皂莢皂苷元制備及純化工藝研究

劉艷萍，王 瑩，張 靜，范定臣，劉佳佳，趙俊杰，薛 剛

（1河南省林業(yè)科學(xué)研究院，鄭州 450008；2南陽(yáng)理工學(xué)院河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南南陽(yáng) 473004；3河南投資集團(tuán)有限公司，鄭州 450008；4河南省弘富林藥業(yè)有限公司，河南內(nèi)鄉(xiāng) 474350）

0 引言

皂莢(Gleditsia sinensis)是中國(guó)特有的豆科皂莢屬生態(tài)經(jīng)濟(jì)樹種，分布于國(guó)內(nèi)19個(gè)?。ㄊ校⒆灾螀^(qū)。皂莢莢果中皂苷含量在30%以上，是已知的皂苷含量最高的樹種[1-2]，皂苷具有獨(dú)特的生物活性[1,3-4]，在食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)的應(yīng)用不斷擴(kuò)大[1,5]。皂苷元是皂苷的重要酸解產(chǎn)物，與皂苷分類劃分依據(jù)相同可將其分為甾體皂苷元和三萜皂苷元，甾體皂苷元（如薯蕷皂苷元）是許多甾體激素的重要前體物質(zhì)，具有多種重要的藥理作用[6-7]；三萜皂苷元（如皂莢皂苷元）具有消炎、抑制腫瘤和抗病毒等多種作用[8-9]，可應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、金屬加工等領(lǐng)域，擁有廣闊的發(fā)展前景。目前從植物中制備皂苷元的方法主要有常規(guī)酸水解法[10-13]、酶解法[14-15]、超臨界CO2萃取法[16]和微生物法[17]等。而相較于薯蕷皂苷元較成熟的制備技術(shù)，皂莢皂苷制備皂苷元的技術(shù)則處于摸索階段。Zhang等[4]利用波譜測(cè)定確定了4種皂莢皂苷。皂苷元不溶于水，微溶于甲醇，溶于乙醇、乙酸乙酯、三氯乙烯等有機(jī)溶劑，但是對(duì)于親酯類的石油醚、正己烷等溶解性很低，并且大多數(shù)皂苷元有良好的白色結(jié)晶。三萜皂苷元可以分為四環(huán)三萜和五環(huán)三萜2類，五環(huán)三萜皂苷元具有一些優(yōu)秀的生物活性[16-21]。有關(guān)皂莢皂苷元分離純化的文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究采取有機(jī)溶劑萃取和重結(jié)晶的方法對(duì)皂莢果皮皂苷元的純化工藝進(jìn)行探究，旨在為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要試劑 硫酸、鹽酸、甲醇、無水乙醇、二氯甲烷、三氯乙烯、乙酸乙酯、正己烷、冰醋酸、高氯酸、香草醛等均為分析純，60%皂莢皂苷粗品由西安森冉生物工程有限公司提供。

1.1.2 主要儀器 7890A氣相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司；1260型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司；LXJ-IIB低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；752N型紫外可見分光光度計(jì)，上海電分析儀器有限公司等。

1.2 皂莢皂苷及皂苷元含量的檢測(cè)

1.2.1 HPLC法測(cè)定含量

（1）色譜條件。

DAD法色譜柱為ZORBAX SB-C18柱(150 mm×4.6mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(95:5，V/V)，波長(zhǎng)280nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

ELSD法色譜柱同DAD法，流動(dòng)相為甲醇-水(95:5，V/V)，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL，蒸發(fā)光散射器漂移管溫度80℃，載氣流速1.4 L/min。

（2）樣品檢測(cè)。取適量皂苷、皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品和皂莢皂苷粗品用甲醇溶解，配制成1 mg/mL的溶液，用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 氣相色譜法測(cè)定酸解產(chǎn)物中皂苷元含量

（1）色譜條件。色譜柱為HP-5(30 m×0.32 mm)，進(jìn)樣量4 μL，進(jìn)樣口溫度330℃，F(xiàn)ID 330℃，載氣流速2 mL/min，分流比10:1，柱溫280℃，以10℃/min升至310℃保持12 min。

（2）樣品檢測(cè)。取適量酸解產(chǎn)品用甲醇溶解，配制成1 mg/mL的溶液，用氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)氣相色譜圖，通過對(duì)皂苷元峰面積所占百分比大小進(jìn)行比較，判斷皂苷元含量。

1.3 皂莢皂苷酸解工藝的單因素試驗(yàn)

1.3.1 酸濃度的選擇 分別稱取5份皂莢皂苷粗品各1 g，按照1:30(m:v)的料液比加入1、1.5、2、2.5、3 mol/L的濃硫酸溶液或2、3、4、5、6 mol/L的濃鹽酸溶液，于90℃下水浴振蕩，酸解4 h，酸解液真空抽濾，濾渣干燥稱重，測(cè)定酸解產(chǎn)品中皂苷元的含量。

1.3.2 酸解時(shí)間的選擇 分別稱取4份皂莢皂苷粗品各1 g，按照1:30(m:v)的料液比加入已選擇出的最優(yōu)濃度的濃硫酸溶液或濃鹽酸溶液，于90℃下水浴振蕩，酸解時(shí)間為3、4、5、6 h，酸解液真空抽濾，濾渣干燥稱重，測(cè)定酸解產(chǎn)品中皂苷元的含量。

1.3.3 酸解溫度的選擇 分別稱取4份皂莢皂苷粗品各1 g，按照1:30(m:v)的料液比加入已選擇出的最優(yōu)濃度濃硫酸溶液或濃鹽酸溶液，于80、85、90、95℃下水浴振蕩，按選出的最優(yōu)時(shí)間進(jìn)行酸解，酸解液真空抽濾，濾渣干燥稱重，測(cè)定酸解產(chǎn)品中皂苷元的含量。

1.3.4 料液比的選擇 分別稱取4份皂莢皂苷粗品各1 g，按照1:20(m:v)、1:30(m:v)、1:40(m:v)、1:50(m:v)的料液比加入已選擇出最優(yōu)濃度的濃硫酸溶液或濃鹽酸溶液，于最佳溫度下水浴振蕩，按選出的最優(yōu)時(shí)間進(jìn)行酸解，酸解液真空抽濾，濾渣干燥稱重，測(cè)定酸解產(chǎn)品中皂苷元的含量。

1.3.5 正交試驗(yàn) 根據(jù)酸解工藝條件對(duì)產(chǎn)物中皂苷元含量的影響試驗(yàn)，以酸解溫度、酸種類、酸濃度、酸解時(shí)間4個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化皂莢皂苷酸解工藝參數(shù)。

1.4 皂苷元萃取劑的選擇

取3 g 60%皂莢皂苷原料，加入90 mL 5 mol/L鹽酸，在90℃下酸解1 h，過濾得黑褐色固體為皂苷元粗品。分別加入90 mL甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、三氯乙烯，過濾。觀察現(xiàn)象。

1.4.1 萃取劑加量的選擇 取3 g 60%皂莢皂苷原料，加入90 mL 5 mol/L鹽酸，酸解1 h，過濾，取濾餅在60℃下烘干1 h，分別加入30、45、60、75、90 mL的溶劑，攪拌5 min，過濾，取濾液，旋干，回收溶劑，將所得固體放于60℃下烘干1 h，稱重，待測(cè)。

1.4.2 萃取時(shí)間的選擇 取3 g 60%皂莢皂苷原料，加入90 mL 5 mol/L鹽酸，酸解1 h，過濾，取濾餅在60℃下烘干1 h，加入60 mL的溶劑，分別攪拌10、30、50、70、90 min后過濾，取濾液回收溶劑，將所得固體放于60℃下烘干1 h，稱重。

1.4.3 萃取次數(shù)的選擇 取3 g 60%皂莢皂苷原料，加入90 mL 5 mol/L鹽酸，酸解1 h，過濾，取濾餅在60℃下烘干1 h，加入60 mL的溶劑，分別分成1、2、3次萃取，單次萃取時(shí)間為5 min。將所得濾液回收，將固體置于60℃下烘干1 h，稱重。

1.4.4 皂苷元萃取純化的正交試驗(yàn) 設(shè)立2、3、4、5 mol/L 4組不同的酸濃度，硫酸、鹽酸2種不同酸種類，酸解時(shí)間分別為3、6 h，分別加入60 mL的二氯甲烷和三氯乙烯萃取劑。檢驗(yàn)萃取前后產(chǎn)物含量差別。

1.5 皂苷元重結(jié)晶溶劑選擇

溶劑，調(diào)整體系的極性和皂苷元的溶解性達(dá)到重結(jié)晶目的，測(cè)定所得重結(jié)晶產(chǎn)物中皂苷元的含量，確定最佳的重結(jié)晶劑。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS分析軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 皂莢皂苷元檢測(cè)條件的確定

分別向產(chǎn)物中加入三氯乙烯、甲醇、乙醇、丙酮，盡量使產(chǎn)物完全溶解，加入水或石油醚等皂苷元不溶的

2.1.1 HPLC法 使用HPLC-DAD法觀察皂苷元和皂莢皂苷粗品出峰位置的差異。由圖1～2可知，皂莢皂苷出峰時(shí)間早于皂苷元，皂苷在轉(zhuǎn)化為皂苷元時(shí)出峰時(shí)間會(huì)向后推移，ELSD峰型好于DAD圖譜。

圖1 DAD圖譜

圖2 ELSD和氣相圖譜

2.1.2 氣相色譜法 取酸解的產(chǎn)物用氣相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，圖譜見圖2C：氣相色譜法靈敏度高，能夠檢測(cè)出酸解出的微量皂苷元，還能將不同結(jié)構(gòu)的皂莢皂苷元有效分離，因此選用氣相色譜法檢測(cè)皂莢皂苷元含量。

2.2 皂莢皂苷酸解工藝的單因素分析

2.2.1 最佳酸濃度的確定 料液比1:30，酸解溫度為90℃，酸解4 h，氣相色譜法對(duì)酸解產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 不同酸濃度硫酸和鹽酸酸解產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果

硫酸濃度在1、2 mol/L范圍內(nèi)酸解產(chǎn)生皂莢皂苷元a（三萜皂苷元）變化比較大，2.5、3 mol/L范圍變化不大；但是在1、1.5、2、2.5 mol/L的濃度均無法產(chǎn)生皂莢皂苷元b（甾體皂苷元），3 mol/L開始產(chǎn)生皂莢皂苷元b。

鹽酸濃度在2、3、4、5 mol/L范圍內(nèi)對(duì)產(chǎn)生的皂莢皂苷元a和皂莢皂苷元b含量影響不大，濃度達(dá)到6 mol/L有下降趨勢(shì)，酸濃度增加對(duì)皂莢皂苷元a和皂莢皂苷元b的產(chǎn)生有抑制作用。

綜上，硫酸濃度3 mol/L、鹽酸濃度5 mol/L的工藝條件更佳。

2.2.2 最佳酸解時(shí)間的確定 選取3 mol/L的硫酸溶液或2 mol/L的鹽酸溶液以1:30的料液比，酸解溫度90℃，酸解時(shí)間為3、4、5、6 h的條件進(jìn)行酸解，氣相色譜法對(duì)酸解產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 不同時(shí)間硫酸和鹽酸酸解產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果

硫酸酸解生成皂苷元總量和皂莢皂苷元a隨著時(shí)間的增加而增加，在5 h時(shí)達(dá)到最大，6 h開始減少；生成皂莢皂苷元b隨著時(shí)間的增加而增加。鹽酸酸解生成皂莢皂苷元a隨著時(shí)間的增加而緩慢增加，整體變化不大；生成皂莢皂苷元b隨著時(shí)間的增加而減少；生成皂苷元總量隨時(shí)間增加而減少，總體變化不大。確定硫酸酸解時(shí)間5 h、鹽酸酸解時(shí)間3 h的工藝條件更佳。

2.2.3 最佳酸解溫度的確定 選用3 mol/L的硫酸溶液或2 mol/L的鹽酸溶液以1:30的料液比，酸解溫度分別為80、85、90、95℃，酸解時(shí)間為4 h的條件進(jìn)行酸解，氣相色譜法對(duì)酸解產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果如表3所示。

表3 不同溫度硫酸和鹽酸酸解產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果

隨著溫度的增加，硫酸酸解生成皂莢皂苷元含量減少，鹽酸酸解生成皂苷元總量增加。確定硫酸酸解溫度80℃、鹽酸酸解溫度95℃的條件更佳。

2.2.4 最佳酸解料液比的確定 選用3 mol/L的硫酸溶液或2 mol/L的鹽酸溶液以1:20、1:30、1:40、1:50的不同料液比，酸解溫度90℃，酸解時(shí)間4 h的條件進(jìn)行酸解，氣相色譜法對(duì)酸解產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果見表4。不同料液比酸解時(shí)，選擇硫酸料液比1:20、鹽酸料液比1:30的工藝條件更佳。

表4 不同料液比硫酸和鹽酸酸解產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

2.3 皂苷元純化工藝分析

2.3.1 皂苷元萃取劑的選擇 皂苷元在水和石油醚中幾乎不溶，在乙醇中部分溶解，二氯甲烷中幾乎全溶。加入甲醇中時(shí)有大量沉淀。乙醇在加至6 mL時(shí)皂苷元完全溶解。乙酸乙酯在加至5 mL皂苷元完全溶解。由此可知，氯代烴（氯仿、二氯甲烷等）、乙酸乙酯等可以成為皂苷元提取劑。將黑褐色皂苷元粗品加入萃取劑后，過濾。所得甲醇、乙酸乙酯濾液為均黑色溶液；二氯甲烷濾液為紅褐色溶液；三氯甲烷為黃褐色溶液；三氯乙烯為黃色溶液。因三氯乙烯溶液顏色最淺，色素含量少，且溶解效果好，最終確定萃取溶劑為三氯乙烯。

2.3.2 萃取劑用量確定 由于在液相色譜上出峰位置較為難分開，故采用氣相色譜法做初步的純化檢驗(yàn)。純化效果檢驗(yàn)采用峰面積比較法。三氯乙烯萃取所純化的含量沒有隨用量大小發(fā)生明顯的改變，結(jié)果見表5。

表5 萃取劑的用量對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量影響

從整體趨勢(shì)看，在萃取劑用量達(dá)到60 mL時(shí)已經(jīng)到極限，后續(xù)增加萃取劑用量不會(huì)增加萃取效果。

2.3.3 萃取時(shí)間的確定 萃取劑萃取時(shí)間對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量影響結(jié)果如表6所示，產(chǎn)品質(zhì)量變化為0.26～0.28 g，整體變化趨勢(shì)平緩，萃取時(shí)間對(duì)萃取效果影響不大。

表6 萃取劑的萃取時(shí)間對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量影響

2.3.4 萃取次數(shù)的確定 萃取1次后干重為0.2660 g，萃取2次后干重為0.2220g，萃取3次后干重為0.2126g。萃取次數(shù)越多，所得皂苷元越少，認(rèn)為在濾紙上損失的產(chǎn)品過多。所以三氯乙烯萃取皂苷元僅用1次萃取即可。

從單因素試驗(yàn)結(jié)果來看，萃取時(shí)間對(duì)萃取效果影響不大，從酸解產(chǎn)品中萃取用質(zhì)量體積比20倍的三氯乙烯萃取1次即可。

2.4 重結(jié)晶溶劑的選擇

利用單因素試驗(yàn)所得萃取過后的產(chǎn)品進(jìn)行重結(jié)晶的溶解性試驗(yàn)。（1）100倍甲醇50℃熱溶固體尚未完全溶解，溶劑用量過大，工業(yè)化困難，不再做考慮。（2）皂苷元幾乎不溶于正己烷，向19 mL三氯乙烯萃取液中加入3 mL正己烷，出現(xiàn)白色沉淀，靜置10 min后白色粉末結(jié)成固體，表面覆蓋一層黃色物質(zhì)，此方法需要快速過濾，對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)較為苛刻，此種方法不再做考慮。（3）加入無水乙醇20倍，固體完全溶解，逐步加水調(diào)整極性。在80%乙醇溶液時(shí)，出現(xiàn)穩(wěn)定的白色固體，當(dāng)調(diào)整到60%乙醇溶液時(shí)出現(xiàn)大量白色固體。（4）丙酮重結(jié)晶也會(huì)出現(xiàn)與乙醇相同的現(xiàn)象，但丙酮重結(jié)晶的白色粉末更為細(xì)小，在濾紙上難以存留。選擇60%乙醇作為重結(jié)晶試劑。

2.5 正交試驗(yàn)

2.5.1 皂苷酸解正交試驗(yàn) 基于皂莢皂苷酸解工藝條件的單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)及分析，選擇酸解溫度(A1=80℃，A2=85℃，A3=90℃，A4=95℃)、酸種類（B1=硫酸，B2=鹽酸）、酸濃度(C1=4 mol/L，C2=6 mol/L)和酸解時(shí)間(D1=4 h，D2=6 h)4個(gè)影響因素采用L8(27)正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表7。

表7 皂苷酸解正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

2.5.2 萃取純化正交試驗(yàn) 同上，采用L8(27)正交試驗(yàn)考察不同的酸濃度(A1=2 mol/L，A2=3 mol/L，A3=4 mol/L，A4=5 mol/L)、萃取劑種類（B1=二氯甲烷，B2=三氯乙烯）、酸種類（C1=鹽酸，C2=硫酸）、酸解時(shí)間(D1=3 h，D2=6 h)對(duì)純化效果的影響，檢驗(yàn)萃取前后產(chǎn)物含量差別。正交試驗(yàn)產(chǎn)品通過氣相色譜比對(duì)全部產(chǎn)物純化前和純化后的含量。

對(duì)表7數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析得表8。

表8 萃取純化正交試驗(yàn)方差分析

皂苷元酸解正交試驗(yàn)結(jié)果表明，C因素對(duì)結(jié)果的影響到達(dá)顯著水平，B因素接近顯著，應(yīng)控制在優(yōu)水平。A、D可以選擇任意水平，最優(yōu)水平組合為A1B2C1D1，即鹽酸濃度為4 mol/L，酸解溫度為80℃，酸解時(shí)間為4 h，料液比為1:30。

萃取純化正交試驗(yàn)結(jié)果表明，最優(yōu)水平組合為A3B2C1D1，即4 mol/L鹽酸酸解3 h，用三氯乙烯萃取。

3 結(jié)論

皂苷是一種苷類中結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的化合物，存在于許多中草藥與陸生植物中，也少量存在于海星和海參等海洋生物中。皂莢莢果中皂苷含量在30%以上，是已知的皂苷含量最高的植物。皂苷具有表面活性和多種重要的生物活性，皂苷轉(zhuǎn)化為皂苷元后，可直接用于制劑藥物，廣泛應(yīng)用于利尿、抗病毒、降血糖、防治心腦血管疾病等，也可以作為原料藥進(jìn)一步合成新藥，具有很廣闊的應(yīng)用空間[22]。本試驗(yàn)以皂莢皂苷粗品為原料，在單因素分析的前提下設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，考察酸解溫度、酸種類、酸濃度、酸解時(shí)間4個(gè)因素的影響，優(yōu)化皂莢皂苷酸解工藝參數(shù)，篩選出最佳工藝為鹽酸濃度4 mol/L，酸解時(shí)間4 h，酸解溫度80℃，料液比1:30(m:v)。通過有機(jī)溶劑萃取法和重結(jié)晶法對(duì)其酸水解后的皂苷元進(jìn)行純化，確定最佳的萃取劑為三氯乙烯，料液比為1:20(m:v)，萃取時(shí)間在90 min內(nèi)變化不大，萃取1次，采用60%乙醇重結(jié)晶，得到的總皂苷元純度可達(dá)76.31%。研究結(jié)果可為皂莢皂苷元工業(yè)化的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

4 討論

查閱相關(guān)的文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)于薯蕷皂苷元的制備研究頗多，工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)相對(duì)成熟，但是從皂莢中提取皂苷和制備皂苷元的研究較少，薯蕷皂苷元制備工藝對(duì)皂莢皂苷元的提取具有一定的借鑒意義。在有機(jī)試劑純化皂莢皂苷元的工藝優(yōu)化中，溶解性試驗(yàn)結(jié)果顯示石油醚不適合作為皂莢皂苷元的萃取劑，這與部分文獻(xiàn)[23-25]報(bào)道的石油醚提取薯蕷皂苷元結(jié)果相悖。

由于目前尚無皂莢皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品，本研究嘗試采用氣相色譜法和液相色譜法對(duì)皂莢皂苷水解產(chǎn)物進(jìn)行分析檢測(cè)，為皂苷元的結(jié)構(gòu)分析和含量檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。首先對(duì)皂莢皂苷酸解產(chǎn)物進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)，譜圖中出現(xiàn)3個(gè)隨著純化工藝改變，含量隨之出現(xiàn)增減變化的組分峰。通過DAD檢測(cè)器發(fā)現(xiàn)皂苷元產(chǎn)品在210 nm與280 nm處有紫外吸收，且210 nm處略強(qiáng)。通過與文獻(xiàn)比對(duì)，齊墩果烷類型含有環(huán)內(nèi)孤立雙鍵時(shí)在205～215 nm處有最大吸收，結(jié)構(gòu)中含有羰基在285 nm處有紫外光吸收，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[6]，判斷皂莢皂苷水解產(chǎn)物中含有齊墩果烷類型的皂苷元，其結(jié)構(gòu)中有一雙鍵、一羰基。ELSD-LC檢測(cè)重結(jié)晶脫色處理后的皂苷元產(chǎn)品，確定其中有3個(gè)皂苷元組分的液相色譜峰，為后續(xù)皂莢皂苷元的結(jié)構(gòu)確認(rèn)及含量測(cè)定方法研究提供參考。