環(huán)境水體中血吸蟲尾蚴檢測技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展*

梁 莎 曾凡勝 秦志強(qiáng)

(1.益陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，益陽市洞庭湖區(qū)血吸蟲與病原生物控制技術(shù)重點實驗室，湖南益陽 413000；2.中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所(國家熱帶病研究中心); 國家衛(wèi)生健康委寄生蟲病原與媒介生物學(xué)重點實驗室; 世界衛(wèi)生組織熱帶病合作中心; 科技部國家級熱帶病國際聯(lián)合研究中心, 上海 200025)

血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害人民群眾身體健康、影響社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的人獸共患寄生蟲病，目前主要流行于非洲、亞洲、南美洲和中東等78個國家和地區(qū)，屬于全球性的公共衛(wèi)生問題(Zhouetal.，2021)。我國流行的血吸蟲種是日本血吸蟲Schistosomajaponicum，主要分布在南方長江流域的12個省、自治區(qū)和直轄市(曹淳力等，2019)。全國血吸蟲病疫情總體保持持續(xù)下降態(tài)勢，但血吸蟲病傳播風(fēng)險因素依然存在(洪志華，2018；許靜等，2018；鐘波等，2019)，部分省份人群血檢陽性率仍處于較高水平；突出問題主要包括有螺面積分布廣、控制困難(高風(fēng)華等，2018；張利娟等，2019)；動物傳染源控制成果鞏固困難；輸入病例問題凸顯，部分地區(qū)疫情被低估、人群感染風(fēng)險較高等情況。2020年底全國450個流行縣(市、區(qū))疫情數(shù)據(jù)分析顯示，我國血吸蟲病整體呈低度流行水平，如期實現(xiàn)《“十三五”全國血吸蟲病防治規(guī)劃》目標(biāo)，但局部地區(qū)疫情仍有反彈，其中新發(fā)現(xiàn)有螺面積1 174.67 hm2，感染性釘螺面積1.96 hm2，因此，仍需強(qiáng)化血吸蟲病疫情及風(fēng)險監(jiān)測，持續(xù)開展精準(zhǔn)防控、在鞏固已有防治成果的基礎(chǔ)上穩(wěn)步推進(jìn)血吸蟲病消除工作(張利娟等，2021)。環(huán)境水體中尾蚴的檢測一直是血吸蟲病監(jiān)測預(yù)警的重要內(nèi)容之一，多年來國內(nèi)外學(xué)者圍繞血吸蟲尾蚴的富集、快速識別、定性與定量檢測方法開展了大量研究。本文就以血吸蟲尾蚴的富集與檢測技術(shù)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以促進(jìn)血吸蟲病消除工作的順利推進(jìn)。依據(jù)尾蚴不同的生物生態(tài)學(xué)特性，國內(nèi)外學(xué)者開發(fā)了適用于環(huán)境水體中尾蚴的檢測技術(shù)(黨輝等，2020)。環(huán)境水體中血吸蟲尾蚴的檢測方法主要有兩大類：一類是環(huán)境水體中尾蚴的采集與檢測，另一類是環(huán)境水體中尾蚴的實時監(jiān)測。

1 環(huán)境水體中尾蚴的采集和檢測

1.1 尾蚴的采集方法

血吸蟲尾蚴的體積較小，一般較難直接撿獲水中的尾蚴，因此環(huán)境水體中尾蚴需要濃縮采集后再進(jìn)行檢測以提高撿獲率。目前國內(nèi)外的尾蚴采集方法主要有哨鼠法、C-6膜法、仿生動物皮膜法、富集法、粘取法和網(wǎng)撈法等(表1)。

表1 尾蚴采集方法對比

1.1.1哨鼠法：哨鼠法即哨鼠撿獲法：是將哨鼠暴露于疫水環(huán)境中一定時間，將可能感染尾蚴的哨鼠室溫養(yǎng)5～6周，然后解剖哨鼠觀察其感染血吸蟲的狀況，此方法是目前廣泛應(yīng)用的疫水中尾蚴監(jiān)測方法(向瑞燈等，2016；神學(xué)慧等，2017；徐國余等，2018)。為進(jìn)一步提高哨鼠在不同環(huán)境疫水測定中的準(zhǔn)確性和靈敏度，吳鋒等(2015)對投鼠籠進(jìn)行了改進(jìn)，使漂浮式鼠籠能隨水位自由升降，哨鼠死亡數(shù)明顯減少，回收率可達(dá)到97.44%。

1.1.2C-6膜法：C-6膜法屬于尾蚴粘撈法，C-6膜是一種無色、無嗅、無毒、通過靜電效應(yīng)吸附尾蚴的薄膜材料(劉榆華等，1997)。此法利用日本血吸蟲尾蚴漂浮的生物特性，對水面的尾蚴進(jìn)行采集。蔡士椿等(1994)在此基礎(chǔ)之上建立了C-6膜小面積多點抽樣檢測技術(shù)：將C-6膜固定在載具上、浮于水面粘取尾蚴，帶回實驗室鏡檢，獲蚴率最高可達(dá)40%，高于尼龍絹材質(zhì)粘取沉淀法20倍。本法操作簡便快捷，當(dāng)天可有檢測結(jié)果，費(fèi)用僅為哨鼠法的1%；粘取的尾蚴形態(tài)完整，完整率與尾叉清晰率均高達(dá)95%，利于廣泛應(yīng)用。

1.1.3仿生動物皮膜法：仿生動物皮膜是利用豬皮等動物的皮為主要原材料，將豬皮勻漿、水、明膠和苯甲酸鈉按40∶60∶3∶50的比例混合制成厚約0.1 cm的膜，即仿生動物皮膜。設(shè)置哨鼠組作對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，仿生動物皮膜法比哨鼠檢測法的檢出率更高(彭國華等，2018)。彭國華等(2020)的實驗結(jié)果顯示，添加與未添加苯甲酸鈉動物皮膜獲取尾蚴效果一致?？紤]到苯甲酸鈉具有防腐劑作用，便于動物皮膜長時間保存，因此推薦含有苯甲酸鈉的仿生膜連續(xù)使用。

1.1.4尾蚴富集法：為克服環(huán)境水體中尾蚴密度低、環(huán)境水體情況復(fù)雜等不利因素，利用過濾原理設(shè)計機(jī)械富集裝置采集尾蚴，以提高環(huán)境水體中尾蚴撿獲率。1982年英國Kloos(Kloos，1982)根據(jù)埃及血吸蟲S.haematobium尾蚴逸出后混懸于水體特點，在實驗室中利用30 μm孔徑的過濾器過濾一定體積福爾馬林處理過的含埃及血吸蟲尾蚴水體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 L水回收率為51%，10～20 L水回收率達(dá)到19%～30%。波多黎各傳染病研究中心(Klock，1961)利用曼氏血吸蟲S.mansoni尾蚴的向光性，設(shè)計出一個具有發(fā)光裝置的過濾器，該裝置可從僅含1條血吸蟲尾蚴的2 L水中采集到尾蚴，回收率達(dá)98%。根據(jù)日本血吸蟲的向上性和向光性，采用直接取樣(主要采用300目的濾網(wǎng)對尾蚴進(jìn)行過濾)和虹吸采樣(利用尾蚴的向上性在水面收集尾蚴)對水體中尾蚴進(jìn)行采集和實時定量PCR檢測(Caitlinetal., 2011)。對8個村莊的疫水進(jìn)行了檢測，并同哨鼠法進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示尾蚴撿獲率分別為：直接取樣1、2 d(1/47，4/47)，虹吸采樣1、2 d(2/6，0/8)，哨鼠法(0/47)。Wang等(2016)設(shè)計了一臺利用濾膜收集尾蚴的富集裝置，并對采集時的流速和水中泥土對采集效果的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示0.07、0.25和0.33 L/s 3個流速的回收率分別為87.1%、90.1%和89.1%；水中加入1、1.5、2和2.5 g泥土?xí)r的回收率分別約為48%、51%、30%和26%，說明泥沙含量對回收率的影響更大。根據(jù)日本血吸蟲尾蚴的水面靜態(tài)生活習(xí)性及其生理特點，利用光熱原理設(shè)計富集裝置機(jī)械性收集尾蚴，在投蚴密度為1 600條/m2條件下，獲蚴率為1.88%(高艷春等，2008)。

1.1.5其他尾蚴粘取法：采用尼龍絹、濾紙、網(wǎng)撈等為載體粘撈水體表面的尾蚴，亦可提高捕獲率。陳光裕等(1965)在實驗室內(nèi)對尼龍絹粘取法與水面尾蚴密度進(jìn)行了研究，當(dāng)水面尾蚴密度大于34條/m2時，檢測結(jié)果均為陽性；當(dāng)密度小于19～20條/m2時，尾蚴檢出率逐漸降低。利用尼龍布分別做成直徑112 mm、長160 mm過濾袋，在實驗室撈取水中日本血吸蟲尾蚴(陽桂芬，2011)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)150、100和50 pm尼龍過濾袋撈取尾蚴率均為100%。

1.2 尾蚴檢測方法

環(huán)境水體中的尾蚴采集后需要進(jìn)一步檢測，檢測方法主要有形態(tài)檢查法和分子生物學(xué)檢測方法(表2)。

表2 尾蚴檢測方法對比

1.2.1形態(tài)檢查法：形態(tài)檢查法是目前尾蚴檢測中的“金標(biāo)準(zhǔn)”(Panicetal.，2015)，是評估尾蚴活力的最常用方法，可以觀察尾蚴的運(yùn)動和形態(tài)，通常與C-6膜法或仿生動物膜采集方法聯(lián)用。為了克服形態(tài)學(xué)檢測法的主觀性和耗時多等缺點，研究者采用不同的熒光染料對血吸蟲尾蚴進(jìn)行染色，再對尾蚴進(jìn)行計數(shù)和形態(tài)學(xué)觀察，即熒光染色法。利用Hoechst 33258(Hoechst)、二乙酸熒光素(FDA)和碘化丙啶(PI)3種染料對尾蚴進(jìn)行雙重染色(FDA-PI染色法和FDA-Hoechst染色法)(Braunetal., 2020)，結(jié)果顯示兩種染色法都可以檢測到尾蚴，不僅可以進(jìn)行尾蚴計數(shù)，還可以確定其存活率，平均準(zhǔn)確度為93.1% ± 5.5%(FDA-PI)和92.2% ± 6.3%(FDA-Hoechst)。熒光染色法比直接鏡檢法耗時少、更客觀，更適用于定量測定水樣中血吸蟲尾蚴的存活率。

1.2.2分子生物學(xué)方法：由于目前流行區(qū)環(huán)境水體中尾蚴含量濃度低，而顯微鏡檢方法易漏檢，因此近年來實時定量PCR(qPCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)等分子生物學(xué)方法及檢測技術(shù)陸續(xù)應(yīng)用到水體中的尾蚴檢測。

Driscoll等(2005)建立了一種高靈敏度和特異性的PCR檢測法，用于檢測實驗室樣品中的日本血吸蟲尾蚴。釘螺和吸蟲的群落結(jié)構(gòu)可能比之前認(rèn)為的更為復(fù)雜，因此，不能僅僅依靠PCR檢測診斷，還需要利用測序來確認(rèn)物種鑒定結(jié)果(Bakuzaetal.，2017)。Mesquita等(2020)建立的多重PCR能夠鑒別出螺體內(nèi)包括血吸蟲在內(nèi)的4個重要的吸蟲科的尾蚴。徐明忠等(2021)應(yīng)用RT-PCR對長沙綜合樞紐工程庫區(qū)洲灘水體表面日本血吸蟲尾蚴進(jìn)行了監(jiān)測，基本確定該區(qū)域沒有血吸蟲尾蚴的存在。不僅如此，PCR還可以用于鑒別血吸蟲尾蚴的性別，莫筱瑾等(2020)采集經(jīng)動物實驗確認(rèn)的雄性和雌性尾蚴各40條，應(yīng)用SCAR-PCR檢測出其中37條雌性尾蚴和40條雄性尾蚴。檢測單條雌性尾蚴的正確率為92.5%(37/40)，檢測單條雄性尾蚴的正確率為100%(40/40)?？梢奝CR的鑒定方法不僅敏感性高、特異性強(qiáng)，且在一定程度上還可以鑒別血吸蟲尾蚴性別，但受成本、操作水平、環(huán)境與條件限制，難以直接現(xiàn)場應(yīng)用(Chevalieetal.，2016；Xuetal.，2019)。

LAMP法是一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(Tomitaetal.，2008)。此方法的最大優(yōu)點是：基因的擴(kuò)增和產(chǎn)物的檢測可以一步完成，且擴(kuò)增效率高。應(yīng)用 LAMP 方法對日本血吸蟲尾蚴階段高表達(dá)基因簇進(jìn)行初步檢測，結(jié)果顯示在16個備選基因中，有7個尾蚴及感染性釘螺基因組DNA檢測結(jié)果均為陽性的基因，可考慮作為釘螺及疫水樣本LAMP檢測靶標(biāo)基因(楊樹國等，2017)。陳鳳等(2021)比較了LAMP法和鏡檢法在血吸蟲病傳播阻斷地區(qū)檢測血吸蟲感染性釘螺的效果，結(jié)果顯示LAMP技術(shù)檢測血吸蟲感染性釘螺較傳統(tǒng)解剖鏡檢法更敏感，可作為山丘型血吸蟲病傳播阻斷流行區(qū)高危有螺現(xiàn)場檢測方法的一種補(bǔ)充。此方法也可以成為野外感染釘螺中血吸蟲尾蚴最直接的檢測方法(Mesquitaetal.，2021)。

2 實時監(jiān)測技術(shù)

2.1 基于生物傳感器的尾蚴檢測技術(shù)

生物傳感器是一種對生物物質(zhì)敏感并將其濃度轉(zhuǎn)換為電信號從而被檢測的一種儀器，主要由生物感應(yīng)元件和信號傳導(dǎo)器兩部分組成。將生物傳感器應(yīng)用到了血吸蟲尾蚴的檢測中，研究者根據(jù)血吸蟲尾蚴階段釋放出的彈性蛋白酶制作出一種生物感應(yīng)元件，設(shè)計、構(gòu)建和測試了專門針對曼氏血吸蟲的全細(xì)胞生物傳感器(Webbetal.，2016)。該生物傳感器適合檢測曼氏血吸蟲尾蚴，是第一個直接設(shè)計用于檢測曼氏血吸蟲的生物傳感器。

2.2 現(xiàn)代化信息技術(shù)

為了實現(xiàn)疫水中尾蚴的快速測定，研究者們利用計算機(jī)信息技術(shù)等高科技手段來研究和識別血吸蟲尾蚴。國內(nèi)外學(xué)者利用計算機(jī)模型對血吸蟲尾蚴的生物學(xué)特性進(jìn)行了大量的研究，使用計算機(jī)模型通過擬合曲線找到了曼氏血吸蟲尾蚴與溫度之間的關(guān)系：15～35 ℃之間成S形，擬合曲線的回歸線的斜率隨著溫度的升高呈指數(shù)增長(Lawsonetal.，1980)。利用計算機(jī)分析感官之間相互距離的各種參數(shù)(平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、對稱系數(shù)和峰值等)，成功鑒別了曼氏血吸蟲尾蚴和間插血吸蟲Schistosomeintercalatum尾蚴。它們具有相同的平均值和相同的標(biāo)準(zhǔn)偏差，但對稱系數(shù)(0.34 ± 0.11、0.73 ± 0.08，P<0.0001)和峰值(-0.82 ± 0.27、-0.58 ± 0.31，P<0.0001)卻大不相同，對稱系數(shù)和峰值對于血吸蟲蟲種鑒別非常有效，可應(yīng)用于其他幾種血吸蟲的鑒別(Chauetal.，1996)。我國研究者將計算機(jī)信息技術(shù)應(yīng)用到疫水中尾蚴的檢測，其主要原理是：利用顯微鏡成像技術(shù)和計算機(jī)的不同算法：Candy算子、特征加權(quán)法、同軸數(shù)字全息等。這類信息技術(shù)不僅能分辨出尾蚴的形態(tài)學(xué)特征，如尾蚴的輪廓和紋理，還能實現(xiàn)對疫水中尾蚴的實時監(jiān)測(陳宇環(huán)等，2011；艾晶等，2012；王鳳鵬等，2012；易云等，2012)。

3 小結(jié)

綜上所述，環(huán)境水體中血吸蟲尾蚴的監(jiān)測主要包括兩部分，即尾蚴采集與檢測。疫水中尾蚴采集主要有哨鼠法、粘蚴法和儀器濃集法。哨鼠法具有安全、簡易且可以鑒別蟲種等優(yōu)點，但在長期應(yīng)用過程中逐步暴露出周期長、成本高、時效性差的不足。與哨鼠法相比，C-6膜和仿生動物膜采集尾蚴，不僅可以撿獲日本血吸蟲尾蚴，而且敏感性和效果更好。利用不同富集裝置過濾能在一定程度上解決低濃度尾蚴帶來的難撿獲難題，但是尾蚴撿獲過程中容易出現(xiàn)斷尾，死亡甚至解體，因此對后期檢測方法的要求更高。檢測方法中，PCR和LAMP法可以彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)鏡檢的缺陷，可以檢測出死亡甚至解體的尾蚴。目前仍在進(jìn)行的疫水實時監(jiān)測技術(shù)，尚處于研究階段，且人工智能識別效果受到尾蚴形態(tài)完整性的限制，靈敏度和準(zhǔn)確度有待提高。