擬穴青蟹不同卵巢發(fā)育時期各組織的脂肪酸組成

何先達，鐘文杰，余金達，陳創(chuàng)思，熊永龍，王樹啟，溫小波，陳翠英*

（1.汕頭大學廣東省海洋生物技術(shù)重點實驗室，廣東 汕頭 515063；2.華南農(nóng)業(yè)大學海洋學院，廣東 廣州 510642）

擬穴青蟹隸屬于甲殼綱十足目短尾亞目梭子蟹科，因適應(yīng)力強、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟價值高，是我國東南沿海重要的經(jīng)濟蟹類之一[1].在十足目甲殼類動物卵巢發(fā)育過程中，卵黃發(fā)生期是一個重要階段，期間會呈現(xiàn)血淋巴中卵黃蛋白原濃度急劇增加和脂類快速蓄積的特點[2].脂類在甲殼類動物卵巢快速發(fā)育過程中有著十分重要的作用，它不僅提供卵巢必需脂肪酸、磷脂和某些激素的前體等必需營養(yǎng)成分，更是為胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)和能量[3].磷脂通過促進卵黃發(fā)生期營養(yǎng)物質(zhì)的快速積累和脂類代謝進而促進卵黃發(fā)生[4].功能性長鏈多不飽和脂肪酸（Long-chain polyunsaturated fatty acid，LC-PUFA），如花生四烯酸（20：4n-6，ARA）、二十碳五烯酸（20：5n-3，EPA）和二十二碳六烯酸（22：6n-3，DHA）不僅對細胞膜的流動性有著重要作用，還對卵巢的發(fā)育成熟，卵子的受精和孵化，甚至幼體的存活、生長和變態(tài)，均具有重要的營養(yǎng)作用[5-8].

目前，已有研究報道野外捕撈擬穴青蟹在不同卵巢發(fā)育階段組織脂肪酸的組成特點[9-10]，發(fā)現(xiàn)卵巢指數(shù)會隨著卵巢的發(fā)育成熟而顯著增加，相反，肝胰腺指數(shù)則顯著降低；肝胰腺和卵巢組織中的LC-PUFA含量也顯著升高，尤其是EPA和DHA.由于野外捕撈和池塘養(yǎng)殖的生存環(huán)境及所攝食的餌料組成不同，青蟹組織脂類及其脂肪酸的組成也會有所不同，因此，本研究擬系統(tǒng)分析池塘養(yǎng)殖的擬穴青蟹不同卵巢發(fā)育時期卵巢、肝胰腺和肌肉組織不同脂類的脂肪酸組成變化，以幫助我們更好地了解人工養(yǎng)殖擬穴青蟹卵巢發(fā)育時期的脂類及脂肪酸營養(yǎng)需求，為親蟹的培育和親蟹人工配合飼料的開發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 擬穴青蟹來源與樣品采集

2020年9至10 月從廣東省汕頭市牛田洋擬穴青蟹養(yǎng)殖示范區(qū)獲得卵巢發(fā)育處于不同時期的擬穴青蟹各6只，平均質(zhì)量（165.45±36.34）g.實驗蟹的日常投喂餌料主要為淡水螺絲、小毛蚶、短齒蛤等低值貝類.將青蟹麻醉后稱重，解剖采集所有的卵巢、肝胰腺和肌肉組織并稱重，分別計算青蟹的卵巢指數(shù)（GSI）和肝胰腺指數(shù)（HSI）.解剖時參考Islam等[9]的方法將擬穴青蟹卵巢發(fā)育階段分為5個時期：Ⅰ期處于發(fā)育前期，卵巢呈半透明、薄而光滑；Ⅱ期是發(fā)育初期，此時卵巢呈白燭狀；Ⅲ期顏色轉(zhuǎn)淺黃則已進入卵黃發(fā)生初期；IV期卵巢體積逐漸增大，顏色轉(zhuǎn)為黃色，卵巢發(fā)育即將成熟，進入卵黃發(fā)生旺期；V期卵巢變?yōu)槌?橘紅色則發(fā)育至成熟期.組織樣品經(jīng)冷凍干燥后研磨粉碎密封保存于-20℃待測.具體公式如下：

1.2 總脂、中性脂、極性脂與脂肪酸組成檢測

按照Bligh和Dyer[11]介紹的總脂提取方法，稱取一定量組織冷凍干燥樣品，用氯仿/甲醇提取卵巢發(fā)育不同階段各組織的總脂.旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥稱重后，轉(zhuǎn)移總脂至正相硅膠萃取小柱（SEP-PAK VAC PSA 6cc 500 mg，30/pk，美國Waters公司）內(nèi)，后用氯仿和甲醇從總脂中分別洗脫中性脂和極性脂，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后稱重.然后根據(jù)Chen等[12]介紹的方法，將分離的極性脂和中性脂經(jīng)0.5 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液皂化至油滴消失后，加入14%的三氟化硼甲醇溶液，75℃甲酯化處理15 min，接著加入1 mL的飽和氯化鈉溶液和4 mL正己烷混合均勻靜置1 h，取上清經(jīng)0.22 μm針頭濾膜過濾至棕色上樣瓶中，充氮氣后密封上機檢測.

脂肪酸組成成分的檢測按照Chen等[12]介紹的儀器設(shè)定參數(shù)和程序，采用日本島津GC-17A氣相色譜儀進行測定.色譜柱為安捷倫的CP-Sil88氣相毛細管柱（60 m×0.25 mm，0.2 μm），用純度為99.999%的氮氣以1.0 mL/min的流速進行載氣.進樣口和檢測溫度為250℃，溶劑延長時間為4 min，進樣量為1 μL，進樣分流比為20∶1.升溫程序為：110℃保持3 min，以10℃/min的速度升至170℃保留10 min，然后以5℃/min的速度升至220℃并保持5 min.根據(jù)sigma公司的37種脂肪酸混標進行脂肪酸種類的鑒定，采用峰面積歸一法進行定量分析，求得各脂肪酸的百分含量.

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果用“平均值±標準誤”（mean±SE）表示，使用SPSS 26.0軟件對實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，當數(shù)據(jù)為百分數(shù)時則先進行反正弦函數(shù)轉(zhuǎn)換再處理，使用Tukey’s法進行多重比較，以P＜0.05為差異顯著性標準.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同卵巢發(fā)育時期卵巢指數(shù)和肝胰腺指數(shù)的變化

如圖1（a）所示，卵巢在Ⅱ期到Ⅴ期的發(fā)育過程中，卵巢指數(shù)不斷升高，在Ⅴ期高達16%，而肝胰腺指數(shù)在卵巢發(fā)育時期有所下降，但變化不明顯.

圖1 擬穴青蟹不同卵巢發(fā)育時期卵巢、肝胰腺指數(shù)及不同組織總脂含量變化

2.2 不同卵巢發(fā)育時期肝胰腺、卵巢和肌肉的總脂含量

如圖1（b）所示，在不同卵巢發(fā)育時期，卵巢的總脂含量隨卵巢發(fā)育成熟而顯著增加（P＜0.05），在Ⅴ期可達到約27%.而肝胰腺的總脂含量先增加，并在Ⅱ期達到最高，然后逐漸降低，且Ⅴ期的總脂含量顯著低于Ⅱ期的（P＜0.05）.肌肉的總脂含量較低（4%左右），并且在卵巢發(fā)育期間無顯著變化（P＞0.05）.

2.3 不同卵巢發(fā)育時期肝胰腺、卵巢和肌肉的極性脂和中性脂的變化

如圖2所示，肝胰腺中性脂的含量明顯高于極性脂，并且隨著卵巢的發(fā)育，中性脂含量逐漸升高至90%（Ⅴ期）.卵巢在發(fā)育初期（Ⅱ期）的中性脂含量較高，隨著卵巢的發(fā)育，其含量顯著降低（P＜0.05），并在卵巢發(fā)育后期與極性脂的含量基本相同，即約各占總脂的一半.肌肉的極性脂和中性脂在卵巢發(fā)育期間無顯著變化，且極性脂含量明顯高于中性脂，基本維持在總脂的80%左右.

圖2 擬穴青蟹不同卵巢發(fā)育時期卵巢、肝胰腺和肌肉極性脂和中性脂含量變化

2.4 不同卵巢發(fā)育時期肝胰腺、卵巢和肌肉的脂類脂肪酸組成變化

由表1可知，卵巢極性脂脂肪酸主要為16：0、18：1n-9、ARA、EPA和DHA.其中，16：0、16：1n-9、16：1n-7和DHA的含量在卵巢發(fā)育后期顯著增加（P＜0.05），而ARA和EPA的含量則顯著降低（P＜0.05），且18：1n-9的含量也呈現(xiàn)下降的趨勢.隨著卵巢的發(fā)育成熟，n-6 PUFA的含量從20.30%大幅降低至10.73%.卵巢中性脂脂肪酸主要為16：0、18：0、16：1n-9、18：1n-9、ARA、EPA 和 DHA.在卵巢發(fā)育過程中，18：0、16：1n-7和ARA的含量顯著降低（P＜0.05），而16：0、16：1n-9和DHA的含量顯著增加（P＜0.05），EPA的含量則無顯著變化.此外，MUFA和n-3 PUFA的含量與卵巢發(fā)育呈現(xiàn)正相關(guān)，而n-6 PUFA的含量在此過程中則急劇降低（15.13%→8.63%）.極性脂中，PUFA的含量最高，而在中性脂中，SFA的含量則相對較高.

表1 擬穴青蟹不同卵巢發(fā)育時期卵巢組織極性脂和中性脂脂肪酸組成變化

由表2可知，在肝胰腺中，中性脂和極性脂脂肪酸主要都是16：0、18：0、16：1n-9和18：1n-9，ARA、EPA和DHA的含量較低且在卵巢發(fā)育的不同階段里沒有明顯變化.與卵巢不同，在肝胰腺中SFA的含量最高，MUFA次之，PUFA最少.

表2 擬穴青蟹不同卵巢發(fā)育時期肝胰腺組織極性脂和中性脂脂肪酸組成變化

由表3可知，在肌肉組織中脂肪酸主要都是 16：0、16：1n-9、18：0、18：1n-9、ARA、EPA和DHA.在卵巢發(fā)育時期，除了18：0、18：1n-9和ARA小幅度降低以及16：1n-9和DHA小幅度上升以外，其它主要脂肪酸沒有明顯變化.與卵巢極性脂相似的是，肌肉極性脂中PUFA的含量較高；但是在肌肉中中性脂SFA與PUFA的含量相近，且都大于MUFA的含量.

表3 擬穴青蟹不同卵巢發(fā)育時期肌肉組織極性脂和中性脂脂肪酸組成變化

4 討論

4.1 不同卵巢發(fā)育時期卵巢、肝胰腺和肌肉的總脂、中性脂和極性脂含量的變化

在擬穴青蟹卵巢快速發(fā)育的過程中，卵巢指數(shù)和總脂含量大幅增加（7%—27%），而肝胰腺總脂的干重含量先增加后逐漸降低，說明此過程肝胰腺中的脂類至少存在部分向快速發(fā)育的卵巢轉(zhuǎn)移，而肌肉中的總脂含量較低且期間無明顯變化，脂類由肌肉轉(zhuǎn)移到卵巢的可能性極低.這一點已在其他十足目甲殼類動物卵巢發(fā)育過程中被證實了，即肝胰腺中富含脂類的卵黃蛋白原能被轉(zhuǎn)移到快速發(fā)育的卵巢中，為卵巢的發(fā)育提供物質(zhì)基礎(chǔ)[13-14].此外，擬穴青蟹的肝胰腺總脂含量先增加后減少的現(xiàn)象，可能是因為在卵巢發(fā)育初期，青蟹攝食量增加，此時的卵巢發(fā)育尚不成熟，從肝胰腺轉(zhuǎn)移到卵巢的脂類有限，從外界獲取的大量脂類暫時儲存在肝胰腺中，造成肝胰腺總脂含量的暫時升高.這一結(jié)果與Wu等[10]和Tantikitti等[15]的在不同卵巢發(fā)育時期的野外捕撈擬穴青蟹肝胰腺總脂含量趨勢相似，但卻與鋸緣青蟹不同，鋸緣青蟹在卵巢發(fā)育這一階段，肝胰腺脂類代謝活動加強，將從食物中攝取的脂類物質(zhì)不斷的合成脂肪，并迅速轉(zhuǎn)移至正在發(fā)育的卵巢中[16]，因此其卵巢脂類積累與肝胰腺總脂含量變化關(guān)系不大.

在擬穴青蟹卵巢快速發(fā)育時期，卵巢的極性脂（主要為磷脂）的含量有明顯的增加，由于甲殼動物合成磷脂的能力非常有限[17]，在此階段擬穴青蟹卵巢磷脂的增加主要來源于外源性磷脂.而在卵巢發(fā)育成熟期，肝胰腺磷脂的含量明顯下降，說明卵巢磷脂的增加可能有部分是來源于肝胰腺的轉(zhuǎn)移.此外，肌肉組織在卵黃發(fā)生期中總脂含量、中性脂及極性脂變化均不明顯，表明肌肉組織可能在卵黃發(fā)育過程中的參與程度不大.

4.2 不同卵巢發(fā)育時期卵巢、肝胰腺和肌肉的脂肪酸組成的變化

在擬穴青蟹卵巢、肝胰腺和肌肉中，LC-PUFA的含量較高，且極性脂中LC-PUFA的含量都高于中性脂，不飽和脂肪酸的含量顯著高于飽和脂肪酸的含量，同時n-3 PUFA的含量一般高于n-6 PUFA，n-3/n-6的比值在1～3之間波動，這與在野外捕撈的擬穴青蟹[9-10]和鋸緣青蟹[17]上的研究結(jié)果相似，是海洋十足目甲殼類動物脂類脂肪酸的典型特征[18].

當卵巢從初期發(fā)育至卵黃發(fā)生期時，卵巢極性脂和中性脂的ARA含量均顯著降低.ARA是前列腺素和其他類二十烷酸的合成前體，而前列腺素不僅參與機體的生殖、呼吸和消化等生理活動，還可抑制脂質(zhì)的分解[19].因此，卵巢在Ⅱ期時高含量的ARA可能抑制脂肪的分解利用，促進脂肪在卵巢中的積累，而在Ⅲ期后，卵巢發(fā)育及卵子的形成需要較多能量，此時脂質(zhì)的分解利用開始加強，ARA的含量顯著低于Ⅱ期時的含量，并逐漸趨于穩(wěn)定.積累在卵巢中的PUFA含量顯著高于肝胰腺，表明PUFA尤其是DHA、EPA和ARA對于擬穴青蟹卵巢發(fā)育有著十分重要的作用.已有實驗證明，PUFA能促進甲殼類動物卵巢的發(fā)育、產(chǎn)卵和卵的孵化[6-7].在鋸緣青蟹[16]和中華絨螯蟹[20]的研究中發(fā)現(xiàn)，流產(chǎn)蟹肝胰腺中EPA和DHA的含量明顯高于抱卵蟹，說明可能是流產(chǎn)蟹肝胰腺中的PUFA尤其是EPA和DHA沒有及時轉(zhuǎn)移到卵巢中，導致胚胎發(fā)育不良，引起流產(chǎn).Wen等[21]對中華絨螯蟹卵巢發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)，LC-PUFA能顯著提高親蟹的產(chǎn)卵量和孵化率.若缺乏EPA和DHA則會顯著影響中華絨螯蟹的生殖性能以及幼體質(zhì)量.因此，在卵巢的快速發(fā)育時期，EPA和DHA等LC-PUFA在卵巢中的積累，不僅促進擬穴青蟹卵巢的發(fā)育成熟，也可為卵子的受精與孵化提供必需的營養(yǎng).

在擬穴青蟹的卵巢和肝胰腺的脂肪酸組成中，16：0、18：0和18：1n-9是主要成分，這些脂肪酸正是擬穴青蟹卵巢發(fā)育的主要能量來源.特別是在肝胰腺組織中，包括16：0和18：0在內(nèi)的SFA含量很高，是PUFA含量的2～3倍，高含量的SFA是肝胰腺的脂類儲存能量的主要形式.肌肉和卵巢的主要脂肪酸都是LC-PUFA，肌肉中的LC-PUFA含量比卵巢的高，且主要是ARA、EPA和DHA.與卵巢組織一樣，高含量的LC-PUFA是肌肉細胞代謝活動的基礎(chǔ)，而且n-3 LC-PUFA含量的提高有利于提高甲殼動物的滲透壓調(diào)節(jié)能力[22]，這可能是肌肉中LC-PUFA含量較高的重要原因之一.

本研究分析了人工池塘養(yǎng)殖擬穴青蟹不同卵巢發(fā)育時期中卵巢、肝胰腺和肌肉脂類含量及其脂肪酸組成的變化，為進一步了解養(yǎng)殖擬穴青蟹過程中卵巢發(fā)育時期對脂類和脂肪酸的營養(yǎng)需求提供了參考資料，為擬穴青蟹膏蟹的培育及其人工配合飼料的研發(fā)提供了一定的理論依據(jù).