，但仍高于正常對照組(P＜0.01)。TLR4陽性細(xì)胞包括枯否細(xì)胞、活化的HSCs及少量的肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)論 內(nèi)毒素及其受體TLR4的改變可能在肝纖維化中起重要作用。

內(nèi)毒素;內(nèi)毒素受體;TLR4;肝纖維化

肝纖維化的形成是有多種因素參與的復(fù)雜的病理生理過程，其中腸源性內(nèi)毒素血癥(IETM)在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起重要作用。近幾年發(fā)現(xiàn)TLR4是介導(dǎo)內(nèi)毒素脂多糖(LPS)反應(yīng)的細(xì)胞表面特異性受體［1］。LPS與其受體 TLR4結(jié)合，激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生一系列的免疫應(yīng)答。目前國內(nèi)外鮮見在肝纖維化過程中TLR4蛋白在肝組織中動態(tài)表達(dá)情況的報道，我們本次實(shí)驗通過動態(tài)觀察在肝纖維化過程中，TLR4蛋白在肝臟的表達(dá)部位以及表達(dá)量來探討其與肝纖維化的關(guān)系，為肝纖維化的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 動物及材料

健康清潔級雌性 Wistar大鼠，體重230±20 g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心［SCXK(晉)2009－0001］;四氯化碳為中國中邦化工分析純;TLR4一抗、即用型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程公司;α－SMA免疫組化檢測試劑盒購自美國Sigma公司;辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自北京中杉生物技術(shù)有限公司;鱟試劑盒購自上海伊華醫(yī)學(xué)科技公司，天狼猩紅、固綠FCF、羥脯氨酸(Hyp)標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 分組:40只Wistar大鼠，在控光鼠房中分籠飼養(yǎng)，溫度18℃ ～25℃，濕度45%，食用標(biāo)準(zhǔn)飼料，一周后，隨機(jī)分為5組，A組(正常對照組)、B組(模型組1周)、C組(模型組2周)、D組(模型組4周)、E組(模型組6周)。

1.2.2 造模:A組給予皮下注射生理鹽水，每周兩次，其余各組給予首劑5mL/kg體重皮下注射CCl4分析純，之后按3mL/kg體重皮下注射40%CCl4植物油(v/v)混合液，每周2次。

1.2.3 取材:在無菌無熱源條件下，從大鼠腹主動脈采血，注入加有肝素的無熱源玻璃試管中，離心取血漿置于玻璃試管中封口，低溫保存。取新鮮肝左葉一部分立即固定于4%多聚甲醛，24 h內(nèi)進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋;一部分于－80℃保存。

1.2.4 HE染色:對肝組織石蠟切片進(jìn)行常規(guī) HE染色，觀察肝臟病變。

1.2.5 天狼猩紅膠原染色:組織切片用天狼猩紅染液(0.1%苦味酸天狼猩紅染液:Sirius Red 100 mg、Fast Green 50 mg、苦味酸飽和水溶液100mL)室溫60 min，中性樹膠封片，顯微鏡觀察肝臟膠原染色，紅色為膠原纖維。

1.2.6 肝組織羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)含量測定:取凍存肝組織約0.2 g消化 ，取肝臟消化液1.0mL，對照管為1.0mL去離子水，然后依次加入:(1)0.1 mol/L檸檬酸緩沖液(pH6.0)0.5mL和0.05 mol/L氯胺T溶液1.0mL，37℃水浴25 min;(2)3.15 mol/L過氯酸溶液1.0mL，室溫下作用5 min;(3)10%對二甲氨基苯甲醛溶液1.0mL，100℃沸水5 min;(4)冰浴冷卻，測定A560 nm處吸光度。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用Hyp標(biāo)準(zhǔn)曲線求得待測肝組織Hyp含量。

1.2.7 產(chǎn)色基質(zhì)偶氮法鱟試劑測定血漿內(nèi)毒素:參照試劑盒說明書操作。

1.2.8 免疫組化檢測 TLR4、α－SMA:參照試劑盒說明書操作，DAB顯色，TLR4以胞膜和胞質(zhì)棕黃色染色為陽性，α－SMA以胞質(zhì)棕黃色染色為陽性。

1.2.9 Western blot檢測 TLR4:每0.1 g凍存肝組織加入 1mL 裂解液(50mmol/L Tris－HCl pH8.0，150 mmol/L NaCl，1%TritonX－100，100 μg/mL PMSF)裂解0.5 h，在冰浴中進(jìn)行勻漿。BCA法蛋白定量。5%積層膠和10%分離膠電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉后，加入兔抗鼠 TLR4多克隆抗體4℃孵育過夜，PBST洗后，加入辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光檢測。采用凝膠成像分析系統(tǒng)計算目的條帶的積分光密度、根據(jù)目的條帶的值與內(nèi)參照β－actin的值之比行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。行單因素方差分析(One－Way ANOVA)，SNK(q檢驗)進(jìn)行兩兩比較、spearman相關(guān)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果(圖1～3見彩插1)

2.1 一般情況及造模效果

實(shí)驗過程中，正常對照組大鼠健康狀況良好，肝臟表面光滑，顏色紅潤;模型組大鼠的活動及攝食減少，精神萎靡，體重下降，皮毛雜亂無光澤，肝臟表面欠光滑，顏色灰暗，體積變大，邊緣圓鈍。模型組2周時肝組織Hyp含量開始明顯升高，6周時升高更為顯著(表1);病理切片觀察有較多纖維形成(圖1，B;圖2，B)，證明肝纖維化模型形成。

2.2 HE和膠原染色

正常組肝小葉結(jié)構(gòu)未見異常，肝細(xì)胞索排列規(guī)則有序，沿肝竇呈放射狀排列，未見變性、壞死及炎細(xì)胞浸潤，僅在匯管區(qū)和中央靜脈有少量膠原纖維;模型組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，匯管區(qū)有大量炎細(xì)胞浸潤，纖維增生明顯加重，纖維寬窄不一，呈星芒狀向肝小葉內(nèi)延伸(圖1、2)。

2.3 血漿內(nèi)毒素的變化

模型組各時期血漿內(nèi)毒素含量均高于正常對照組，隨CCl4作用時間的延長內(nèi)毒素呈梯度上升(表1)。

表1 各組大鼠血漿ET，肝組織TLR4、Hyp的變化Tab.1 Changes of plasma ET，liver TLR4，Hyp in each group

2.4 α-SMA和 TLR4免疫組化染色

正常對照組肝組織有微弱TLR4表達(dá);模型組肝組織TLR4表達(dá)明顯增加，用連續(xù)切片做 α－SMA和TLR4免疫組化發(fā)現(xiàn) α－SMA陽性細(xì)胞同時表達(dá)TLR4蛋白，提示活化的肝星狀細(xì)胞(HSCs)表達(dá)TLR4，TLR4陽性細(xì)胞包括枯否細(xì)胞、活化的 HSCs及少量的肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等(圖3)。

2.5 Western blot結(jié)果

在正常對照組肝組織有少量TLR4表達(dá)，肝纖維化過程中TLR4的表達(dá)從CCl4作用1周時開始升高，2周時達(dá)到高峰，4、6周時有所下降(與2周組比較，P＜0.05)，但與正常對照組相比仍顯著升高(P ＜0.01)(圖4，表1)。

2.6 相關(guān)性分析

肝纖維化過程中血漿內(nèi)毒素(ET)含量與肝組織Hyp含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.91，P＜0.01)(圖5)。

圖4 Western blot檢測各組TLR4蛋白的表達(dá)水平Fig.4 Western blot was used to analyze TLR4 protein expression in each group

圖5 CCl4誘發(fā)大鼠肝纖維化過程中血漿內(nèi)毒素與肝組織Hyp的相關(guān)性Fig.5 The relevance of plasma endotoxin and Hyp in liver tissues during the CCl4induced rat liver fibrosis

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝臟疾病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段，是肝臟受到慢性損傷時，肝臟細(xì)胞外基質(zhì)分泌與降解失衡，從而在肝細(xì)胞的間隙可逆性沉積的結(jié)果。在此過程中，有多種細(xì)胞，大量的炎癥介質(zhì)細(xì)胞因子及生物活性物質(zhì)共同參與，形成極為復(fù)雜的病理生理學(xué)過程，其中，內(nèi)毒素的作用是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。

大量臨床和實(shí)驗研究結(jié)果表明，急慢性肝病發(fā)生發(fā)展中常伴有腸源性內(nèi)毒素血癥(IETM)，肝病時，內(nèi)毒素吸收增多是內(nèi)毒素血癥的主要機(jī)制之一，而IETM一旦發(fā)生，又進(jìn)一步造成繼發(fā)性肝損傷［2，3］。IETM 持續(xù)存在，不僅可使急性肝炎慢性化、還有加劇肝纖維化和抑制纖維重吸收的作用，使肝硬變進(jìn)一步加重［4］。我們的實(shí)驗結(jié)果顯示，在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化過程中，腹主動脈血血漿內(nèi)毒素含量在纖維化形成的早期就明顯升高，且在纖維化全過程中逐漸升高，6周時約是對照組的7倍，而且血漿內(nèi)毒素含量變化與肝組織中Hyp含量呈顯著正相關(guān)。Hyp是膠原蛋白特有的氨基酸，肝組織Hyp含量可反映肝纖維化程度。本實(shí)驗結(jié)果也再次表明內(nèi)毒素血癥與肝纖維化發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。

雖然內(nèi)毒素血癥可促進(jìn)肝纖維化發(fā)生發(fā)展已日漸明確，但內(nèi)毒素如何通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)導(dǎo)致此效應(yīng)的機(jī)制仍不清楚。目前已知，LPS進(jìn)入宿主血液后與宿主的LBP結(jié)合，后者將LPS傳遞給CD14分子，由CD14介導(dǎo)LPS細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)，但CD14分子是一種GPI膜錨定蛋白，缺乏跨膜區(qū)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，不能直接向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)LPS信號，尚需其它分子起信號傳導(dǎo)作用。研究發(fā)現(xiàn)TLR4可能是LPS信號向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)的門戶蛋白［5，6］。提示，TLR4 在對 LPS 的生物學(xué)應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。由此，我們推測 TLR4也可能在內(nèi)毒素血癥促進(jìn)肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起重要作用。至今鮮見在肝纖維化過程中TLR4蛋白在肝組織中動態(tài)表達(dá)情況的報道。我們通過CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化動物模型初步動態(tài)觀察了TLR4蛋白在肝臟的表達(dá)分布情況。

在我們的實(shí)驗中，Western blot結(jié)果顯示，正常大鼠肝組織有少量TLR4蛋白表達(dá)，在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中，血漿內(nèi)毒素含量呈梯度性上升，而TLR4在第1周就開始有明顯的升高，2周達(dá)到高峰，達(dá)正常對照組的6倍之多，4周和6周有所下降，但仍達(dá)對照組的4倍多。表明，在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化過程中，不僅有IETM的發(fā)生，同時亦有內(nèi)毒素受體TLR4蛋白的高表達(dá)，但是TLR4的高表達(dá)似乎并非簡單的由內(nèi)毒素所致的受體上調(diào)效應(yīng)，可能還有其他的一些因素導(dǎo)致TLR4蛋白在肝臟的高表達(dá)，4周和6周有所下降，可能與受體下調(diào)效應(yīng)有關(guān)，也可能有“內(nèi)毒素耐受”機(jī)制的參與［7］，具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

TLR4作為LPS的信號傳導(dǎo)分子廣泛存在于單核、巨噬細(xì)胞系統(tǒng)中。我們的免疫組化結(jié)果顯示:正常對照組大鼠肝組織，在枯否細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞及一些肝細(xì)胞有微弱TLR4表達(dá);在纖維化肝組織中TLR4陽性細(xì)胞明顯增多，強(qiáng)陽性細(xì)胞主要是分布在肝竇周圍的枯否細(xì)胞和活化的HSCs，部分肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的膜上TLR4的表達(dá)也有所增強(qiáng)。采用連續(xù)切片發(fā)現(xiàn)，一些α－SMA陽性細(xì)胞同時也表達(dá)TLR4，進(jìn)一步證實(shí)了活化的 HSCs也表達(dá) TLR4。目前認(rèn)為HSCs是纖維化反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞［8］，而且 HSCs的激活與內(nèi)毒素有關(guān)［9］，傳統(tǒng)上認(rèn)為LPS通過對枯否細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞的刺激，導(dǎo)致一些炎癥介質(zhì)的釋放，并進(jìn)而激活HSCs轉(zhuǎn)化為肌纖維樣細(xì)胞表達(dá)α－SMA，使細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，降解減少，形成肝纖維化［10］，因此認(rèn)為 HSCs的激活是一種間接途徑。我們的實(shí)驗結(jié)果說明內(nèi)毒素也可以通過相關(guān)受體直接作用于肝星狀細(xì)胞，進(jìn)而在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

綜合我們的實(shí)驗結(jié)果表明，在肝纖維化形成早期，不僅血漿內(nèi)毒素明顯升高，而且肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞及非實(shí)質(zhì)細(xì)胞膜上的TLR4蛋白表達(dá)亦迅速增加，因此血漿內(nèi)毒素有可能通過上調(diào)TLR4來在肝纖維化中發(fā)揮作用。

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Expression，Distribution and Significance of TLR4 in the Liver in the Development of Hepatic Fibrosis

WANG Deng－ni1，XU Jun－quan1，SONG Wei－fang1，ZHANG Xiao－yang2，WANG Ming－liang1，LIANG Yong－gang1，SONG Bing－yu1
(1.Science and Technology Center，F(xiàn)enyang College of Shanxi Medical University，F(xiàn)enyang 032200，China;2.Department of Pathology，Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China)

Objective To observe the dynamic expression patterns of TLR4 protein in the rat liver with chronic fibrogenesis，and to explore the relationship of TLR4 expression with the pathogenesis of hepatic fibrosis.Methods A model of hepatic fibrosis was established using carbon tetrachloride subcutaneous injections in rats.The rats were designed to normal control group and four model groups(1 week，2 week，4 week，6 week).Liver tissue slides were stained with HE and sirius red to study the pathological changes in the livers.Hydroxyproline in liver tissues was measured，and plasma level of endotoxin was measured.Immunohistochemistry and Western blot were used to analyze the expression of TLR4 protein.The α－SMA was determined to observe the activation of HSCs.Results Compared with normal control group，hydroxyproline in liver tissues increased significantly from 2 week(P＜0.01).Plasma level of endotoxin increased significantly in each group(P＜0.01)，and there was significant positive correlation with hydroxyproline of liver(P＜0.01).The expression of TLR4 protein began to increase significantly from 1 week(P ＜0.01)，and to decline at 4 weekand 6 week(compared with 2 week，P＜0.05)，but still higher than the normal control group(P＜0.01).The location of TLR4 protein was found in kupffer cells，activated hepatic stellate cells，a few hepatic cells and endothelium cells.Conclusion Endotoxin and its receptor TLR4 might plays an important role in the liver fibrosis induced by CCl4 induced.

Endotoxin;Endotoxin receptor;Toll－like receptor－4;Hepatic fibrosis

R363

A

1671－7856(2010)06－0017－04

2010－01－14

圖1 肝組織病理學(xué)圖片（HE×100）
注：A：正常對照組，肝小葉結(jié)構(gòu)未見異常；B：模型組，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，匯管區(qū)有大量炎細(xì)胞浸潤。
Fig.1 Histopathology pictures of liver（HE×100）
Note: A: Normal control group， hepatic lobule structure Was normal; B: Model group， hepatic lobule structure Was destroyed， a large number of inflammatory cell could be seen next to portal septa.

圖2 肝組織膠原染色，紅色為膠原纖維 (×40)
注：A：正常對照組，中央靜脈和匯管區(qū)有少量膠原纖維；B：模型組，膠原纖維明顯增多。
Fig.2 Collagen staining in liver tissue，red for collagen fibers (×40)
Note: A: Normal control group， a small amount of collagen fibers could be seen next to portal septa and central veins; B: Model group，collagen fibers increased significantly.

圖3 兔疫組織化學(xué)染色 (×100)
注：A和B為TLR4兔疫組織化學(xué)染色，A：肝組織有微弱的TLR4表達(dá)；B：肝組織TLR4的表達(dá)明顯增強(qiáng)；C：為α-SMA兔疫組織化學(xué)染色，有多量α-SMA陽性肝星狀細(xì)胞。
Fig.3 Immunohistochemistry staining （×100)
Note：A and B respectively represented TLR4 immunohistochemistry staining of normal control group and model group， A: Rats in normal group， TLR4 protein expressed Weakly in liver tissues; B: The expression of TLR4 began to increase significantly; C represented α-SMA immunohistochemical staining of model group，had a amount of α-SMA positive hepatic stellate cells.

山西省回國留學(xué)人員科研資助項目(NO.2002－74)。

王登妮(1978－)，女，碩士，助教。E－mail:dengni99@126.com

徐軍全，男，碩士生導(dǎo)師。E－mail:xujq@sina.com