基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究桑白皮治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機制

楊佩璇，陳一村

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣東 汕頭 515041）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種發(fā)病機制不明的多關(guān)節(jié)慢性炎癥性疾病.中醫(yī)藥治療RA在于改善癥狀體征及關(guān)節(jié)功能障礙，進而提高生活質(zhì)量[1].目前中藥在治療RA上也有一定的療效.桑白皮為?？粕僦参锏母稍锔ど＃ɡW(xué)名：Morus alba L.），其藥理作用有鎮(zhèn)痛、消炎、鎮(zhèn)咳、平喘、降血糖、降脂、抗糖尿病周圍神經(jīng)病變作用等[2].桑白皮總黃酮對小鼠醋酸所致的外周疼痛和急性炎癥期有明顯的抑制作用[3].韋寧等[4]收集古醫(yī)籍及現(xiàn)代醫(yī)家臨床經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)桑白皮配伍桑葉、桑枝、黃芩、麻黃、連翹、赤小豆等可治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[4].網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥活性成分、作用靶點及其機制研究中的應(yīng)用方面有著獨特的優(yōu)勢.本研究將采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法來預(yù)測桑白皮治療RA的靶點及可能的作用機制，為臨床治療提供理論依據(jù).

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

表1 實驗所用的數(shù)據(jù)庫與軟件

1.2 桑白皮活性成分及靶點篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP）中，以“sangbaipi”為關(guān)鍵詞，查找桑白皮的所有化學(xué)成分.桑白皮的主要活性成分以口服生物利用度（0B）≥30%、類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件收集出來，并在此數(shù)據(jù)庫中檢索出其主要活性成分對應(yīng)的靶點蛋白，將靶點蛋白對應(yīng)的基因簡稱用STRING或Unitprot數(shù)據(jù)庫查找獲得.

1.3 RA靶點的獲取

以“Rheumatoid Arthritis”為關(guān)鍵詞分別在人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards和DisGeNET數(shù)據(jù)庫中檢索，根據(jù)一定的條件篩選出類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病的基因，整合并刪除重復(fù)值.

1.4 桑白皮治療RA的活性成分網(wǎng)絡(luò)分析

桑白皮與RA的共同靶點通過在線韋恩圖繪制平臺進行計算，并將藥物與疾病的共同靶點繪制成圖.用Cytoscape軟件構(gòu)建出交集靶點與疾病、藥物的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并通過分析相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)參數(shù)來推測桑白皮發(fā)揮治療RA作用的可能成分.

1.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建

將上述“1.4”項下兩者交集的靶點上傳到STRING數(shù)據(jù)庫，選擇“多種蛋白質(zhì)”和物種“人”，其余不變.導(dǎo)出得到的蛋白相互作用圖的相關(guān)數(shù)據(jù)，并利用Cytoscape3.8.2進行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的可視化.

1.6 生物功能與通路富集分析

將得到的交集靶點導(dǎo)入DAVID6.8數(shù)據(jù)庫，對本研究獲取的桑白皮治療RA的關(guān)鍵靶蛋白進行GO（Gene Ontology，基因本體論）功能和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書）通路富集分析.以P＜0.01作為篩選條件，得到的分析結(jié)果用微生信在線繪圖平臺進行可視化.

1.7 潛在作用靶點與關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

從“1.6”項獲得參與RA的20條KEGG通路后，與中藥、成分、共同靶點一一對應(yīng)，并將其共同輸入到Cytoscape3.8.2軟件中，構(gòu)建“藥物-活性成分-潛在靶點-關(guān)鍵通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系.

2 結(jié)果

2.1 桑白皮活性成分的篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP）搜集桑白皮所有化學(xué)成分194個，根據(jù)“1.2”項下的篩選條件得到桑白皮的潛在活性成分有31個，見表2.

表2 桑白皮主要化學(xué)成分信息

2.2 桑白皮成分抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點預(yù)測

在TCMSP中將桑白皮31個活性成分對應(yīng)的靶點查找出來，并在Uniprot、STRING數(shù)據(jù)庫將其基因標(biāo)準(zhǔn)化，剔除重復(fù)和無效靶點后，得到有效靶點基因190個.在GeneCards、DisGeNET中檢索RA的作用靶點，整合后并剔除重復(fù)值，得到RA疾病的作用靶點647個.利用在線韋恩繪制平臺繪制韋恩圖并得到桑白皮治療RA的交集靶點有 38個，如圖 1，分別為 NOS2，PTGS1，AR，PPARG，PTGS2，PIK3C，ESR1，SCN5A，NFKBIA，HSPA5，MYC，GJA1，IL1B，CXCL8，IL2，COL1A1，PTEN，MPO， COL3A1， MAPK14， NR3C1， IKBKB， TNF， MMP1， ICAM1， VCAM1，MMP3， FOS， MMP9， MAPK1， IL6， TP53， CXCL2， CRP， CXCL10， SPP1，RUNX2，CD40LG.這些靶點可能是桑白皮發(fā)揮治療RA的主要基因靶點.

圖1 桑白皮有效成分靶點-疾病靶點韋恩圖

2.3 活性成分關(guān)鍵靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

桑白皮與RA作用靶點相關(guān)的藥物活性成分有21個，將活性成分、中藥與疾病共同的關(guān)鍵靶點用Cytoscape 3.8.2軟件進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，如圖2.圖中，菱形代表桑白皮的有效成分，圓形代表作用靶點.網(wǎng)絡(luò)顯示，藥物活性成分連接值在前5的為quercetin（槲皮素）、kaempferol（山奈酚）、Glabrone（光甘草酮）、Moracin D（桑辛素D）、Iristectorigenin（9CI）（鳶尾黃酮甲素（9CI））.上述成分可能是桑白皮治療RA的重要活性成分，在治療RA中具有重要意義.

圖2 桑白皮“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.4 共有蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將桑白皮與RA交叉的38個靶基因上傳至STRING平臺，物種設(shè)定為“Human”根據(jù)高級篩選條件“high confidence（0.4）”進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，即最低要求交互分?jǐn)?shù)為0.4，檢索得到PPI網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)數(shù)據(jù)，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件繪制出桑白皮-RA關(guān)聯(lián)的蛋白交互的網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3.由圖3可得，此網(wǎng)絡(luò)共包括節(jié)點38個，邊411個.圖中節(jié)點的大小和顏色與靶點間連線有關(guān)，連線越多，節(jié)點越大，度值越大；節(jié)點的顏色從黃色到深藍(lán)色，相應(yīng)的度值也逐漸變大.結(jié)果提示，桑白皮對抗RA的靶標(biāo)中Degree值最高的靶點TNF、IL6、IL1B、PTGS2、TP53、MMP9、CXCL8、NFKBIA、PPARG、VCAM1，度值分別為36、35、34、33、33、32、30、28、27、26.這可能是桑白皮治療RA的關(guān)鍵靶點.

圖3 “藥物-疾病”交集基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能分析與KEGG通路富集分析結(jié)果

在GO功能分析結(jié)果中，在P＜0.01基礎(chǔ)上選取生物過程（Biological Processes，BP）、分子功能（Molecular Functions，MF）、細(xì)胞組分（Cellular Components，CC）富集基因數(shù)目前10的生物學(xué)過程，利用微生信平臺進行數(shù)據(jù)可視化處理得到柱狀圖，如圖4，顯示桑白皮對RA的治療作用主要與細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外液、蛋白質(zhì)結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合等相關(guān).

圖4 桑白皮治療RA的GO生物過程

對38個靶點進行KEGG通路富集分析，篩選P＜0.01，選擇富集前20的通路為候選通路，主要涉及到脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號通路、癌癥通路、IL-17信號通路等信號通路.將上述信號通路利用微生信平臺進行數(shù)據(jù)處理后得到氣泡圖，如圖5.

圖5 桑白皮治療RA的KEGG通路

2.6 藥物-活性成分-潛在靶點-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

將關(guān)鍵信號通路與桑白皮治療RA的潛在作用靶點及藥物的活性成分進行一一映射，利用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建藥物-活性成分-潛在靶點-關(guān)鍵通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，如圖6，藍(lán)色圓形代表靶點基因，橙色菱形代表通路，黃色正方形代表藥物活性成分，紫色V字形代表藥物桑白皮.從網(wǎng)絡(luò)連接值的分析結(jié)果可知，桑白皮治療RA的機制可能是藥物中的 quercetin、kaempferol、Glabrone、Moracin D、Iristectorigenin（9CI）等有效成分通過MAPK14、TNF、IKBKB、IL6、MAPK1、NFKBIA、PTGS2、FOS、CXCL8、IL1B等關(guān)鍵靶點，作用于脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號通路、癌癥通路、IL-17信號通路等通路，從而發(fā)揮治療作用.

圖6 藥物-活性成分-潛在靶點-關(guān)鍵通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明桑白皮的抗炎作用顯著，而RA的發(fā)病機制可能與免疫細(xì)胞、炎癥介質(zhì)、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）、氧化應(yīng)激異常、遺傳和生存環(huán)境因素等有關(guān)[5].網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的問世為中藥作用于疾病的機制研究提供了一種新的方法和思路，它能夠從整體聯(lián)系到微觀，從多個層面系統(tǒng)地分析分子作用機制[6].

通過分析桑白皮有效成分顯示，桑白皮主要通過21個活性成分對RA進行干預(yù)治療，從網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果中可以得出度值排名靠前的有槲皮素、山奈酚、鳶尾黃酮甲素（9CI）、桑辛素D、光甘草酮等.這些成分也是桑白皮治療RA的關(guān)鍵成分.葉香蘭等研究認(rèn)為槲皮素具有多種生物學(xué)活性，如抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)和分泌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抑制滑膜細(xì)胞的增殖等，可以抑制RA的病理過程[7].另有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過抑制核因子（nuclear factor kappa-B，NF-κB）活化，減少炎癥條件下軟骨細(xì)胞中MMP-13的產(chǎn)生、基質(zhì)降解和凋亡來保護軟骨[8].對于山奈酚，有研究者[9]通過體外和CIA小鼠的體內(nèi)實驗研究，發(fā)現(xiàn)山奈酚降低了RA成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LSs）的遷移、侵襲和MMP表達(dá)，還明顯的抑制了腫瘤壞死因子（TNF-α）誘導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活，并且減輕了CIA小鼠關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度.Lin等[10]研究揭示了山奈酚可預(yù)防和治療RA、紅斑性狼瘡和強直性嵴柱炎等炎癥性疾病.鄒桂欣等研究發(fā)現(xiàn)鳶尾黃酮甲素對LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7建立的細(xì)胞炎癥反應(yīng)中NO的生成量均有顯著抑制作用，進而表明其抗炎作用的相關(guān)關(guān)系[11].康艷賓等研究證實桑辛素對細(xì)胞的增殖、凋亡基因表達(dá)量有抑制作用[12].這說明桑白皮可能通過這些關(guān)鍵成分來發(fā)揮治療RA的作用.

從藥物-活性成分-潛在靶點-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)結(jié)果得到，桑白皮的活性成分可能作用于MAPK14、TNF、IKBKB、IL6、MAPK1、NFKBIA、PTGS2、IL1B等網(wǎng)絡(luò)連接較多的靶點，而這些靶點可能是治療RA的關(guān)鍵靶點.如在免疫介導(dǎo)的RA的三個病理過程：炎癥、增殖和骨破壞中，MAPK起著重要的調(diào)節(jié)作用[13].有研究者通過實驗發(fā)現(xiàn)MAPK14抑制劑可幫助治療RA和其他慢性炎癥性疾病，同時具有靶向抑制MAPK14的化合物也應(yīng)用到治療RA當(dāng)中[14].尚華等[15]通過生物信息學(xué)分析RA作用機制可能包括調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子（如IL-6、TNF-α、IL-17等）分泌和免疫細(xì)胞（如Th17細(xì)胞、Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、破骨細(xì)胞等）分化，調(diào)控自噬通路.而腫瘤壞死因子（TNF-α）是一種在RA發(fā)病機制中起重要調(diào)控作用的細(xì)胞因子.可見在桑白皮治療RA機制中，這些靶點可能起到關(guān)鍵作用.

在KEGG分析中顯示，桑白皮治療RA的作用機制主要通過脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17信號通路、癌癥通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等信號通路.如王志會等通過研究分析脂質(zhì)代謝紊亂及內(nèi)皮功能異常在RA患者早發(fā)動脈粥樣硬化中認(rèn)為炎癥與脂代謝紊亂互為因果，氧化修飾型低密度脂蛋白可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、白細(xì)胞介素1（IL-1）、TNF-α等致炎因子[16].TNF-α與TNF受體結(jié)合，能夠引起細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)，調(diào)控目的基因的表達(dá)，造成炎癥反應(yīng)和骨關(guān)節(jié)損傷[17].IL-17的致炎性很強，在RA的發(fā)病過程中有著重要作用，IL-17信號通路可激活多條通路如NF-κB、JNK等，呂芳[18]通過觀察Actl基因表達(dá)下降后IL-17誘導(dǎo)的IL-6和IL-8表達(dá)的變化，驗證了其參與了RA的發(fā)病.以上這些通路大多被證實對治療RA具有一定的調(diào)控作用.

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對桑白皮治療RA的作用機制進行了預(yù)測，其發(fā)揮作用途徑涉及到多個成分、靶點及信號通路，但關(guān)鍵途徑的調(diào)控仍要深入研究，后續(xù)將通過體外細(xì)胞實驗和體內(nèi)動物實驗等驗證.