泛素化機制在蜱類免疫反應信號通路中的作用*

施明杰 劉智通 孫 毅

(軍事科學院軍事醫(yī)學研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，媒介生物危害和自然疫源性疾病北京市重點實驗室，北京 100071)

蜱，隸屬于無脊椎動物門蛛形綱蜱目，是一類專職吸血的非永久性體外寄生節(jié)肢動物，下分軟蜱科(Argasidae)、硬蜱科(Ixodidae)、納蜱科(Nuttalliellidae)以及新提出成立的恐蜱科(Deomocrotonidae) (Anderson, 2002, 2008; 周錦萍etal., 2011)。蜱是人和動物多種疾病的傳播媒介，包括各種細菌、病毒、立克次體、螺旋體等病原微生物。近年來蜱媒疾病的不斷發(fā)生引起了廣泛的關注，許多經(jīng)典蜱媒疾病，如森林腦炎、出血熱、Q熱等，以及各種新發(fā)蜱媒傳染病，如萊姆病、無形體病和2010年發(fā)現(xiàn)的發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome disease, SFTS)也在不斷威脅著公共衛(wèi)生安全和人類的健康(Yuetal., 2011)。蜱在叮咬吸血的過程中，病原體隨著血餐進入到蜱類中腸，之后通過中腸圍食膜屏障進入血淋巴，再由血淋巴輸送至唾液腺，利用胞吞作用突破屏障進入蜱類唾液腺，在唾液腺中經(jīng)過增殖和/或發(fā)育后再胞吐隨著唾液進入宿主動物(人)體內(nèi)完成病原體傳播循環(huán)(Reuben Kaufman, 2010)。不同的蜱媒病原體具有不同的表征，如肽聚糖、脂多糖、葡聚糖等，可以被媒介蜱種唾液腺細胞表面模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)特異性的識別，通過形成特定的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)而與唾液腺細胞相互作用(Schwan, 1996; Bugryshevaetal., 2001; Lemaitreetal., 2007; Lindsayetal., 2014)。蜱內(nèi)唾液腺細胞接收到模式識別受體PRR傳遞的病原入侵信號后對信號進行進一步的加工整合，以非線性級聯(lián)反應的方式激活細胞內(nèi)各種調(diào)控通路，如Janus激酶信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子通路(janus kinase-signal transducer and activator of transcription pathways, JAK-STAT)、免疫缺陷途徑通路(immune deficiency pathway, IMD)和核因子-κB信號通路(nuclear factor-kappa B signaling pathways, NF-κB)等調(diào)控通路，產(chǎn)生免疫應答反應(Costaetal., 2009; Robertsonetal., 2009)。與此同時，病原體能夠利用各種信號調(diào)控通路去調(diào)節(jié)唾液腺細胞分泌的多種效應分子，如C3、C5補體抑制劑系列和宿主免疫調(diào)節(jié)因子 Salp系列等，通過分子互作進一步誘導病原體表型或效應分子的改變，從而發(fā)揮補體抑制、免疫調(diào)節(jié)和免疫逃逸等作用，造成病原體在媒介蜱種中的持續(xù)性感染，影響著蜱媒病原的傳播效能(Bowmanetal., 1997; Valenzuelaetal., 2000; Dasetal., 2001; Gillespieetal., 2001; Couvreuretal., 2008; Shoemakeretal., 2008)。因此，明確蜱媒病原體與唾液腺細胞相互作用的信號調(diào)控元件及通路、揭示蜱媒病原傳播的分子基礎，有助于制定和優(yōu)化蜱媒疾病的防控策略，從而阻斷蜱媒疾病的傳播。

蜱類免疫系統(tǒng)與其他無脊椎動物的免疫系統(tǒng)類似，而相比于脊椎動物來說則更加原始和簡單，只呈現(xiàn)先天免疫反應(Fogacaetal., 2021)。蜱類的先天免疫主要包括兩個方面, 一是體液免疫，其中包括抗菌肽、防御素等；二是細胞防御，即細胞吞噬(phagocytosis)和包囊(encapsulation)作用。在細胞防御中，一些多樣化的免疫信號通路(Toll、IMD、JAK/STAT通路)、小RNA干涉通路(RNA inference pathway)和相關重要免疫因子已經(jīng)被證實參與蜱媒病原的感染和傳播過程(Kazimirovaetal., 2013; Kotaletal., 2015; Simoetal., 2017；Aguilar-Díazetal., 2021)。本文就蜱類主要免疫系統(tǒng)信號通路及泛素化在蜱類調(diào)控信號通路和免疫逃逸方面的作用進行綜述，以期能夠為制定蜱媒疾病防控策略提供技術支持。

1 蜱類細胞免疫信號通路

1.1 Toll信號通路

節(jié)肢動物有一系列用于預防和控制感染的抗病毒機制，包括RNA干擾(RNA interference)、抗病毒肽如防御素(defensins)和利用Toll受體的檢測機制等(Kopaceketal., 2010; Ruckertetal., 2014; Schnettleretal., 2014; Talactacetal., 2017)。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLRs)是公認的模式識別受體，它們對包括病毒在內(nèi)的微生物感染起著關鍵性的作用(Akiraetal., 2004)。通過與不同的病原體基序的特異性結合，TLRs可以激活機體對病原感染的免疫反應。TLRs保守結構是由一個氨基末端富含亮氨酸重復序列(leucine-rich repeat, LRRs)的胞外結構域、一個跨膜區(qū)和Toll-白介素受體(toll-interleukin receptor, TIR)信號結構域組成(Belletal., 2003)。TLRs在無脊椎動物和脊椎動物中的廣泛存在，說明了TLRs對控制感染的重要性(Buchmann, 2014)。在果蠅中，TLRs通過識別細菌細胞壁表面的肽聚糖(peptidoglycan, PGN)和真菌細胞壁中的葡聚糖，形成相應的病原相關分子模式(PAMPs)，從而優(yōu)先激活Toll信號通路(Lemaitreetal., 2007; Lindsayetal., 2014)。Toll途徑中的大部分元件(Smithetal., 2014; Gulia-Nussetal., 2016; Rosaetal., 2016; Oliva Chavezetal., 2017)已經(jīng)通過生物信息學和基因組學手段在蜱類中發(fā)現(xiàn)，但至今尚未有明確的結論。Rosa等(2016)人發(fā)現(xiàn)邊緣無形體Anaplasmamarginale感染微小扇頭蜱RhipicephalusmicroplusBME26細胞系后，Toll信號通路途徑成分中大部分元件基因表達下調(diào)，并推測這可能與其在微小扇頭蜱中感染繁殖和共進化適應有關。相反，肩突硬蜱Ixodesscapularis若蜱Toll基因(ISCW018193)的沉默對吞噬細胞無形體A.phagocytophilum在唾液腺中的定植沒有任何影響，但不能排除Toll途徑參與吞噬細胞無形體A.phagocytophilum的感染調(diào)控(Liuetal., 2012)。因而，在基因?qū)用嫔希≡⑸锔腥究赡軙种芓oll信號通路的相關元件而促進感染，但尚需進一步驗證。未來，依賴已經(jīng)獲得的生物信息學和基因組學數(shù)據(jù)，對蜱類Toll信號通路關鍵性元件及其相互作用的深入認知，將有助于發(fā)現(xiàn)阻斷蜱媒病原傳播的關鍵靶點。

1.2 JAK/STAT信號通路

JAK/STAT信號通路往往被看做是Toll和IMD途徑的旁支通路，在調(diào)控細菌和真菌感染方面發(fā)揮作用。蜱類中的JAK/STAT信號通路的生物學功能也逐漸被認知。在肩突硬蜱中，JAK/STAT調(diào)控著吞噬細胞無形體A.phagocytophilum在唾液腺和血淋巴中的增殖和感染，5.3 kDa的AMP是其發(fā)揮調(diào)控作用的效應器(Liuetal., 2012)。同樣，微小扇頭蜱中JAK/STAT信號通路與AMPs的調(diào)節(jié)有關，STAT缺陷導致蜱蟲唾液腺中AMPs ixodidin和溶菌酶以及腸道和唾液腺中的防御素下降(Capelli-Peixotoetal., 2017)。此外，圍食膜因子-1(peritrophin-1)也是蜱類JAK/STAT信號通路的另一效應物。圍食膜因子-1的雙向調(diào)節(jié)作用，既能增加伯氏疏螺旋體Borreliaburgdorferi在肩突硬蜱若蜱腸道中的存活率，從而有利于伯氏疏螺旋體B.burgdorferi的定植；也能通過腸道上皮的修復和更新，擾亂腸道微生物群而調(diào)節(jié)吞噬細胞無形體A.phagocytophilum含量(Narasimhanetal., 2014; Abrahametal., 2017)。但由于JAK/STAT信號通路中細胞信號跨膜受體Domeless的缺失，蜱類激活JAK/STAT信號通路的方式、其信號接收和傳導過程是否有新的跨膜蛋白參與或與別的通路產(chǎn)生交互，還有待進一步明確。

1.3 IMD信號通路

免疫缺陷途徑是調(diào)控大多數(shù)抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)基因表達的最重要的途徑(Ferrandonetal., 2007)。存在于蜱的血淋巴、脂肪體、腸道、卵巢和唾液腺等組織或器官中的抗菌肽是經(jīng)誘導產(chǎn)生的一類具有廣泛抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)(Buletetal., 2004; Sonenshineetal., 2008)。這些抗菌肽按來源可分為3類，(1)外源性AMPs，如蜱蟲利用宿主血紅蛋白衍生的殺血菌素(hemocidins)(Cruzetal., 2010; Dubinetal., 2005)；(2)內(nèi)源性AMPs(核糖體合成的AMPs)，如microplusins(又稱為hebraeins)、防御素(Pelcetal., 2014; Martinsetal., 2019)；(3)通過基因轉(zhuǎn)移而獲得的AMPs，如Dae2(Chouetal., 2015)；在不同蜱種中廣泛存在，并抵御多種病原微生物產(chǎn)生危害。

研究發(fā)現(xiàn)，埃及伊蚊Aedesaegypti體內(nèi)IMD信號通路激活后能夠控制其中腸微生物群的水平，并且也能夠允許蚊媒病毒在體內(nèi)進行復制(Kleinoetal., 2014)。同樣的，節(jié)肢動物能夠利用圍食膜和IMD信號通路去對抗腸道中的革蘭氏陽性細菌的感染，并且依賴于IMD信號通路途徑來控制入侵細菌的排出(Barlettaetal., 2017; Horietal., 2018)?？梢姡?jié)肢動物中IMD信號通路途徑對于控制革蘭氏陽性菌的感染傳播存在著重要的作用。故而，有理由推測蜱類IMD信號通路途徑也應當存在類似功能。

研究證實，果蠅中經(jīng)典的IMD途徑是通過唾液腺細胞表面的肽聚糖識別蛋白(peptidoglycan recognition proteins, PGRPs)來識別細菌細胞壁中存在的二氨基戊二酸型肽聚糖(diaminopimelic acid-type PGN, PG) 來控制的，又稱為DAP型肽聚糖 (Lemaitreetal., 2007；Kleinoetal., 2014)。在識別成功后，受到PG的刺激，胞內(nèi)會形成一類由IMD蛋白、dFADD蛋白以及DREDD蛋白三者組成的三聚體蛋白復合物。該復合物中DREDD蛋白能夠被E3泛素連接酶凋亡抑制劑(DIAP-2)通過泛素化的方式激活(Meinanderetal., 2012)。激活后的DREDD裂解IMD并通過依賴K63途徑泛素化IMD蛋白，隨后依賴于K63多聚泛素化鏈招募并激活轉(zhuǎn)化生長因子-β激活激酶1(transforming growth factor-beta activated kinase 1, TAK1)，進而依靠泛素結合基序激活TAK1/TAB2(TAK1-binding protein 2, TAK1連接蛋白)復合物，最終通過TAK1/TAB2復合物激活IMD信號通路NF-kB激酶抑制因子(IKK)/Relish分支和JNK通路，Relish通過IKK復合物介導的磷酸化和DREDD的裂解雙重控制激活后被切割為兩部分，其中羧基端部分留在細胞質(zhì)中，而活性氨基端部分轉(zhuǎn)移到細胞核啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄(Stovenetal., 2003; Kimetal., 2005; Paquetteetal., 2010)。

然而，通過對蜱類生物信息學數(shù)據(jù)的分析卻發(fā)現(xiàn)其IMD信號通路途徑缺乏包括跨膜蛋白PGRPs、具有死亡結構域的Fas相關蛋白(FADD)、受體蛋白IMD和死亡相關的ced-3/Nedd2樣蛋白(DREDD)等許多重要通路元件的同源基因(Smithetal., 2014; Gulia-Nussetal., 2016; Rosaetal., 2016; Shawetal., 2017)。這種IMD途徑成分丟失的情況在其他蛛形綱和半翅目昆蟲中也同樣發(fā)生(Palmeretal., 2015; Nishideetal., 2019)，除了基于標準基因結構的錯誤注釋這一可能的原因外(Salcedo-Porrasetal., 2019)，IMD通路元件的同源基因的系統(tǒng)發(fā)育和進化也是需要明確的科學問題。

有趣的是，盡管缺少幾個元件，蜱中IMD途徑仍然具有重要的抗菌功能，并能對不同類的病原體產(chǎn)生響應，并因此被稱為“非常規(guī)免疫缺陷途徑”(Capelli-Peixotoetal., 2017; Shawetal., 2017; McClure Carrolletal., 2019)。蜱類通過識別革蘭氏陰性菌細胞膜上的甘油磷脂來激活非常規(guī)IMD途徑，包括1-棕櫚?；?2-油酰基-錫-甘油-3-磷甘油(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol-3-phosphoglycerol, POPG)和1-棕櫚?；?2-油酰基-二酰甘油(1-palmitoyl-2-oleoyl diacylglycerol, PODAG)，但具體的識別機制仍不清楚，需得到進一步驗證，但不可否認的是該通路因此被激活(Shawetal., 2017)。

此外，研究進一步發(fā)現(xiàn)蜱類非常規(guī)IMD途徑上游成分——X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)在信號傳導過程中發(fā)揮著重要功能。XIAP是一類具有細胞凋亡作用的蛋白，其分子結構中含有兩個特征性的結構域：一個是桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復序列(baculoviral IAP repeat, BIR)結構域，另一個是“真正有趣新基因”(really interesting new gene, RING)結構域(Beugetal., 2012; Severoetal., 2013)。其BIR結構域能夠與鋅原子相結合，而RING結構域則具有E3泛素連接酶活性，可以促進XIAP自身或與其相互作用的蛋白分子泛素化而降解。研究發(fā)現(xiàn)，在肩突硬蜱I.scapularis中E3泛素連接酶XIAP能夠抑制吞噬細胞無形體A.phagocytophilum在蜱內(nèi)的定植，通過沉默XIAP，吞噬細胞無形體A.phagocytophilum的定植顯著增加，同時還發(fā)現(xiàn)XIAP多聚泛素化依賴于其RING結構域催化且通過賴氨酸(K)-63途徑，而非K48途徑，同時在K63泛素化途徑中需要鋅來催化，BIR結構域?qū)︿\的捕獲促進了泛素化過程的實現(xiàn)(Severoetal., 2013)。非常規(guī)IMD途徑中，XIAP在被POPG和PODAG激活后，能夠與異二聚體E2結合酶復合物(the heterodimer E2 conjugating enzyme complex) Bendless:UEV1a特異性地結合，以K63依賴方式結合并泛素化p47底物(Shawetal., 2017)。而泛素化的p47能夠與Kenny(又名NEMO)連接，并誘導NF-kB激酶抑制因子β(IKKβ)(又名IRD5)的磷酸化，進而誘導IMD途徑轉(zhuǎn)錄因子Relish被切割，隨后Relish活性N端部分轉(zhuǎn)移到細胞核啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄(McClure Carrolletal., 2019)。進一步的研究也證實了這一級聯(lián)反應中各種組分確實參與了肩突硬蜱若蜱中吞噬細胞無形體A.phagocytophilum和伯氏疏螺旋體B.burgdorferi定植數(shù)量的控制(Shawetal., 2017)。而果蠅經(jīng)典IMD途徑中TAK1和TAB1蛋白基因敲除后對吞噬細胞無形體A.phagocytophilum定植沒有影響，從側(cè)面也佐證了蜱中IMD途徑的激活和傳導與果蠅等其他模式生物中IMD途徑具有特殊性(Liuetal., 2012)。借助這一點，針對該非常規(guī)IMD途徑的繼續(xù)深入探索，明晰其信號傳導反應途經(jīng)和關鍵元件如E3泛素連接酶XIAP的系統(tǒng)進化關系對于控制蜱及蜱媒病原的傳播具有重要意義。

2 泛素及泛素化在蜱類免疫反應中的作用

2.1 泛素和泛素化

泛素(Ubiquitin, Ub)是真核生物一種高度保守的、由76 aa組成的多肽，可通過E1、E2和E3三種酶的級聯(lián)反應與其他蛋白質(zhì)進行結合(Pickart, 2001)。泛素的“信號”是由含有一個或多個泛素連接結構域的特定泛素“受體”識別的(Dikicetal., 2009)。有20多種不同類型的泛素連接結構域，這些結構域嵌入到大量的細胞蛋白中。而泛素修飾就是通過泛素和存在于特殊蛋白中的泛素受體之間的低親和力、非共價的相互作用來識別，表明這種結合具有高度的動態(tài)性和特異性調(diào)節(jié)的性質(zhì)。因此，泛素結合和去泛素結合以及泛素連接蛋白一起構成了泛素介導的多種細胞過程調(diào)控的分子機制，在信號通路的傳導過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能(Cooketal., 1992; Varadanetal., 2004; Jiangetal., 2011)。

另外，對于泛素來說，可以通過自身賴氨酸殘基(Lysine, K)以單一泛素(單泛素化)或多聚鏈狀泛素(多泛素化)兩種形式連接到靶蛋白上。不同泛素鏈類型以及靶蛋白的不同，產(chǎn)生的作用也不一樣，例如最常見的K48連接的泛素化鏈采用扭曲拓撲結構，通常以蛋白酶體的降解作為靶標；相反地，K63連接的泛素化鏈則采用線性“串珠”狀結構，通常被用作激活NK-κB信號通路和細胞存活的關鍵信號傳導，如DNA修復和蛋白激酶激活等(Cooketal., 1992; Varadanetal., 2004; Hoelleretal., 2006; Chenetal., 2009)。此外，通過泛素的其他賴氨酸殘基位點連接的多聚泛素鏈在細胞中也被發(fā)現(xiàn)但未確定其功能，如K6、K11、K27、K29、K33；許多類泛素蛋白也能夠通過修飾其他靶蛋白而發(fā)揮功能，包括SUMO(small ubiquitin-related modifier)、NEDD8、ATG12等(Kerscheretal., 2006; Xuetal., 2009)。

而上述多種泛素化類型都離不開其共性反應過程和關鍵功能酶，泛素化由E1泛素激活酶、E2泛素結合酶和E3泛素連接酶組成的三級酶聯(lián)反應組成，作為一種通用的翻譯后修飾，廣泛應用于免疫系統(tǒng)的各個方面，包括先天免疫系統(tǒng)對病原體的識別和清除、抗原提呈和適應性免疫系統(tǒng)的激活等(Jiangetal., 2011)。研究發(fā)現(xiàn)，泛素化底物和泛素鏈類型的選擇很大程度上取決于E2泛素結合酶和E3泛素連接酶，而E3泛素連接酶因其又能嚴格控制泛素化的效率而成為泛素化級聯(lián)反應的關鍵成分(Zhengetal., 2017; Cabezas-Cruzetal., 2019)。對于E3泛素連接酶來說，主要依據(jù)其功能結構域分為兩種，含有一個RING結構域或一個HECT結構域，用來介導E2泛素結合酶的結合以及泛素化過程，如E3泛素連接酶cullin-RING家族(Petroskietal., 2005)。有趣的是，目前已經(jīng)證實很多病原體進化出許多方法來利用泛素化系統(tǒng)，例如對關鍵的免疫蛋白進行降解；通過干擾或阻斷重要的抗菌途徑中的泛素調(diào)節(jié)機制；甚至通過劫持泛素系統(tǒng)來促進自身的繁殖和致病。因而對蜱媒疾病的阻斷和預防也避不開E3泛素連接酶這一關鍵元件。

2.2 E3泛素連接酶在免疫信號通路中的作用

研究發(fā)現(xiàn)，泛素化參與了Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)下游的NK-κB和分裂素激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)級聯(lián)反應的激活。例如TNF受體相關因子6(TRAF6)是含有RING結構域的E3泛素連接酶之一，通過與UBC13和UEV1A組成的E2泛素復合物結合，催化K63泛素化鏈的合成，合成的K63泛素化鏈進一步導致TAK1激活，從而激活MAPK級聯(lián)反應；同時，K63泛素化鏈還能促進TAK1對IKKβ的磷酸化導致IKK磷酸化NF-κB抑制劑(IKK phosphorylates NF-κB inhibitor, IκB)蛋白被F-box蛋白βTrCP(SCFβTrCP)識別，而SCFβTrCP也是E3泛素連接酶復合物的一個亞單位，泛素化作用于磷酸化后的IκB蛋白使其被蛋白酶體降解，使得NF-κB進入細胞核、開啟靶基因的表達，從而促進T細胞的增殖、存活和細胞因子的產(chǎn)生(Kanayamaetal., 2004; Sunetal., 2004; Liuetal., 2011; Wangetal., 2001)。

此外，另一種E3泛素連接酶TRAF3也能夠被招募到TLRs下游級聯(lián)反應中，通過激活TBK1和IKKε，導致干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3, IRF3)磷酸化和Ⅰ型干擾素(IFN)的產(chǎn)生(Hackeretal., 2006; Oganesyanetal., 2006)。值得一提的是，不同類型的泛素化可以協(xié)同作用來確定特定的信號輸出，例如在TLRs下游級聯(lián)反應中，由于不同TLR受體誘導的途徑不同，招募的泛素連接酶種類也不同，其中TLR4誘導激活的途徑中，幾種E3泛素連接酶介導的細胞凋亡抑制蛋白(cIAP)泛素化而促進TRAF3的降解能夠激活MAPK級聯(lián)反應，而TLR介導的NK-κB的激活卻不需要TRAF3的降解(Tsengetal., 2010)。

泛素化在抗病毒感染方面作用的研究發(fā)現(xiàn)，在人類中，丙型肝炎病毒能夠使用病毒蛋白酶NS3-NS4A來切割線粒體膜上的抗病毒信號蛋白(MAVS)，從而幫助病毒逃避宿主免疫反應造成持續(xù)性感染。但E3泛素連接酶包括三基序包含蛋白(tripartite motif-containing protein 25, TRIM25)、Riplet(也稱為RNF135)都能夠通過泛素化激活維甲酸誘導基因Ⅰ(retinoic acid-inducible gene Ⅰ, RIG-I)途徑，從而通過促進MAVS的大量聚集誘導產(chǎn)生Ⅰ型IFNs來抵御病毒感染(Lietal., 2005; Meylanetal., 2005; Gacketal., 2007; Houetal., 2011; Oshiumietal., 2009)。同樣，在細胞質(zhì)中DNA誘導的IFN途徑中，E3泛素連接酶TRIM56能夠通過刺激K63連接的干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)多泛素化而促進TBK1的募集(Tsuchidaetal., 2010; Barber, 2011)。此外，E3泛素連接酶TRIM5在限制逆轉(zhuǎn)錄病毒感染中也起著關鍵性作用，TRIM5能夠通過泛素化病毒衣殼蛋白并針對降解來限制逆轉(zhuǎn)錄病毒，同時病毒衣殼蛋白能夠強烈刺激TRIM5合成游離的多泛素鏈，激活TAK1激酶復合體，啟動先天免疫反應(Xiaetal., 2009; Perteletal., 2011)。

此外，在哺乳動物中的研究證實E3泛素連接酶介導的泛素化在抗原提呈、獲得性免疫中也發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。例如在小鼠樹突狀細胞(DCs)中，抗原提呈細胞(antigen-presenting cells, APCs)表面MHC-Ⅱ類分子隨著DCs細胞逐漸成熟而不再泛素化，這加強了MHC Ⅱ的表達和聚集，增強了抗原提呈能力(Shinetal., 2006; van Nieletal., 2006)；兩種E2酶，UBC5和UBC13能夠與肉瘤相關皰疹病毒(Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus, KSHV)E3泛素連接酶一起作用誘導表面MHC-Ⅰ類分子的內(nèi)吞，從而幫助病毒逃避細胞毒性T細胞的殺傷(Duncanetal., 2006)；在T細胞下游信號成分中E3泛素連接酶PELI1的缺失能夠?qū)е耇細胞的過度激活(Changetal., 2011)；類似的，在B細胞中已經(jīng)提出了泛素化介導的MAPK和非典型性NF-κB信號通路的激活機制，通過招募E3泛素連接酶TRAF2和cIAP，TRAF2通過K63泛素化鏈激活cIAPs，cIAP進一步誘導K48泛素化鏈合成和TRAF3的降解，向胞漿中釋放MAPK激酶的信號復合體，隨后激活JNK和MAPK級聯(lián)反應，而TRAF3的降解能夠穩(wěn)定NF-κB誘導激酶(NIK)并使其磷酸化，NIK磷酸化后激活IKKα進而磷酸化NF-κB前體P100，P100隨后被E3泛素連接酶復合物SCFβTrCP多泛素化，并被蛋白酶體加工成成熟的p52亞基。然后，p52與另一個NF-κB亞基REL-B一起發(fā)揮作用，啟動對B細胞存活、成熟和激活至關重要的基因的表達(Neumannetal., 2007; Matsuzawaetal., 2008; Vallabhapurapuetal., 2008)。

2.3 E3泛素連接酶在病原體免疫逃逸中的作用

盡管許多病原體(如病毒和細菌等)缺乏經(jīng)典的泛素化系統(tǒng)，但為了自身生存，它們進化中具備了通過基因流動和/或趨同進化而獲得泛素化相關成分的能力并利用泛素化調(diào)控宿主的免疫反應，破壞宿主免疫系統(tǒng)，這反映出泛素化系統(tǒng)在免疫防御中的重要地位。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多病毒和細菌的E3泛素連接酶與宿主蛋白的序列相似，表明它們是通過基因轉(zhuǎn)移獲得的(Zhuetal., 2008; Quezadaetal., 2009; Jiangetal., 2011)。

一些病原體可以通過降解宿主關鍵性的E3泛素連接酶或是通過抑制泛素化途徑、甚至是利用泛素化系統(tǒng)來降解關鍵性靶標蛋白等不同的方式，來阻斷宿主相關免疫反應通路的激活。例如輪狀病毒蛋白NSP1通過誘導SCFβTrCP的降解阻斷NF-κB的激活(Graffetal., 2009)；沙門氏菌蛋白SseL具有去泛素化活性而抑制IκBα的泛素化(Le Negrateetal., 2008)；HIV蛋白Vpu則通過SCFβTrCP誘導CD4和骨髓基質(zhì)抗原2(bone marrow stromal antigen 2, BST2)的降解來控制HIV感染(Andrewetal., 2010)。此外，干擾素的分泌對于宿主的抗病毒反應是十分重要的，副黏病毒V蛋白能夠通過組裝成為cullin-RING E3泛素連接酶復合體來招募STATs蛋白并對其泛素化，進而誘導其降解、阻斷JAK/STAT信號通路實現(xiàn)免疫逃逸(Ramachandranetal., 2009)。

同樣，病原體也能夠通過去泛素化途徑來抑制相關免疫信號通路。例如克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus)的L蛋白氨基端具有一個OTU結構域，該結構域已知能夠介導去泛素化反應，OUT結構域的表達抑制了TNF誘導的NF-κB通路的激活，并且抵消了體內(nèi)泛素樣蛋白ISG15的抗病毒活性(Frias-Stahelietal., 2007; Skaugetal., 2010)。此外，單純皰疹病毒1型(HSV-1)編碼的ICP0多功能蛋白具有泛素連接酶的活性，能夠招募細胞內(nèi)去泛素化蛋白酶USP7使得TRAF6和NEMO去泛素化，從而抑制了TLR-NF-κB通路(Daubeufetal., 2009)。

2.4 E3泛素連接酶在釋放病毒顆粒中的作用

拉薩病毒(LASV)和莫培亞病毒(MOPV)是關系密切的嚙齒類蟲媒病毒，E3泛素連接酶ITCH雖不參與蟲媒病毒Z蛋白的泛素化，但能夠與拉薩病毒和莫培亞病毒Z蛋白的PPxY結構域相互作用，參與病毒的組裝和傳染性子代病毒的釋放(Bailletetal., 2019)。同樣，埃博拉病毒(EBOV)和馬爾堡病毒(MARV)的VP40基質(zhì)蛋白都能夠通過其PPxY-L型結構域與E3泛素連接酶中的WW結構域相互作用，以招募宿主的E3泛素連接酶Nedd4、進而促進病毒的復制和釋放(Hanetal., 2016)。

上述泛素化過程和E3泛素連接酶作用無論是縱向思考在宿主還是在病原生物中，或是橫向思考在免疫相關信號通路的激活和傳導、抗病毒感染、免疫逃逸、病毒顆粒的釋放等方面都發(fā)揮著極其關鍵且重要的作用，因此，借助E3泛素連接酶這一突破口，深刻認知泛素化和E3泛素連接酶在蜱、病原及宿主動物三者之間的作用尤為關鍵，可能為未來的蜱媒疾病的防控提供技術和策略。

2.5 E3泛素連接酶在節(jié)肢動物免疫反應中的存在、作用及展望

泛素對蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)已經(jīng)在模式生物中得到廣泛證實，并作為一種新的疾病干預療法在臨床上采用。但在媒介節(jié)肢動物中，岡比亞按蚊Anophelesgambiae、埃及伊蚊Aedesaegypti、致倦庫蚊Culexquinquefasciatus、肩突硬蜱、人虱Pediculushumanus、長紅錐蝽Rhodniusprolixus的基因組中泛素化途徑元件逐漸被發(fā)現(xiàn)，同樣是E3泛素連接酶的種類遠比E1激活酶和E2結合酶多得多，但具體的泛素過程仍不清楚。與黑腹果蠅Drosophilamelanogaster、小鼠Musmusculus和人相比，這幾種媒介生物編碼的泛素相關基因比例相對較低，如肩突硬蜱中E1激活酶和HECT型E3泛素連接酶含量較低，這預示著蜱類中E3泛素連接酶以RING型為主，這是否表明蜱類對于泛素化功能的利用具有傾向性和特異性還有待證實(Choyetal., 2013) 。

研究已經(jīng)證實蜱蟲叮咬可通過甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、己糖激酶1(hexokinase, HK1)和磷酸丙糖異構酶1(triosephosphate isomerase 1, TPI1)的差異性泛素化表現(xiàn)來調(diào)節(jié)宿主皮膚糖酵解途徑；同時，通過絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase kinase 1, MEK1)、26 S蛋白酶體亞基ATP酶3(26 S proteasome subunit ATPase 3, PSMC3)、蛋白酶體α亞基-6型(proteasome subunit alpha type-6, PSMA6)、MHC-Ⅱ和26 S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基1(26 S proteasome non-ATPase regulatory subunit, PSMD1)的差異泛素化來調(diào)節(jié)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ抗原提呈途徑以及HIF-1信號通路(Wangetal., 2020)。HEK 293 T細胞急性感染蜱媒蘭加特病毒(Langat virus, LGTV)時，ATK1或ATK2表達水平下降的同時，會上調(diào)AKT3和具有E3連接酶作用的凋亡抑制蛋白(如X連鎖凋亡抑制蛋白, XIAP)，這有助于逃避細胞裂解死亡造成持續(xù)感染(Kirschetal., 2020)。而凋亡抑制蛋白XIAP則是NF-κB和MAPK信號通路的重要作用靶點。在肩突硬蜱中，XIAP以p47為泛素化底物、調(diào)控著肩突硬蜱的免疫信號級聯(lián)反應，是肩突硬蜱IMD途徑的分子變阻器。p47表達的中斷能夠增加伯氏疏螺旋體和吞噬細胞無形體的定植(Severoetal., 2013; McClure Carrolletal., 2019)。雖然目前對于蜱類中泛素化及E3泛素連接酶的了解如同冰山一角，但也不難看出其在未來對于蜱媒疾病防控的重要作用。

3 結論

E3泛素連接酶及其控制的泛素化反應，在調(diào)控媒介蜱類和宿主免疫反應相關信號通路中起著至關重要的作用。對媒介蜱種的泛素化機制的利用是決定蜱媒病原在蜱內(nèi)的定植、復制、感染和傳播的關鍵效應元件。通過E3泛素連接酶來進一步了解和洞悉蜱類細胞免疫反應和相應泛素化機制對于進一步控制蜱媒病原的感染和傳播具有極為重要的意義。泛素化途徑在蜱媒病原感染中識別和調(diào)控可望成為阻斷蜱媒病原傳播、開發(fā)蜱媒疾病創(chuàng)新性防控策略的有效途徑，值得系統(tǒng)研究和深入探討。