高遷移蛋白B1參與兒童癲癇發(fā)生機(jī)制及中醫(yī)藥干預(yù)進(jìn)展

陳漢江， 張喜蓮， 戎萍， 馬融

癲癇發(fā)生(epiletogenesis)是指初始腦損傷后正常腦向慢性癲癇腦形成的過(guò)程，其定義強(qiáng)調(diào)了是一個(gè)慢性漸進(jìn)過(guò)程[1]。一般分為初始腦損傷階段、癲癇發(fā)生期、慢性癲癇期三期[2]。癲癇發(fā)生的狹義概念指癲癇發(fā)生期，而宏觀概念指癲癇形成的整個(gè)過(guò)程，國(guó)際上更傾向于宏觀概念的研究。癲癇發(fā)生是兒童癲癇的萌芽和前期階段，而目前的抗癲癇藥物都是抑制癲癇發(fā)作，尚無(wú)控制癲癇發(fā)生、阻斷癲癇進(jìn)程的藥物[3]。癲癇發(fā)生的過(guò)程由多種病理生理改變參與，包括神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、膠質(zhì)細(xì)胞增生、免疫炎癥、突觸可塑性改變及異常神經(jīng)環(huán)路建立等[4]。其中免疫炎癥反應(yīng)受到業(yè)界廣泛地重視。研究認(rèn)為免疫炎癥參與癲癇發(fā)生的全過(guò)程[5]。近期高遷移蛋白(high mobility group，HMG)B1在免疫炎癥的獨(dú)特地位以及兒童癲癇中的關(guān)鍵作用逐漸得到重視[6]，本文即以HMGB1在兒童癲癇的作用及中醫(yī)藥干預(yù)進(jìn)行綜述。

1 HMGB1的認(rèn)識(shí)過(guò)程、家族、結(jié)構(gòu)、功能及釋放形式

1.1 HMGB1的認(rèn)識(shí)過(guò)程 1973年英國(guó)學(xué)者Goodwin等[7]首次在牛胸腺中發(fā)現(xiàn)了一種30 kb的核內(nèi)非組蛋白，因電荷豐富在凝膠電泳具有較快遷移速率被命名為高遷移率族蛋白。1999年Wang等[8]在《科學(xué)》雜志上首次闡述了HMG1在膿毒血癥的作用，他通過(guò)對(duì)早期炎癥因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(iterleukin-1，IL-1)的干預(yù)發(fā)現(xiàn)并不能降低膿毒血癥的預(yù)后，而抑制HMG1能顯著降低死亡率，從而明確了HMG1的晚期炎癥因子的地位。2001年Bustin[9]對(duì)HMG超家族進(jìn)行了系統(tǒng)分類，根據(jù)功能的區(qū)別分為HMGA、HMGB、HMGN三大類，其中HMGB又分為HMGB1、HMGB2、HMGB3，其中HMGB1是含量最豐富的。隨后關(guān)于HMGB1在重癥醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤等領(lǐng)域得到廣泛的研究。2010年意大利學(xué)者M(jìn)aroso等[10]首次證實(shí)了HMGB1在癲癇中的促癇作用，并證實(shí)了HMGB1/Toll樣受體-4(Toll like receptor 4，TLR4)通路是癲癇發(fā)生的關(guān)鍵靶標(biāo)，阻斷HMGB1/TLR4軸能降低癲癇大鼠的發(fā)作頻率和縮短抽搐持續(xù)時(shí)間。自此以后近10年來(lái)在癲癇領(lǐng)域得到重視，相關(guān)論文在PUBMED中可檢索多達(dá)百篇以上。

1.2 HMGB1的家族、結(jié)構(gòu) HMGB1是一種核蛋白，具有高度保守性，廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，隸屬于HMG超家族。HMGB1在不同物種間進(jìn)化高度保守，動(dòng)物與人類的氨基酸同源性可達(dá)99%，大鼠與小鼠的氨基酸序列同源性可達(dá)100%[11]。HMGB1蛋白含有215個(gè)氨基酸，包括3個(gè)不同的功能區(qū)：兩個(gè)DNA結(jié)合區(qū)(A-Box，B-Box)和一個(gè)C端負(fù)性調(diào)節(jié)區(qū)。HMGB1的分子活性主要由B-Box主導(dǎo)，具有誘發(fā)炎癥反應(yīng)或擴(kuò)大炎癥級(jí)效的功能，而A-Box則具有抑制炎癥效應(yīng)[12]。

1.3 HMGB1的功能 HMGB1根據(jù)其位置不同有兩種不同的功能：(1)細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控功能：HMGB1是核內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白，作為DNA的伴侶蛋白，與DNA非特異性結(jié)合，使DNA解螺旋，具有修飾、彎曲和改變DNA結(jié)構(gòu)，參與DNA的重組修復(fù)，穩(wěn)定染色質(zhì)，基因的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄[13]。(2)細(xì)胞外促炎功能：HMGB1主動(dòng)或被動(dòng)釋放的方式由細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)胞進(jìn)入細(xì)胞外。以“晚期炎癥因子”的角色出現(xiàn)，不同于TNF、IL-1等早期炎癥因子，它出現(xiàn)較晚且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，成為晚期炎癥的潛在干預(yù)靶點(diǎn)[14]。關(guān)于出現(xiàn)時(shí)間及持續(xù)時(shí)間研究，急性期癲癇模型在發(fā)作后12 h出現(xiàn)，能持續(xù)到72 h，而慢性癲癇模型發(fā)現(xiàn)在造模后7 d及14 d能檢測(cè)到其表達(dá)。胞外HMGB1作用于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)TLRS和晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)受體作用于核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)促進(jìn)炎癥釋放，導(dǎo)致N-甲基-D-天冬氨酸受體-NR2B亞基(N-methyl-D-aspartic acid receptor-2B，NMDA-NR2B)磷酸化和谷氨酸蓄積，增強(qiáng)NMDA依賴性鈣離子內(nèi)流，促進(jìn)癲癇發(fā)作[10]。

1.4 HMGB1的釋放形式 HMGB1有被動(dòng)釋放和主動(dòng)分泌兩種形式，并且有病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMPs)兩種刺激模式[15]。(1)被動(dòng)釋放時(shí)，各種刺激導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死及凋亡，細(xì)胞內(nèi)HMGB1與DNA解離，以可溶物的方式釋放到細(xì)胞外發(fā)揮促炎作用。(2)主動(dòng)分泌時(shí)，由于細(xì)胞內(nèi)HMGB1缺乏信號(hào)肽，不能由經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑釋放，一般通過(guò)細(xì)胞核到細(xì)胞漿，細(xì)胞器到細(xì)胞漿，胞吐釋放到細(xì)胞外[16]。HMGB1主動(dòng)分泌的生化機(jī)制有甲基化、絲氨酸磷酸化和乙?；N機(jī)制[17]。因此HMGB1的易位(translocation)及釋放是研究的關(guān)鍵及可干預(yù)的靶點(diǎn)。

2 HMGB1參與癲癇發(fā)生的可能機(jī)制

一般情況下，PAMPs或DAMPs激活固有免疫細(xì)胞，引起固有或適應(yīng)性免疫應(yīng)答。HMGB1通過(guò)兩個(gè)經(jīng)典的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活下游免疫反應(yīng)：HMGB1-RAGE軸和HMGB1-TLRs軸。

2.1 HMGB1-RAGE軸[18]RAGE稱為晚期糖基化終末產(chǎn)物，是最早被發(fā)現(xiàn)的跨膜蛋白，HMGB1與RAGE通過(guò)靜電結(jié)合，其下游通過(guò)胞內(nèi)蛋白MAPK誘導(dǎo)NF-κB的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)炎癥的生成和釋放，該通路被證實(shí)參與海馬硬化、腦皮質(zhì)發(fā)育不良及多重耐藥等形成，尤其對(duì)多重耐藥中P糖蛋白表達(dá)的研究較為集中[19]。

2.2 HMGB1-TLRs軸 TLRs是模式受體家族成員，目前被發(fā)現(xiàn)有13種之多，而TLR4是目前研究最多，認(rèn)為是介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵受體，MyD88是HMGB1-TLRs信號(hào)通路的主要接頭分子，MyD88通過(guò)與NF-κB促進(jìn)炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，抑制HMGB1-TLR4信號(hào)通路能減輕癲癇小鼠發(fā)作嚴(yán)重程度和縮短驚厥時(shí)間，而在海人酸誘導(dǎo)C3H/He J小鼠(TLR4敲除小鼠)發(fā)現(xiàn)，在TLR4缺失的情況下，小鼠的發(fā)作次數(shù)和皮質(zhì)腦電明顯減少，提示HMGB1需通過(guò)TLR4發(fā)出信號(hào)[20]。HMGB1-TLR4調(diào)節(jié)軸與癲癇的發(fā)生和發(fā)作嚴(yán)重程度密切相關(guān)。阻斷HMGB1-TLR4調(diào)節(jié)軸可以作為一種新的抗癲癇治療策略。

3 中醫(yī)藥干預(yù)兒童癲癇發(fā)生機(jī)制

在中藥干預(yù)HMGB1的研究中，基本分為中藥復(fù)方和單體兩種。他們都以HMGB1/TLR4/NF-κB的促炎通路為重點(diǎn)。作用機(jī)制基本包括分為抑制炎癥細(xì)胞免疫反應(yīng)、抑制胞內(nèi)HMGB1的轉(zhuǎn)位、抑制胞外HMGB1的過(guò)度表達(dá)和釋放等三大類。

3.1 抑制免疫炎癥細(xì)胞的活化及細(xì)胞保護(hù)HMGB1 作為體內(nèi)重要的晚期炎癥因子，介導(dǎo)晚期免疫炎癥反應(yīng)，參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答。巨噬細(xì)胞(中樞神經(jīng)系統(tǒng)為小膠質(zhì)細(xì)胞)是體內(nèi)主要免疫炎癥細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞極化參與膿毒癥相關(guān)性腦病，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)觀察強(qiáng)心一號(hào)復(fù)方[21](水紅花子、黃芪等)能抑制海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞向促炎型轉(zhuǎn)化(標(biāo)志物為HMGB1/TLR4)，減少膿毒癥后海馬區(qū)免疫炎癥反應(yīng)及炎癥因子釋放，減輕腦功能障礙。為明確抗炎合劑[22](生大黃、黃連、黃芩、厚樸及敗醬草)減輕膿毒癥急性肺損傷的分子機(jī)制，通過(guò)慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定的過(guò)表達(dá)HMGB1和沉默HMGB1(HMGB1 RNAi)和RAW264.7巨噬細(xì)胞，分為空白組、脂多糖組及不同HMGB1+中藥血清等7組，運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)不同表達(dá)方向HMGB1及TRL4、MyD88、NF-κB具有差異，HMGB1過(guò)表達(dá)可顯著增強(qiáng)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7的炎癥反應(yīng)，抗炎合劑能夠抑制該炎癥反應(yīng)。

3.2 抑制HMGB1 由胞內(nèi)向胞外的移位HMGB1的胞外轉(zhuǎn)位是其發(fā)揮促炎因子的關(guān)鍵。為了研究電針[23]“肝俞”和“陽(yáng)陵泉”對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用以及對(duì)HMGB1的影響，采用經(jīng)典無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾阻斷肝缺血再灌注損傷模型，采用免疫組織化學(xué)、蛋白印跡法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)觀察HMGB1的變化和細(xì)胞定位，肝俞-陽(yáng)陵泉組較非經(jīng)非穴組、模型組明顯降低HMGB1、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)及TNF、IL-6的含量，考慮與肝俞-陽(yáng)陵泉能抑制HMGB1從胞核向胞質(zhì)的移位和釋放，減輕肝臟缺血再關(guān)注損傷相關(guān)。而在另一項(xiàng)關(guān)于丹參多酚酸[24]改善缺血再灌注損傷的研究中，證實(shí)了丹參多酚酸不僅能抑制HMGB1的遷移、表達(dá)，還能抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，采用空白組、模型組、實(shí)驗(yàn)組和抑制劑組比較，采用經(jīng)典中動(dòng)脈栓塞模型，以神經(jīng)功能缺損評(píng)分、WB、PCR等觀察1 d、3 d及7 d的病理和蛋白表達(dá)情況，結(jié)果證實(shí)7 d實(shí)驗(yàn)組蛋白表達(dá)明顯低于模型組及抑制劑組，考慮參多酚酸可以通過(guò)促進(jìn)SIRT1轉(zhuǎn)錄、抑制HMGB1遷移和表達(dá)，減少下游通路的炎癥因子P-53、NF-κB的釋放，同時(shí)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其多功能考慮與中藥的多靶點(diǎn)特性密切相關(guān)。

3.3 抑制胞外HMGB1的釋放、遷移及表達(dá)胞外的HMGB1 作為一種晚期促炎因子發(fā)揮炎癥介質(zhì)功能。目前報(bào)道的大多數(shù)文獻(xiàn)均抑制HMGB1的釋放、遷移及表達(dá)為主，并且以HMGB1-RAGE/TLR4-NF-κB炎癥信號(hào)通路為主。清腦通絡(luò)方能通過(guò)HMGB1/TLR4抑制水通道蛋白-4(aquaporin-4,AQP4)表達(dá)和星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，減輕炎癥水腫相關(guān)分子，加強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接程度，改善血腦屏障功能[25]。其復(fù)方作用靶點(diǎn)可能是對(duì)信號(hào)通路蛋白均有影響，而非單一靶點(diǎn)。根據(jù)膿毒血癥的關(guān)鍵在氣營(yíng)為理論依據(jù)，制定了清熱化瘀通經(jīng)的清氣涼營(yíng)湯[26]，以晚期關(guān)鍵炎癥因子HMGB1、RAGE、CD4+、CD8+及急性生理與慢性健康(acute physiology and chronic health evaluation，APACHEⅡ)評(píng)分為核心指標(biāo)，記錄28 d死亡率，發(fā)現(xiàn)清氣涼營(yíng)湯能顯著降低HMGB1、RAGE水平，調(diào)節(jié)CD4+、CD8+的表達(dá)水平，降低28 d病死率，考慮與清氣涼營(yíng)湯能降低HMGB1促炎因子的表達(dá)，促進(jìn)自身免疫恢復(fù)穩(wěn)態(tài)有關(guān)。在丹紅注射液[27]對(duì)高脂血癥合并腦缺血損傷的神經(jīng)保護(hù)研究中，建立高脂血合并缺血再灌注模型，分為假手術(shù)組、模型組及丹紅低中高劑量組，尾靜脈注射7 d，采用尼氏染色、免疫組織化學(xué)、PCR等手段檢測(cè)缺血側(cè)腦皮質(zhì)的病理、HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB p65的變化，結(jié)果證實(shí)丹紅組能顯著降低上述蛋白的表達(dá)，并呈劑量依耐性。證實(shí)丹紅注射液能減輕腦組織損傷，考慮可能與上調(diào)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表達(dá)及抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活有關(guān)。

3.4 中醫(yī)藥調(diào)節(jié)HMGB1干預(yù)癲癇發(fā)生的相關(guān)性研究 目前中藥調(diào)節(jié)HMGB1的研究主要集中于膿毒血癥、缺血再灌注損傷、神經(jīng)保護(hù)等領(lǐng)域，并在近10年來(lái)逐漸引起了癲癇領(lǐng)域的重視。鑒于HMGB1在癲癇的認(rèn)識(shí)剛剛興起，中醫(yī)藥對(duì)HMGB1在癲癇發(fā)生的作用認(rèn)識(shí)相對(duì)不夠，部分文獻(xiàn)將其列入一般性炎癥指標(biāo)，而未重點(diǎn)突出進(jìn)行深入研究。以HMGB1為主要干預(yù)指標(biāo)的文獻(xiàn)相對(duì)較少，作者檢測(cè)了近10年報(bào)道的中藥干預(yù)HMGB1的文獻(xiàn)，僅有甘草素、黃芩苷、小襞堿、抗癇增智顆粒、寧癇顆粒、烏靈膠囊等數(shù)篇文獻(xiàn)。通過(guò)黃芩苷腹腔注射入匹羅卡品癲癇大鼠，觀察(6 h、24 h、72 h、1個(gè)月)后大鼠的驚厥等級(jí)、病理、免疫組織化學(xué)，發(fā)現(xiàn)黃芩苷組具有顯著差異，并且呈濃度依賴，能延長(zhǎng)癲癇發(fā)作潛伏期和降低癲癇發(fā)作等級(jí)，提示黃芩苷對(duì)癲癇有修飾作用，可能與其對(duì)HMGB1/TLR4/NF-κB通路蛋白有調(diào)節(jié)作用[28]。以鹿茸、石菖蒲為君藥的抗癇增智顆粒對(duì)癲癇神經(jīng)保護(hù)的作用，以中藥低中高劑量組與妥泰組進(jìn)行比較，以蘇木精-伊紅染色、免疫組織化學(xué)、PCR及水迷宮檢測(cè)為觀察指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)抗癇增智顆粒能改善癲癇幼鼠的行為學(xué)與學(xué)習(xí)、記憶能力，保護(hù)神經(jīng)元，其呈濃度依賴性，考慮與HMGB1/TLR4/NF-κB密切相關(guān)[29]。目前對(duì)HMGB1的研究相對(duì)較少，說(shuō)明依舊有很大的空間，是未來(lái)拓展的方向。

4 討論

癲癇發(fā)生是癲癇形成的萌芽期和前期階段。著眼于癲癇發(fā)生的早期干預(yù)是癲癇防治策略前移的集中體現(xiàn)，也能較好地體現(xiàn)中醫(yī)藥“治未病”思想。神經(jīng)元損傷和免疫炎癥是癲癇發(fā)生的基本特征。免疫炎癥貫穿于癲癇發(fā)生的全過(guò)程。HMGB1作為重要的晚期炎癥因子是神經(jīng)元損傷和免疫炎癥的銜接因子，參與神經(jīng)病理生化的進(jìn)程，是干預(yù)兒童癲癇的關(guān)鍵靶點(diǎn)。其參與炎癥過(guò)程中的胞內(nèi)易位、胞外釋放、啟動(dòng)下游免疫炎癥幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)都是可干預(yù)的靶標(biāo)。該機(jī)制是區(qū)別于經(jīng)典抗癲癇藥物的離子通道阻滯、調(diào)節(jié)興奮/抑制神經(jīng)遞質(zhì)、結(jié)合突觸小泡等機(jī)制。它以神經(jīng)炎癥為干預(yù)機(jī)制，具有抗癲癇和抑制癲癇發(fā)生的雙重作用，有較廣闊的前景。

鑒于HMGB1因子發(fā)現(xiàn)相對(duì)較晚，學(xué)術(shù)界完整地認(rèn)識(shí)其結(jié)構(gòu)和功能不足20年，被引入癲癇領(lǐng)域僅10余年，兒童癲癇領(lǐng)域認(rèn)識(shí)更晚，因此仍有許多認(rèn)識(shí)上的不足和需要拓展的方向：(1)進(jìn)一步加強(qiáng)HMGB1在兒童癲癇領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究。需要進(jìn)一步明確HGMB1的上下游、并行信號(hào)通路的相互機(jī)制或可能存在的正負(fù)反饋調(diào)節(jié)，以及與未成熟腦、發(fā)育期癲癇腦的內(nèi)在聯(lián)系。需要更多的高質(zhì)量學(xué)術(shù)論著支撐，拓展該信號(hào)通路的深度和廣度。(2)進(jìn)一步加強(qiáng)中藥干預(yù)HMGB1的精準(zhǔn)化、物質(zhì)基礎(chǔ)及靶向性研究。中藥具有多靶點(diǎn)、多成分干預(yù)的特點(diǎn)，該特點(diǎn)既是中藥的優(yōu)勢(shì)，也是阻礙中藥現(xiàn)代化的障礙。前期部分實(shí)驗(yàn)已經(jīng)論證了中藥單體及復(fù)方能對(duì)HMGB1的生成、轉(zhuǎn)錄及釋放具有調(diào)節(jié)作用。但復(fù)方的成分多樣性及藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)限制了中藥的精準(zhǔn)化和靶向性。明晰中藥復(fù)方或單體的血清成分和通過(guò)血腦屏障的入腦成分，探討中藥干預(yù)兒童癲癇的成分-靶點(diǎn)-效應(yīng)研究是未來(lái)中藥的研究方向，目前新興的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)也為其提供了技術(shù)保障。