分子診斷在甲狀腺髓樣癌術(shù)前診斷中的應用

金明月 關海霞

根據(jù)起源細胞的不同，甲狀腺癌可分為源自濾泡上皮細胞的分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid cancer,DTC)、低分化型甲狀腺癌和未分化甲狀腺癌，以及起源于濾泡旁細胞的甲狀腺髓樣癌(medullary thyroid cancer,MTC),其中DTC最常見，是近年來導致甲狀腺癌發(fā)病率大幅攀升的主要病理類型。MTC相對少見，僅占所有甲狀腺癌病例的5%左右。但與DTC相比，MTC的侵襲性更強、預后較差，診斷時通常已局部進展或轉(zhuǎn)移，可導致高達13.4%的甲狀腺癌相關死亡[1]，侵襲性病例的10年生存率低于20%[2]。術(shù)前對MTC的診斷主要是對超聲發(fā)現(xiàn)或證實的甲狀腺結(jié)節(jié)進行細針穿刺細胞學檢查(fine needle aspiration cytology，F(xiàn)NAC)和血清標志物測定等。隨著對MTC分子致病機制和基因改變的認識，以及基因組學檢測技術(shù)的快速發(fā)展，分子診斷有望在MTC術(shù)前診斷環(huán)節(jié)中扮演重要角色。

一、MTC的疾病特征

MTC的起源細胞甲狀腺濾泡旁細胞又稱C細胞，屬于胺前體攝取及脫羧化(amine precursor uptake and decarboxylation,APUD)細胞之一，具有分泌降鈣素(calcitonin,Ctn)、降鈣素基因相關肽、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)等多種肽類或活性胺類物質(zhì)的能力，因此MTC是一種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。

約75%的MTC為散發(fā)，常見于40～60歲人群，多表現(xiàn)為單個甲狀腺結(jié)節(jié)，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高發(fā)，受累的頸部淋巴結(jié)可作為疾病的首發(fā)癥狀[3]。散發(fā)MTC中一半左右的病例帶有體細胞RET基因變異[2]。另外25%的MTC是遺傳性疾病，以由胚系RET基因變異導致的2型多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤綜合征(multiple endocrine neoplasia type 2,MEN 2)為主[2]。MEN 2中，除MTC這個必備腫瘤之外，還可同時具有其他特征性的腫瘤組分和(或)病變，如嗜鉻細胞瘤、甲狀旁腺瘤、黏膜神經(jīng)纖維瘤、皮膚扁平淀粉樣變、先天性巨結(jié)腸等。MEN 2A占所有MEN 2病例的95%，典型病例發(fā)病年齡為30～40歲，包括MTC(100%發(fā)病)、嗜鉻細胞瘤(約57%發(fā)病)和甲狀旁腺瘤導致的原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(約15%～30%發(fā)病)，特殊病例僅表現(xiàn)家族性非多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤性MTC(familial MTC,FMTC)。而MEN 2B少見，中位年齡23～28歲，臨床特點表現(xiàn)為無甲狀旁腺功能亢進但伴明顯發(fā)育異常，如馬凡體型、漏斗胸、腸和口腔黏膜神經(jīng)瘤病等，胃腸道癥狀如腸梗阻常是病人就診的首發(fā)癥狀[4]。

二、MTC術(shù)前診斷環(huán)節(jié)中尚待解決的“短板”

與DTC類似，目前臨床上對MTC進行術(shù)前診斷的重要手段是超聲影像評估和FNAC[5-6]。超聲檢查雖然是甲狀腺結(jié)節(jié)和頸部淋巴結(jié)評估的首選方法，但現(xiàn)有的甲狀腺影像報告和數(shù)據(jù)系統(tǒng)(thyroid imaging reporting and data system,TI-RADS)中，提示甲狀腺結(jié)節(jié)惡性風險的征象主要針對乳頭狀甲狀腺癌，因此對MTC而言，診斷的靈敏度和特異性均有限。FNAC 作為一種快速、經(jīng)濟、安全的判別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的方法，盡管已被廣泛用于臨床實踐，但在一項納入15項研究、641例MTC病人的薈萃分析中顯示，通過FNAC確診的病例比例為56.4%(95%可信區(qū)間為52.6%～60.1%)[7]，意味著如果僅依據(jù)FNAC結(jié)果，40%的MTC可能被漏診。

基于MTC的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤特征，檢測血清標志物Ctn水平(單獨檢測或聯(lián)合CEA檢測)已被用于術(shù)前診斷。血清Ctn是MTC的主要篩查指標，基礎Ctn水平大于100 ng/L提示MTC[6]。有證據(jù)顯示，Ctn較FNAC診斷MTC的敏感性更高[8]。但是，血清Ctn水平可受到多方面因素影響，如吸煙、飲酒、服用質(zhì)子泵抑制劑等藥物、患有某些疾病(C細胞增生、慢性腎臟疾病、小細胞肺癌和胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等)[9]。血清Ctn水平處于高于正常上限但低于100 ng/L這一“灰區(qū)”時，診斷MTC的陽性預測值僅為5%，難以鑒別低體積MTC和C細胞增生等其他原因所致的Ctn升高[10]。此外，一小部分MTC病人由于病灶失分化或檢測干擾等原因，其血清Ctn水平正常或檢測不出，此時依賴Ctn會導致漏診[11]。另一個血清標志物CEA雖然與MTC侵襲性相關[12-13]，但由于其并非僅由MTC特異性產(chǎn)生，故不宜單獨用于MTC的篩查和診斷。

近年來，放射性核素功能/分子成像聯(lián)合解剖/結(jié)構(gòu)成像，特別是應用氟-18-脫氧葡萄糖(fluorine-18fluorodeoxyglucose,18F-FDG)、氟-18-二羥基苯丙氨酸(fluorine-18 dihydroxyphenylalanine,18F-FDOPA)和Ga-68標記的生長抑素類似物(68 Ga-SSA，SSA包括DOTATOC、DOTATATE、DOTANOC、DOTALAN)的正電子發(fā)射斷層顯像(positron emission tomography,PET)/計算機斷層攝影術(shù)(computed tomography,CT)技術(shù)，大大提高了發(fā)現(xiàn)MTC病灶的敏感性。但鑒于放射性藥物可及性和價格等因素，這類檢查目前主要用于定位MTC術(shù)后的復發(fā)性病變[14]。

三、分子診斷在MTC術(shù)前診斷中的作用

分子診斷的發(fā)展依賴于對MTC分子特征的認識和基因組學檢測技術(shù)的進步。目前,甲狀腺腫瘤相關的分子診斷主要聚焦在基因變異和表達水平變化，其優(yōu)點在于能夠充分利用有限的標本。出于術(shù)前診斷的目的，分子診斷針對的標本主要包括甲狀腺結(jié)節(jié)術(shù)前FNA標本和外周血液標本。

1.利用甲狀腺結(jié)節(jié)FNA標本的分子診斷有助于術(shù)前確診MTC:FNAC和血清Ctn在診斷MTC上仍有不足，利用FNA標本檢測MTC相關的分子改變可以作為診斷的補充手段，特別對于臨床疑診MTC、FNAC報告不確定細胞學結(jié)果、血清Ctn處于灰區(qū)者等，分子診斷有助于準確判別出MTC，達到早期診治和避免不必要手術(shù)的目的。

對MTC確診有幫助的分子標志物主要是RET基因變異和RAS基因變異。RET基因變異是MTC的重要分子事件。RET編碼酪氨酸激酶受體，激活突變后受體會發(fā)生結(jié)構(gòu)性激活，成為MTC腫瘤發(fā)生的主要驅(qū)動因素[15]。1993年，在遺傳性和散發(fā)性MTC中分別檢測到胚系和體細胞的RET基因激活突變[16]。約25%的MTC帶有胚系突變，38%的MTC帶有體細胞突變，意味著RET激活突變在MTC病人的甲狀腺原發(fā)灶中很常見。另一方面，甲狀腺結(jié)節(jié)中的RET激活突變?yōu)镸TC所特有，因此，若在甲狀腺結(jié)節(jié)的FNA標本中檢測到RET激活突變，則可確診為MTC原發(fā)灶。除了RET基因突變，另有15%～25%的散發(fā)性MTC攜帶體細胞RAS基因變異[15]。有研究顯示，RAS變異與RET變異互斥，17.6%的RET陰性MTC病例中存在RAS突變[17]。但RAS變異可以出現(xiàn)于各種病理類型的甲狀腺結(jié)節(jié)，對MTC診斷的特異性差，需結(jié)合是否有其他提示診斷MTC的臨床線索。

2.利用血液標本的分子診斷有助于診斷遺傳型MTC：遺傳型MTC包括MEN 2A(含經(jīng)典型、伴皮膚苔蘚淀粉樣變、伴先天性巨結(jié)腸和FMTC)和MEN 2B，均由胚系RET基因突變導致。因此，對MTC病人、在兒童或嬰兒期出現(xiàn)MEN2相關腫瘤(如甲狀旁腺瘤、嗜鉻細胞瘤等)表現(xiàn)者,皮膚苔蘚樣淀粉樣變和先天性巨結(jié)腸病人中進行RET胚系突變檢測，可以篩查出遺傳型MTC的先證者。一旦發(fā)現(xiàn)先證者，在其一級親屬中進行RET突變檢測，有助于診斷出家族中的其他MTC病人。盡管攜帶RET胚系突變基因者MTC發(fā)病年齡有早有晚，但有生之年發(fā)病率接近100%。因此，分子診斷帶來的獲益之一在于能夠早期(甚至還未出現(xiàn)明顯的甲狀腺病灶時)甄別出遺傳性MTC病人。在上述特殊人群中開展RET胚系基因突變篩查，以及在先證者一級親屬中利用分子診斷發(fā)現(xiàn)其他遺傳性MTC病人，已經(jīng)得到國內(nèi)外指南的一致推薦[5,18]。

3.利用FNA和血液標本的分子診斷有助于在診斷MTC時預判病情：(1)利用FNA標本檢測獲得的腫瘤細胞RET基因變異信息有助于預判遺傳性MTC的可能性。這是因為某些突變位點很少發(fā)生在散發(fā)性MTC中，如10號外顯子的第609和611密碼子、11號外顯子的第630密碼子、13號外顯子的第768和790密碼子、14號外顯子的第804密碼子以及15號外顯子的第904密碼子；而10號外顯子的第618和620密碼子、11號外顯子的第634密碼子、13號外顯子的第768和790密碼子、14號外顯子的第883、891密碼子以及16號外顯子的第918密碼子在遺傳性MTC和散發(fā)性MTC中均可發(fā)生[16]。(2)文獻顯示，RET胚系突變的具體位點與MEN 2臨床表型高度相關。因此，根據(jù)突變位點，有助于預判攜帶者的MTC和其他內(nèi)分泌腺體腫瘤風險。例如攜帶D631Y、C634F/G/R/S/W/Y、A883F和M918T突變均提示較高的嗜鉻細胞瘤發(fā)生風險[18]，因此對于存在以上突變的MTC病人還應進行嗜鉻細胞瘤的篩查。(3)分子診斷還有助于預估MEN 2病例的MTC惡性度。根據(jù)RET的突變位點不同可進行風險分層[5,18]：RET M918T 突變提示最高風險，C634和A883F突提示高風險，而上述位點之外的突變提示中風險。RET胚系突變基因型還與MTC的發(fā)病年齡和進展年齡有關，攜帶C630R、C634Y、M918T者的最小發(fā)病年齡依次為1歲、10個月、2個月，攜帶M918T者最小的轉(zhuǎn)移年齡為3個月[19]。一項全球48個多中心的回顧性分析報道了通過分子診斷鎖定發(fā)病早、進展早的RET 918突變MEN 2B病例并及早給予干預(1歲之內(nèi)預防性切除甲狀腺)，能夠給病人帶來生存獲益[20]。

除RET外，有研究探討了以RAS變異或其他分子標志物預判MTC嚴重程度的臨床價值。從現(xiàn)有數(shù)據(jù)可知，散發(fā)性MTC中體細胞RAS基因型與臨床表型和嚴重程度的相關性不大[17]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，另一種體細胞基因改變——細胞周期素依賴性激酶抑制劑2C(CDKN2C，即p18)缺失可能是預測MTC病情的新標志物。CDKN2C隸屬于CDKN家族，通過與CDK4或CDK6相互作用來阻止Cyclin D-CDK4/6復合物的激活，從而阻滯細胞周期。CDKN2C缺失在散發(fā)性MTC中的發(fā)生率為21%，幾乎對半分布于RET野生型和突變型病例中；MTC病人中，CDKN2C缺失者與無缺失者相比，遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生率顯著增加、生存期顯著降低，如合并RET M918T突變則生存期進一步下降，提示聯(lián)合檢測體細胞RET和CDKN2C改變可能利于更好地評估MTC病情[21]。

4.利用FNA和血液標本的分子診斷有助于在診斷MTC時預測靶向藥物：與DTC相比，MTC的侵襲性更高、預后較差，對于手術(shù)無法切除或術(shù)后出現(xiàn)復發(fā)進展的病例，靶向藥物治療可能是延長無進展生存期的希望。針對MTC的靶向藥物主要包括多靶點酪氨酸激酶抑制劑和特異性RET抑制劑。前者以凡他尼布、卡博替尼和安羅替尼為代表，藥物療效并不依賴于特定的基因變異；而后者以普拉替尼和塞爾帕替尼為代表，在攜帶RET變異的MTC病人中表現(xiàn)優(yōu)異[22-23]。因此，在診斷MTC時進行體細胞和胚系RET變異檢測能夠為未來一旦需要時選擇合適的靶向藥物做好準備。

綜上所述，以RET基因檢測為主的分子診斷在MTC的診斷中已凸顯出多方位的價值，有望在彌補現(xiàn)有診斷手段的短板、早期甄別病人、預判病情和預測靶向藥物等方面發(fā)揮重要作用。