應(yīng)用馬鈴薯病原菌芯片法檢測(cè)馬鈴薯主要病毒試驗(yàn)及結(jié)果分析

逯春杏，曹春梅*，王曉嬌，許 飛，邢曉東，張志成

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；3.烏蘭察布市農(nóng)林科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000）

0 引言

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）屬于一年生茄科茄屬作物，一直以來(lái)在全世界的國(guó)家廣泛種植。2016年2月23日，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部正式發(fā)布《關(guān)于推進(jìn)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)開發(fā)的指導(dǎo)意見》，意見指出將馬鈴薯作為主糧產(chǎn)品進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，使得馬鈴薯成了繼稻米、小麥、玉米外的第四大主糧產(chǎn)業(yè)。近幾年來(lái)，我國(guó)的馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展速度越來(lái)越快，種植范圍越來(lái)越廣，但經(jīng)濟(jì)收入?yún)s不可觀。當(dāng)前在馬鈴薯作物上發(fā)現(xiàn)的病毒、類病毒已多達(dá)40余種[1]，是馬鈴薯產(chǎn)量減少、品質(zhì)下降、經(jīng)濟(jì)收入低的重要因素。為了解決這一問(wèn)題，需研究出一個(gè)高效快捷、靈敏度高、完整的、規(guī)范化的檢測(cè)技術(shù)體系。

傳統(tǒng)方法是根據(jù)病毒在寄主體內(nèi)寄生后的生物學(xué)特性來(lái)鑒別，但隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)在多采用病毒的核酸、病毒蛋白的分子生物學(xué)鑒別方法，來(lái)提高病毒鑒定的準(zhǔn)確性[2]?；蛐酒云涓咄俊⒏咝畔⒘壳易詣?dòng)化程度高的特點(diǎn)成為檢測(cè)病毒核酸的最佳方法之一。生物芯片屬于分子生物檢測(cè)層級(jí)，擁有優(yōu)越的靈敏度，它是利用檢體所提取出來(lái)的核酸RNA，經(jīng)由核酸擴(kuò)增儀（PCR）將其生物訊號(hào)放大到230倍，再利用專一性探針進(jìn)行結(jié)合偵測(cè)，其靈敏度比傳統(tǒng)檢測(cè)方法（ELISA或是RT-PCR）高。其檢測(cè)樣本可選擇馬鈴薯組培組織、薯塊或葉片。

通常，在種薯生產(chǎn)上檢測(cè)的病毒包括[3]：馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）、馬鈴薯卷葉病毒（potato leaf roll virus，PLRV）、馬鈴薯M病毒（potato virus M，PVM）、馬鈴薯S病毒（potato virus S，PVS）、馬鈴薯A病毒（potato virus A，PVA）、馬鈴薯X病毒（potato virus X，PVX）和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd）[4]。利用馬鈴薯病原菌芯片法不僅可以在簡(jiǎn)短的時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出是否含有上述病毒病，還可以同時(shí)檢測(cè)PVY-N Type病毒、PMTV病毒以及4種細(xì)菌，即細(xì)菌性軟腐?。‥ch）、軟腐黑脛（Pca、Pcc）、細(xì)菌性環(huán)腐（CMS）和細(xì)菌性青枯（RS），共計(jì)14種病毒病。該方法能有效避免因ELISA檢測(cè)中病毒空窗期所產(chǎn)生的漏檢之情形，準(zhǔn)確把握馬鈴薯種薯質(zhì)量，避免因遭受病毒或細(xì)菌感染造成的損失。

本研究利用馬鈴薯病原菌芯片檢測(cè)技術(shù)對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究中心保存的試管苗進(jìn)行病毒檢測(cè)。研究結(jié)果可為馬鈴薯脫毒種薯生產(chǎn)過(guò)程中病毒檢測(cè)及防治提供理論依據(jù)，提高馬鈴薯病毒檢測(cè)水平，完善病毒檢測(cè)體系。

1 基本原理

檢測(cè)試劑適合各種檢測(cè)樣品，包含馬鈴薯組培苗、馬鈴薯塊莖與植株葉片等。針對(duì)馬鈴薯病毒中的核酸進(jìn)行分子生物檢測(cè)，包括病原菌核酸提?。―NA/RNA Extraction）、核酸反轉(zhuǎn)錄聚合酵素連鎖反應(yīng)（Reverse Transcription Polymerase China Reaction）以及核酸雜合反應(yīng)（Hybridization），同時(shí)使用非放射性之化學(xué)呈色方法進(jìn)行顯色。

2 特點(diǎn)

檢測(cè)靈敏度比傳統(tǒng)檢測(cè)方法（ELISA或RT-PCR）高效、快捷。但需要注意環(huán)境與儀器的清潔，防止試驗(yàn)交叉感染。

3 材料與方法

3.1 試驗(yàn)材料

材料來(lái)源于內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究中心試驗(yàn)室所保存的試管苗共計(jì)40份。

3.2 主要儀器和試劑

主要儀器包括雜合反應(yīng)儀、震蕩混合機(jī)、PCR儀、影像掃描分析儀（選用）、離心機(jī)、洗板機(jī)（選用）、-18℃冷凍冰盒和移液槍。主要試劑：病原菌核酸提取試劑包括Rapid EB Ⅰ和Rapid EB Ⅱ。RT PCR試劑組包括：PVB-IV、Taq和RT。雜合反應(yīng)試劑組包括：HA Buffer、B Buffer、Strep-AP、NBT/BCIP、C Buffer、Wash Buffer、Gene Top PVB-IV芯片、96孔盤膠膜和研磨袋。此試劑盒由巨合生物科技股份有限公司提供。試驗(yàn)耗材（不包含在試劑盒中）：1.5 ml RNase-free離心管、拋棄式RNase-free吸管尖和RNasefree PCR操作管。

3.3 試驗(yàn)方法

3.3.1 病原菌核酸的快速提取

取0.35 g馬鈴薯組織，加入EBI試劑500 μl，將組織用小錘充分研磨。取100 μl該組織液到0.2ml PCR操作管中。將樣品于PCR儀器中99℃加熱2 min，隨后在85℃下加熱13 min，最后保存于4℃。用小型離心機(jī)快速離心30 s，小心吸取10 μl上清液加入預(yù)先裝有240 μl EBII試劑的1.5 ml微量離心管中。利用試管震蕩機(jī)將液體混合均勻，再用離心機(jī)離心數(shù)秒，此時(shí)管中的液體即為檢測(cè)用的RNA樣品。

3.3.2 RT-PCT反應(yīng)

按照樣品測(cè)定的數(shù)量來(lái)配制RT-PCR混合試劑，配制方法（表1）。將表中3種試劑利用震蕩機(jī)混合均勻，吸取10 μl分裝到各自PCR操作管中，最后在各PCR管中加入2 μl的樣品核酸。將裝好的所有PCR管放入PCR儀中，進(jìn)行擴(kuò)增處理。程序設(shè)置如下：a.45℃（30 min），94℃（2 min）；b.94℃（15 s），58℃（40 s），72℃（40 s），此過(guò)程循環(huán)30次；c.72℃（7min），8℃（∞）。

表1 RT-PCR混合試劑配制表

3.3.3 雜合反應(yīng)

將RT-PCR產(chǎn)物在PCR反應(yīng)儀中95℃加熱210 s，等反應(yīng)儀降溫至4℃后，取出PCR管并置于冷凍保溫盒中備用。離心數(shù)秒，取HA Buffer 100 μl到生物芯片中，加入RT-PCR產(chǎn)物10 μl，最后貼上膠膜。將生物芯片盤放入雜合反應(yīng)儀中，55℃，1000 rpm反應(yīng)30 min。反應(yīng)后，倒掉雜合反應(yīng)液，加入200 μl Wash Buffer清洗2次，最后靜置1 min。倒掉Wash Buffer，并于吸水紙拍干。同時(shí)配制Blocking Reagent（表2）與Detection Reagent（表3），二者混合均勻?qū)etection Reagent避光存放，備用。

表2 Blocking Reagent配制表

表3 Detection Reagent配制表

取Blocking Reagent混合液100 μl加入生物芯片中。將生物芯片盤放入雜合反應(yīng)儀中，55℃，1000 rpm反應(yīng)5 min。反應(yīng)后，倒掉反應(yīng)液，用Wash Buffer 200 μl清洗1次，再次倒掉Wash Buffe。加入100μl C Buffer濕潤(rùn)生物芯片，靜置1 min后倒掉并用吸水紙拍干。取Detection Reagent呈色混合液100 μl加入生物芯片盤中反應(yīng)。隨后將反應(yīng)盤放入雜合反應(yīng)儀中，55℃，0 rpm反應(yīng)7 min。反應(yīng)完畢后，倒掉反應(yīng)液，并用自來(lái)水大量沖洗反應(yīng)盤。沖洗完畢后，在55℃條件下干燥，并且判讀結(jié)果。

4）生物芯片結(jié)果判讀。根據(jù)展示，進(jìn)行直觀的結(jié)果判定（圖1）。

圖1 生物芯片結(jié)果判定對(duì)照

4 結(jié)果與分析

通過(guò)對(duì)40個(gè)馬鈴薯組培苗進(jìn)行病原菌芯片檢測(cè)，結(jié)果顯示（表4、圖2），在40份樣品中，9份樣品為復(fù)合侵染，7份為單獨(dú)侵染，24份未檢測(cè)到病毒侵染。其中，2份樣品為PVY、PVS和PLRV的復(fù)合侵染，3份樣品為PVY和PLRV的復(fù)合侵染，1份樣品為PVM和PLRV的復(fù)合侵染，1份樣品為PVM、PVS的復(fù)合侵染，1份樣品為PVS和PLRV的復(fù)合侵染，1份樣品為PVS和PSTVd的復(fù)合侵染。7份單獨(dú)侵染的樣品中，1份樣品為PSTVd侵染，3份樣品為PLRV侵染，1份樣品為PVM侵染，1份樣品為PVY侵染，1份樣品為PVS侵染。

圖2 部分樣品檢測(cè)結(jié)果判讀

表4 馬鈴薯病毒檢測(cè)結(jié)果

表4 馬鈴薯病毒檢測(cè)結(jié)果（續(xù)表）

由此可見，無(wú)論復(fù)合侵染還是單獨(dú)侵染，馬鈴薯PLRV病毒侵染率較高。PVA、PVX、Ech、CMS、RS和PCS均未檢測(cè)到，說(shuō)明PLRV可能是引起內(nèi)蒙古地區(qū)馬鈴薯病毒病的主要病原之一，并且在馬鈴薯脫毒工作中較難脫除干凈。

5 結(jié)論

由于病毒的侵染，馬鈴薯通過(guò)塊莖無(wú)性繁殖并逐代增殖和加重是其退化的真正原因，同時(shí)也影響了馬鈴薯的產(chǎn)量與品質(zhì)。因此，建立快捷高效的病毒檢測(cè)體系，加大對(duì)種薯質(zhì)量把關(guān)的力度，真正實(shí)現(xiàn)種薯的全面脫毒，是提高種薯產(chǎn)量、發(fā)揮優(yōu)良品種特性的重要手段之一[5]。

馬鈴薯病毒檢測(cè)技術(shù)主要有傳統(tǒng)生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)等。使用ELISA檢測(cè)[6]方法耗時(shí)較長(zhǎng)，不能一次性檢測(cè)出兩種或兩種以上病毒復(fù)合侵染的樣品，每一種病毒都需要獨(dú)立檢測(cè)，判定結(jié)果時(shí)會(huì)出現(xiàn)臨界值存在的缺陷，造成檢測(cè)結(jié)果存在一定偏差。近年來(lái)，隨著科技的發(fā)展，以病毒核酸為研究的分子檢測(cè)技術(shù)RT-PCR[7-8]更為靈敏、具有特異性，但檢測(cè)費(fèi)用高，儀器需求嚴(yán)格，操作過(guò)程復(fù)雜，且部分藥品對(duì)人體有致癌的危害性，對(duì)操作人員的專業(yè)技術(shù)要求較高。

使用馬鈴薯病原菌芯片檢測(cè)方法，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了工作效率與準(zhǔn)確性。一般40個(gè)樣品，24 h就可以輕松出結(jié)果，且結(jié)果同時(shí)包含常規(guī)6種病毒、1種類病毒和4種細(xì)菌性病毒。雖然購(gòu)買試劑盒和儀器一次性投入費(fèi)用高，但利于檢測(cè)后工作的長(zhǎng)期開展。簡(jiǎn)單培訓(xùn)相關(guān)技術(shù)人員即可上手檢測(cè)，程序簡(jiǎn)化，判定結(jié)果一目了然，不存在處于臨界值的判定缺陷。只需1間試驗(yàn)室分成4個(gè)不同模式的操作臺(tái)，避免各試驗(yàn)步驟間相互交叉感染即可。試劑盒中所用的藥劑均為安全藥品，不會(huì)危及人體的健康。從種薯病毒檢測(cè)源頭抓起，定期抽檢種薯生產(chǎn)企業(yè)，督促各龍頭企業(yè)及種植戶自檢自查，提高種薯產(chǎn)量，提升馬鈴薯品質(zhì)，形成一個(gè)良性循環(huán)的馬鈴薯種薯質(zhì)量體系，從而增加經(jīng)濟(jì)收入，促進(jìn)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展。