Smad4 與嗅覺系統(tǒng)功能及疾病的研究進展

張 切 ，王淑芬 ，曹守明 ，吳海鶯

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科,云南 昆明 650101;2）昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究中心云南省干細胞和再生醫(yī)學(xué)重點實驗室,云南 昆明 650500）

嗅覺系統(tǒng)不僅是人類進化史上最古老的感官之一，也是人類出生后就即刻使用的感官之一[1]。嗅覺不僅包括辨別氣味，還包括對信息素的編碼，從而起著預(yù)警危險、影響食欲、調(diào)節(jié)情緒等作用。嗅覺系統(tǒng)如果受到損傷，會直接影響患者的生活質(zhì)量，嚴(yán)重的還會給患者的精神狀態(tài)造成負面影響。深入了解SMAD4 在嗅覺系統(tǒng)及其在嗅覺相關(guān)疾病中的作用，不僅有助于在微觀領(lǐng)域揭示嗅覺相關(guān)基因的功能，而且能為下一步對信息素、鼻腔腫瘤等的研究提供有效的參考和重要的啟示。

1 Smad4 簡介

人類的Smad4 位于染色體 18q21.1 上。目前已知的Smads 蛋白至少有9 種，即Smad1～Smad9。其中Smad4 蛋白由552 個氨基酸殘基組成的[2]。Smad4 蛋白的肽鏈中包含N 區(qū)（MH1，mad homology domain 1）和C 區(qū)（MH2，mad homology domain 2）。Smad4 蛋白的MH2 能夠結(jié)合受體 激酶[2]。SMAD4 是TGF-β 信號通路的中心調(diào)節(jié)因子，而TGF-β 信號通路在細胞生長、分化、凋亡、遷移以及癌癥的發(fā)生和發(fā)展等許多生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用，SMAD4 作為一種腫瘤抑制因子在多種癌癥中發(fā)揮重要作用。

2 SMAD4 與嗅覺系統(tǒng)的功能

2.1 嗅覺系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)

主嗅系統(tǒng)（Main olfactory system）和副嗅系統(tǒng)（Accessory olfactory system）是嗅覺系統(tǒng)的2 大組成部分。主嗅系統(tǒng)包括嗅上皮、嗅球、嗅覺皮層；副嗅系統(tǒng)即犁鼻系統(tǒng)或犁鼻器（Vomeronasal organ），包括 Apical 和 Basal 犁鼻骨感覺神經(jīng)元和副嗅球[3]。嗅覺感覺神經(jīng)元和犁鼻感覺神經(jīng)元的信息傳遞的具有互補特征。嗅覺感覺神經(jīng)元的階段性放電適用于在較短的周期（<200 ms）內(nèi)攜帶有關(guān)快速變化的信息。相比之下，犁鼻感覺神經(jīng)元的強直放電能夠傳達關(guān)于較小刺激隨著較長周期（>500 ms）緩慢變化的信息。因此，這2 種感覺神經(jīng)元的平行通路可以傳達有關(guān)各種動態(tài)刺激的信息。嗅覺信息傳遞的互補特征的組合可以增強主要嗅覺系統(tǒng)和犁鼻系統(tǒng)之間相互作用的協(xié)同作用[4?5]。

2.2 嗅覺的產(chǎn)生機制

嗅覺的產(chǎn)生依賴于氣味分子與嗅覺受體的結(jié)合。嗅覺受體存在于嗅神經(jīng)元上，是一種G 蛋白偶聯(lián)受體（Golf）。空氣中的化學(xué)物質(zhì)通過呼吸，被嗅上皮部分的黏液吸收，直接或間接地與嗅覺受體結(jié)合。盡管嗅覺受體與氣味分子并非是一對一識別的關(guān)系，同一個氣味分子會拆解為多個部分分別被多個嗅覺受體識別[1]。嗅覺受體屬于氣味分子與嗅覺受體結(jié)合后激活 Golf，活化的Golf進一步激活腺苷酸環(huán)化酶Ⅲ，提高胞內(nèi)第二信使環(huán)磷酸腺苷（cAMP）濃度，從而打開細胞膜上的環(huán)核苷酸門控陽離子通道，引起鈣離子內(nèi)流、氯離子外流，導(dǎo)致細胞去極化，行成動作電位，動作電位再通過嗅絲傳導(dǎo)至嗅球[6]。嗅小球?qū)幼麟娢粋鬟f，激活嗅球上的神經(jīng)元，即僧帽細胞。接著嗅束把信息傳遞到更高的主嗅系統(tǒng)組成部分，即嗅覺皮層，便產(chǎn)生了嗅覺[5]。

嗅覺系統(tǒng)與邊緣系統(tǒng)關(guān)系緊密。嗅球會將匯總的氣味信息投射至海馬體（喚起與該氣味有關(guān)的記憶）、投射至杏仁核（調(diào)出該氣味“好壞”的標(biāo)簽）。嗅覺刺激的產(chǎn)生除了氣味分子之外，還有信息素（又稱費洛蒙）。不同的物種，其接受信息素和一般氣味分子的編碼可能由犁鼻器和嗅上皮分別進行，也可能同時由兩者編碼[7?8]。目前已知的如外分泌腺分泌肽22 由犁鼻器編碼；甲硫基甲硫醇、雄烯酮這些信息素由主嗅覺系統(tǒng)編碼。對于人類的性信息素，目前僅有雄甾二烯酮和雌甾四烯[9?15]被認為很可能是有用的人類性信息素。人類嗅覺對不同信息素的心理和生理反應(yīng)也可能不太一樣。已經(jīng)有越來越多的證據(jù)表明人類信息素的存在，但其潛在的機制仍然不清楚。特別是在嗅覺系統(tǒng)如何編碼信息素從而進一步對人類產(chǎn)生影響，還有很多值得研究的地方。

2.3 SMAD4 與嗅覺神經(jīng)的關(guān)系

2.3.1 Smad4 信號通路與犁鼻感覺神經(jīng)元（VSN）的關(guān)系Smads 基因存在于細胞質(zhì)中，是哺乳動物體內(nèi)TGF-β 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要基因家族，是已被證實的 TGF-β 受體激酶的底物。Smads可將信號由細胞膜直接傳至細胞核。目前已知至少存在9 種Smads 分子，按結(jié)構(gòu)和功能可分為3個亞型：受體激活型、通用型、抑制型。Smad4屬于通用型，能與活化的 R-Smad 形成異聚體，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。Smad4 基因編碼的蛋白可以被跨膜絲氨酸/蘇氨酸受體激酶激活，如轉(zhuǎn)化生長因子 TGF-β 受體。Smad4 作為 TGFβ 信號的重要胞漿內(nèi)信號級聯(lián)分子，能夠以同源復(fù)合物或者異源復(fù)合物的形式，轉(zhuǎn)移到核內(nèi)。同時，SMAD4 會與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，調(diào)節(jié)TGF-β 應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄。Smad4 的表達或功能的改變，都會使TGF-β 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)出現(xiàn)異常，甚至是影響腫瘤的形成過程[16?18]。

Smad4 信號在 basal-VSN 的成熟、功能和精確連通性方面起著關(guān)鍵作用，Smad4 的突變會導(dǎo)致 TGF-β/BMP 信號通路破壞，引起 basal-VSN的進行性功能缺失，減少對 basal-VSN 的激活，導(dǎo)致后部副嗅球形成的異常，導(dǎo)致嗅覺傳導(dǎo)異常[4?19]。

2.3.2 Smad4 介導(dǎo)的信號驅(qū)動了基礎(chǔ)犁鼻感覺神經(jīng)元（VSN）的功能成熟和連接2020 年，Ankana S.Naik 等[20]為了測試 TGF-β/BMP 信號在不同細胞環(huán)境中的作用，利用AP-2εCre 和OMPCre小鼠系作為破壞Smad4 功能的基因切入點，分別破壞未成熟基底 VSN 和成熟頂端和基底 VSN 中的Smad4 功能。結(jié)果表明未成熟基底VSN 中Smad4 依賴性形態(tài)發(fā)生信號是完成基底VSN 細胞成熟所必需的，并且未成熟和成熟基底VSN 中的Smad4 依賴性信號對于基底VSN 和AOB 之間的正確電路形成至關(guān)重要。成熟的基底VSN 中的條件Smad4 消融導(dǎo)致成年小鼠基底神經(jīng)元的嚴(yán)重損失，并且損害神經(jīng)元對氣味刺激的反應(yīng)[20?21]。

2.3.3 Smad4 對人類嗅覺系統(tǒng)的影響SMAD4作為經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，本身在TGF-β 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但也有SMAD4對可變剪接潛在的調(diào)控作用，在siRNA 的作用下誘導(dǎo)Bim 的可變剪接短亞型的表達的觀點。嗅覺神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的高通量測序數(shù)據(jù)表明嗅覺投射神經(jīng)元（傳遞嗅覺信息到腦高級區(qū)域）發(fā)育過程中可變剪接水平存在廣泛的變化，WT1 的可變剪接亞型（+KTS）的表達對于嗅覺上皮的發(fā)育具有重要的促進作用。另一方面，由于目前人類嗅覺系統(tǒng)對信息素的編碼尚未有定論，人類對信息素的編碼可能有的發(fā)生在副嗅覺系統(tǒng)，有的則發(fā)生在主嗅覺系統(tǒng)，因此SMAD4 很可能還會通過對嗅覺神經(jīng)的調(diào)控影響對信息素的編碼從而影響人類的行為，特別是生殖和社會行為。

信息素這種化學(xué)信號在同一物種的成員之間傳遞信息，它們與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)之間錯綜復(fù)雜的相互作用則不太為人所知。在關(guān)于人類信息素的研究結(jié)果中，自1971 年第1 份關(guān)于人類月經(jīng)同步的報告以來，近50a 的研究表明，人體分泌物，特別是腋下汗水，潛意識地傳達情感和生殖狀態(tài)，反過來又由復(fù)雜的神經(jīng)化學(xué)變化驅(qū)動。在人體分泌物的許多成分中，雄甾二烯酮（androsta-4，16，-dien-3-one，一種性腺孕酮的非雄激素衍生物）和雌甾四烯（estra-1，3，5（10），16-tetraen-3-ol，與雌激素性激素有關(guān)但沒有已知的雌激素作用），這2 種內(nèi)源性類固醇是人類性信息素的候選者[22]。國外有研究團隊進一步根據(jù)研究成果總結(jié)出人類的4 類信息素[23]。第1 種引發(fā)快速而可靠的行為，稱為直效信息素Releaser pheromone）。第2 種是使吸入該種信息素的對象內(nèi)分泌發(fā)生的變化的啟動信息素（Primer pheromone）。第3 種為通訊信息 素（Signaler pheromone），它能傳遞釋放者的關(guān)鍵信息。第4種是調(diào)節(jié)信息素（Modulator pheromone），是可以使接收者的情緒起伏乃至認知發(fā)生變化的信息素，如：焦慮狀態(tài)下分泌的汗液能夠消除閾下積極面部表情所產(chǎn)生的情緒啟動效應(yīng)[23?24]，同時使驚跳反射變得強烈[23]；研究對象的情緒會受到不同狀態(tài)下分泌的汗液氣味的影響，例如聞到恐懼狀態(tài)下分泌的汗液不僅情緒知覺會變化，其反應(yīng)也會變慢[24?25]；聞到厭煩或開心狀態(tài)下分泌的汗液，其面部表情、呼吸甚至認知反應(yīng)都會有相應(yīng)的改變[26?27]。更有研究發(fā)現(xiàn)，沒有明顯氣味的人的眼淚也可能包含信息素，并影響接收者的生理狀態(tài)[28]。

3 SMAD4 與嗅覺相關(guān)腫瘤的關(guān)系

3.1 SMAD4 與腫瘤的關(guān)系

如前所述，Smad4 蛋白可與TGF-β 上的TGF-β I 型受體相結(jié)合，并將其激活。TGF-β是重要的轉(zhuǎn)錄生長因子，具有調(diào)控細胞增殖的作用。當(dāng)Smad4 的核表達缺失時，TGF-β 信號會發(fā)生斷裂，使腫瘤細胞擺脫 TGF-β 的調(diào)控，從而可導(dǎo)致腫瘤細胞出現(xiàn)不可逆的異常增殖和生長[29]。目前已有的研究均一致認為SMAD4 是一種抑癌基因。如在食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌等消化道腫瘤中，多數(shù)研究表明Smad4 常常發(fā)生基因變異[30?31]。其具體的機制包括：Smad4 的點突變可通過 GSK-3 的磷酸化作用從而可逆地使TGFβ 信號失活；Smad4 可抑制VEGF-C 的分泌，并抑制淋巴管的生成，從而降低腫瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲能力；TGF-β 通過SMAD4 及SP1 協(xié)同轉(zhuǎn)錄上調(diào)LAMC1 的表達；體外功能實驗也顯示，LAMC1通過抑制凋亡促進腫瘤細胞增殖，且通過激活A(yù)kt/NF-κB/MMP9，MMP14 促進腫瘤細胞遷移[32]。大量的臨床研究證實，SMAD4 可作為診斷、治療消化道腫瘤及評估消化道腫瘤患者預(yù)后的重要標(biāo)志物。在與女性生殖系統(tǒng)腫瘤的研究中，發(fā)現(xiàn)在體外試驗中，SMAD4 可抑制體外部分乳腺癌細胞的生長[33]；在乳腺癌細胞株MCF-7 和MDA-MB-468 中，SMAD4 既可單獨，也可通過與SMAD3形成復(fù)合物的形式呈劑量依賴性抑制ERα介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性[33]。已有研究表明[33]，CIN 和宮頸鱗癌中SMAD4 表達異常（表達減少），可使TGF-β信號傳導(dǎo)減弱或中斷，導(dǎo)致相關(guān)的生長抑制作用受抑制。因此細胞連續(xù)增殖，進而誘發(fā)CIN，甚至癌變[33]。Mackenzie 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，黏液性卵巢癌存在低水平的Smad4 基因突變，并且BMP9（骨形態(tài)發(fā)生蛋白9）可通過ALK2/ActRIIA/BMPRII/ Smad1/ Smad4 途徑誘導(dǎo)卵巢癌細胞增殖。在肺癌中發(fā)現(xiàn)了Smad2 和Smad4 在18q21 上存在不良突變[35]，TGF-β1 基因多態(tài)性與非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）風(fēng)險的增加有關(guān)[36]。

3.2 SMAD4 與與嗅覺相關(guān)腫瘤

鼻腔鼻竇惡性腫瘤少見，僅占頭頸部惡性腫瘤的3%～5%。而且病理類型繁多主要包括嗅神經(jīng)母細胞瘤、鱗癌、腺癌、未分化癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌、惡性黑色素瘤、腺樣囊性癌、血管周細胞瘤、淋巴瘤和軟組織肉瘤等[37]。目前有研究表明與SMAD4 有關(guān)的鼻腔鼻竇惡性腫瘤有嗅神經(jīng)母細胞瘤（factory neuroblastoma，ONB）[38]。ONB 又稱嗅神經(jīng)細胞瘤、神經(jīng)上皮瘤或成感覺神經(jīng)母細胞瘤等，是一種罕見的、局部侵襲性、起源于嗅上皮的惡性腫瘤。由于發(fā)病率較低（0.4/100 萬，占所有鼻腔腫瘤的2%～3%）且早期癥狀不典型，相關(guān)的研究較少。ONB 確切起源存在爭議，目前普遍認為其來源于嗅神經(jīng)上皮基底細胞，最常見的原發(fā)部位為鼻腔頂篩板區(qū)。2017 年Topcagic J等[39]對23 例復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性O(shè)NB 患者（10 例男性，13 例女性，年齡29～84 歲）的樣本進行基因檢測，發(fā)現(xiàn)在63%的標(biāo)本中檢測到突變，包括 TP53、CTNNB1、EGFR、APC、cKIT、cMET、PDGFRA、CDH1、FH 和 SMAD4 基因。

從目前的研究進展來看，一方面，盡管目前發(fā)現(xiàn)的SMAD4 與嗅覺特別是嗅覺障礙之間的關(guān)系主要是來自動物實驗，且對嗅覺的影響主要通過副嗅系統(tǒng)，而人類的副嗅系統(tǒng)已處于退化。然而目前人類嗅覺系統(tǒng)對信息素的編碼尚未有定論，人類對信息素的編碼可能有的發(fā)生在副嗅覺系統(tǒng)，因此SMAD4 很可能還會通過對嗅覺神經(jīng)的調(diào)控影響對信息素的編碼從而影響人類的行為，因此深入了解SMAD4 在嗅覺神經(jīng)系統(tǒng)中的調(diào)控作用，不僅有助于在微觀領(lǐng)域揭示嗅覺相關(guān)基因的功能，而且能為下一步對信息素的研究提供有效的參考和重要的啟示。另一方面，盡管已經(jīng)明確SMAD4是一種抑癌基因，但由于鼻腔鼻竇惡性腫瘤少見，用于全面大規(guī)模研究的腫瘤組織樣本有限，對其遺傳學(xué)、分子生物學(xué)或發(fā)病機制知之甚少，然而識別這些腫瘤的分子異常對特異性靶向治療的研究至關(guān)重要。因此SMAD4 在鼻腔鼻竇惡性腫瘤中的作用機制還有待進一步研究且意義深遠。