緊密連接蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的研究進(jìn)展

陳 琪，何明旭，韓麗萍

(1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272000；2.濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，山東 濟(jì)寧 272000)

非小細(xì)胞肺癌是最常見的最致命的原發(fā)性肺部惡性腫瘤，占所有肺癌患者的85%，且通常在晚期確診[1]。在非小細(xì)胞肺癌中，腺癌是最常見的亞型，其次是鱗狀細(xì)胞癌(鱗癌)[2]。盡管目前非小細(xì)胞肺癌在手術(shù)、化療和靶向分子治療方面取得了一定的進(jìn)展，但其預(yù)后仍較差，而癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是影響治療效果的重要原因之一。非小細(xì)胞肺癌來源于上皮，上皮細(xì)胞間緊密連接完整性的破壞將導(dǎo)致細(xì)胞間的黏附性喪失和細(xì)胞分化障礙，引起細(xì)胞增殖失控，從而導(dǎo)致腫瘤侵襲性增加。緊密連接蛋白(Claudins)是緊密連接的重要組成部分，決定著屏障性質(zhì)、細(xì)胞極性和細(xì)胞旁通透性。雖然Claudins在腫瘤細(xì)胞中的許多功能尚未闡明，但目前研究認(rèn)為，Claudins在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。本文就Claudin-1、Clauidn-3、Clauidn-6、Clauidn-7在非小細(xì)胞肺癌中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在進(jìn)一步明確Claudins在非小細(xì)胞肺癌中的作用，為非小細(xì)胞肺癌的基礎(chǔ)研究及臨床治療提供依據(jù)。

1 緊密連接

緊密連接是位于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞頂端的細(xì)胞間黏附結(jié)構(gòu)，主要存在于上皮細(xì)胞、 內(nèi)皮細(xì)胞間的連接復(fù)合體中。緊密連接由3種完整的跨膜蛋白(Claudins、連接黏附分子、閉鎖蛋白)和閉合小環(huán)蛋白(ZO-1、ZO-2和 ZO-3[3]等外周胞漿蛋白組成，其中跨膜蛋白介導(dǎo)細(xì)胞間的接觸，外周胞漿蛋白連接跨膜蛋白與細(xì)胞骨架。緊密連接的屏障功能可調(diào)節(jié)細(xì)胞外電荷的選擇性和溶質(zhì)滲透性，從而維持體內(nèi)液體和電解質(zhì)的平衡[4]。除了屏障功能外，緊密連接還具有柵欄功能，將細(xì)胞膜的頂端與其他區(qū)域隔開，從而阻止頂端和基底外側(cè)細(xì)胞膜之間的膜蛋白相互混合，參與細(xì)胞極性的形成[5]。

2 Claudins概述

目前在哺乳動物中，Claudins家族包括27個成員, 是緊密連接中最重要的結(jié)構(gòu)和功能成分，以組織和(或)細(xì)胞特異性的方式表達(dá)。Claudins家族成員之間具有相似的結(jié)構(gòu)：在細(xì)胞質(zhì)中的N-端和C-端4個跨膜結(jié)構(gòu)域之間有2個細(xì)胞外環(huán)(EL1和EL2)，內(nèi)部跨膜結(jié)構(gòu)域之間有1個短的、由20個殘基構(gòu)成的細(xì)胞內(nèi)環(huán)[6]。第一個細(xì)胞外環(huán)由約53個氨基酸組成，影響細(xì)胞外電荷的選擇性；第二個細(xì)胞外環(huán)只有約24個氨基酸組成，比第一個細(xì)胞外環(huán)要小得多，是產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素的受體。細(xì)胞外環(huán)是維持緊密連接功能和上皮屏障完整性所必需的，其羧基末端與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[7]。Claudins在調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞通透性及維持細(xì)胞極性等方面發(fā)揮重要作用[8]。此外，Claudins還與多種與細(xì)胞增殖和分化相關(guān)的信號通路有關(guān)[9]。

3 Claudins與非小細(xì)胞肺癌

Claudins的丟失以組織依賴的方式導(dǎo)致細(xì)胞連接缺失，故被認(rèn)為在腫瘤進(jìn)展(以癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移為特征)中發(fā)揮重要作用。具體機(jī)制為:①Claudins異常表達(dá)引起緊密連接紊亂和滲漏，有利于腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲;②細(xì)胞極性的降低增加了腫瘤的營養(yǎng)和生長因子供應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞的增殖加快;③細(xì)胞間黏附的減少可能會增加轉(zhuǎn)移風(fēng)險并促進(jìn)腫瘤的侵襲[10]。Claudins家族在相鄰細(xì)胞間形成同源和異源的相互作用，是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控因子。近年來研究表明，Claudins的異常表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)，可作為判斷非小細(xì)胞肺癌診斷、治療及預(yù)后的潛在標(biāo)記物[11]。在非小細(xì)胞肺癌中，Claudins的表達(dá)不同，作用也不盡相同。

3.1Claudin-1與非小細(xì)胞肺癌 Claudin-1分布廣泛，尤其高表達(dá)于肝臟、腎臟、皮膚等組織中，在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程中起重要作用[12]。

Claudin-1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用，受到相關(guān)學(xué)者廣泛研究。有研究通過芯片分析發(fā)現(xiàn)，Clauidn-1 過表達(dá)增加了侵襲抑制因子(結(jié)締組織生長因子、血小板反應(yīng)蛋白1等)的表達(dá)，敲除外源性或內(nèi)源性Claudin-1增加了腫瘤的侵襲和遷移能力，使患者的生存期縮短[13]，推測Claudin-1可能是肺腺癌患者預(yù)后的有力預(yù)測因子。一項納入344例肺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌患者Clauidn-1和Clauidn-7的表達(dá)均明顯降低，生存時間較短的肺腺癌患者Clauidn-1表達(dá)較低[14]。Clauidn-1的過表達(dá)抑制了癌細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。Zhang等[15]對81例肺腺癌患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-1受C-fos(癌基因)信號通路的調(diào)控，從而抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，Clauidn-1過度表達(dá)預(yù)示著肺腺癌患者的總體生存預(yù)后良好。Clauidn-1通過抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2信號通路來抑制鋅指轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移[16]。Pyo等[17]進(jìn)行的meta分析顯示, Clauidn-1低表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后不良顯著相關(guān)，與腺癌顯著相關(guān)，但與鱗癌無顯著相關(guān)性。另一方面，Sun等[18]使用免疫組化技術(shù)檢測了258例肺腺癌患者組織中Claudin-1的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，在大鼠肉瘤和表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號通路的調(diào)節(jié)作用下，Claudin-1表達(dá)陽性患者的預(yù)后比Claudin-1表達(dá)陰性的患者更差。目前關(guān)于Claudin-1對非小細(xì)胞肺癌患者診斷與預(yù)后的影響尚無統(tǒng)一定論，可能與入組患者在組織學(xué)亞型、腫瘤分期和吸煙史方面的差異相關(guān)。

3.2Claudin-3與非小細(xì)胞肺癌 Claudin-3是Clauidns家族的一員，又稱產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素受體2，由CLDN-3基因編碼，位于第7號染色體上[19]。 Claudin-3與產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞快速裂解，而產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素能夠有效地抑制 Claudin-3表達(dá)陽性的惡性腫瘤[20]。

Che等[20]對103例肺鱗癌術(shù)后患者進(jìn)行回顧性分析發(fā)現(xiàn)，Claudin-3通過E-鈣黏蛋白和β-連環(huán)蛋白信號通路調(diào)控細(xì)胞間的相互作用，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，是肺鱗癌術(shù)后患者預(yù)后的獨立危險因素。此外，通過實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction ，qRT-PCR )和免疫蛋白印跡方法檢測Claudin-3在肺鱗癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Claudin-3在肺鱗癌組織中表達(dá)明顯低于正常肺組織，Claudin-3異位過表達(dá)顯著抑制肺鱗癌細(xì)胞株(H520)的遷移、侵襲和EMT[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-3在腺癌組織中表達(dá)增加與患者癌癥進(jìn)展、生存期縮短均相關(guān)(P=0.041和0.029)[22]。Ma等[19]對非鱗狀非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(H460、H1792、H157、H292和A549)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-3在雌激素受體α的調(diào)控下發(fā)揮促癌調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)腫瘤的侵襲。

Claudin-3在鱗癌中低表達(dá)，過表達(dá)Claudin-3的肺鱗癌患者預(yù)后較好；而Claudin-3在腺癌患者中高表達(dá)，低表達(dá)Claudin-3的腺癌患者預(yù)后較好。Claudin-3可作為區(qū)分肺腺癌和鱗癌的生物學(xué)標(biāo)志物，并作為治療的靶點。

3.3Claudin-6與非小細(xì)胞肺癌 Claudin-6是極化上皮和內(nèi)皮細(xì)胞Claudins的重要組成部分之一，在維持細(xì)胞完整性方面起著至關(guān)重要的作用，可參與調(diào)節(jié)表皮屏障并保持上皮通透性[23]。Claudin-6是唯一具有潛在特異性的Claudins，它可以激活細(xì)胞黏附信號，調(diào)節(jié)核受體的活性, 其異常表達(dá)還與腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲有關(guān)[10]。既往研究表明，Claudin-6在胎兒胃、胰腺、肺、腎等組織中高表達(dá)，但在健康成人組織中不表達(dá)[24]。Claudin-6已被證實在子宮內(nèi)膜癌、食管鱗癌、胃癌等多種癌癥中差異表達(dá)，并參與發(fā)病[10, 25]。近年來Claudin-6在非小細(xì)胞肺癌中的作用得到了廣泛關(guān)注，其研究并正在進(jìn)行中。

有研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-6在各種人類實體癌(如睪丸癌、卵巢癌、子宮癌和肺腺癌等)組織中高表達(dá)[26]，認(rèn)為Claudin-6是一種嚴(yán)格的癌胚細(xì)胞表面抗原，僅在腫瘤組織中表達(dá)。Micke等[27]發(fā)現(xiàn)Claudin-6高表達(dá)與肺腺癌患者的預(yù)后不良相關(guān)。Claudin-6在包括肺腺癌和鱗癌在內(nèi)的大多數(shù)惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，作為促癌基因，促進(jìn)腫瘤的遷移和侵襲[28]。另有研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-6在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中呈陽性，但在正常肺細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞中呈陰性，Claudin-6的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期(tumour-node-metastasis，TNM)相關(guān)[10]。但是，Wang等[29]研究發(fā)現(xiàn)Claudin-6在非小細(xì)胞肺癌組織中的低表達(dá)率明顯高于周圍非腫瘤組織，相對于對照組，低表達(dá)Claudin-6的非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤分期較晚，更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，生存率更低、預(yù)后更差。

關(guān)于Claudin-6在非小細(xì)胞肺癌患者中的臨床意義存在爭議，導(dǎo)致研究結(jié)論不一致甚至矛盾的原因有很多，包括實驗標(biāo)本的選擇、單克隆抗體的使用、不同的實驗方法和對結(jié)果的解釋等，所以需要更多可靠研究得出更有說服力的結(jié)果。

3.4Claudin-7與非小細(xì)胞肺癌 Claudin-7廣泛分布于胃、腸道、肺、腎臟、膀胱和皮膚，與通常只位于腸上皮細(xì)胞頂部的其他Claudins不同，Claudin-7具有獨特的細(xì)胞分布特征，它不僅分布于腸頂端上皮細(xì)胞，還高表達(dá)于腸上皮細(xì)胞側(cè)面和基底部[30]。Claudin-7的異常表達(dá)導(dǎo)致緊密連接的破壞、細(xì)胞接觸抑制的喪失、增殖和遷移的異常，并與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

Akizuki等[31]通過半定量PCR和qRT-PCR檢測肺鱗癌Claudin-5，Claudin-7，Claudin-18 的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，上述Claudins在肺鱗癌中的表達(dá)水平明顯低于正常組織，并且Claudin-5，Claudin-7和Claudin-18通過抑制蛋白激酶B的磷酸化，從而抑制人肺鱗癌細(xì)胞的增殖。Lu等[32]通過免疫共定位和免疫共沉淀法證實，Claudin-7在人肺癌細(xì)胞中與整合素β-1共定位并形成蛋白質(zhì)復(fù)合體，抑制肺癌細(xì)胞增殖。敲除Claudin-7不僅促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖，而且破壞了整合素β-1的定位。一項對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(HCC827)的研究證實，在包括肺腺癌在內(nèi)的各種癌細(xì)胞和組織中，Claudin-7通過與整合素β-1的調(diào)節(jié)作用，維持肺腺癌細(xì)胞系的上皮細(xì)胞附著，從而抑制肺腺癌細(xì)胞增殖[33]。Claudin-7在肺癌組織中低表達(dá)，是一種潛在的抗癌蛋白，敲除Claudin-7，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲性增加[34]。Claudin-7在正常組織中的表達(dá)高于肺癌組織, 表達(dá)水平越高，肺癌細(xì)胞分化程度越高(P<0.05)[35]，提示Claudin-7的表達(dá)抑制肺癌進(jìn)展。

Claudin-7是潛在的抑癌基因，Claudin-7的低表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者的不良預(yù)后緊密相關(guān)，可作為診斷和預(yù)后的標(biāo)記物。

4 Claudins與非小細(xì)胞肺癌的治療

Claudins是肺癌細(xì)胞中EMT的誘導(dǎo)物，而EMT負(fù)責(zé)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[36]。越來越多的證據(jù)表明，Claudins與EMT、癌癥干細(xì)胞的形成、對臨床常規(guī)化療藥物的耐藥性相關(guān)[6]。研究表明，分化細(xì)胞可通過EMT過程產(chǎn)生具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞，因此EMT和腫瘤干細(xì)胞之間的軸可能是非小細(xì)胞肺癌的有利治療靶點[11]。Claudins介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)功能的失調(diào)是癌癥的危險因素，Claudins通過與許多其他信號分子的相互作用，參與了非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移，涉及不同的信號通路，可為將來非小細(xì)胞肺癌的靶向治療提供更多的靶點[37]。

5 小結(jié)

Claudins作為細(xì)胞間緊密連接的重要參與者，它在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的失調(diào)與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、惡性程度、局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在不同非小細(xì)胞肺癌病理類型中，Claudins家族的表達(dá)也不盡相同，目前Claudins的功能特點、調(diào)控機(jī)制、與其他緊密連接成員的相互作用及促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制仍在研究當(dāng)中。隨著研究的進(jìn)一步深入，Claudins作為生物標(biāo)記物和治療靶點在非小細(xì)胞肺癌的臨床診治中會有更加廣泛的應(yīng)用。