上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化介導(dǎo)慢性阻塞性肺疾病的研究進展*

張慶柳 綜述，趙 偉，管思彬 審校

(同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院心衰?？?，上海 200120)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以持續(xù)性氣流受限為特征的常見慢性氣道炎癥性疾病，具有很高的致死、致殘率，已成為嚴重的全球性公共衛(wèi)生問題[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，2017年我國COPD現(xiàn)患人群約1億，COPD已成為我國第四大致死疾病，給患者家庭和社會均帶來了沉重的經(jīng)濟負擔[2]。

氣道重塑是COPD的重要病理生理改變，主要發(fā)生在直徑小于2 mm的小氣道內(nèi)，表現(xiàn)為氣道和肺對有害顆粒和氣體炎性反應(yīng)增加，異常修復(fù)與損傷持續(xù)進行，上皮杯狀細胞增生，基底膜增厚，膠原、纖維連接蛋白等細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積增加，最終導(dǎo)致小氣道纖維化、氣道狹窄、阻力增加。雖然目前的藥物治療、肺康復(fù)治療及外科肺減容手術(shù)等臨床治療手段在一定程度上可改善患者癥狀，但難以逆轉(zhuǎn)氣道重塑的進展。近年來，有研究表明，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)在COPD氣道重塑的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色[3]；深入研究EMT在COPD氣道重塑中的特征和機制，尋找潛在干預(yù)靶點已成為研究熱點。

1 EMT概念

EMT是指上皮細胞在生理和(或)病理條件下經(jīng)歷多種生物化學(xué)改變最終獲得間質(zhì)細胞特性的過程，表現(xiàn)為細胞緊密連接和黏附性下降或消失，細胞極性丟失，遷移和運動能力增強，獲得穿透基底膜的潛能，侵襲進入固有層[4]。在EMT過程中，上皮細胞標志物——E-鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)、緊密連接蛋白1(zonula occludens，ZO-1)等表達降低，同時間質(zhì)標志物表達增加，包括α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、波形蛋白、N-鈣黏蛋白(N-cadherin，N-cad)、纖維連接蛋白(fbronectin,FN)等[5]。

根據(jù)發(fā)生的背景及生物學(xué)行為和標志物的不同，EMT可分為3型，Ⅰ型EMT主要與胚胎發(fā)育和器官形成相關(guān)；Ⅱ型EMT主要參與創(chuàng)傷愈合、組織再生和器官纖維化過程；Ⅲ型EMT與異常增強的血管發(fā)生有關(guān)，參與上皮細胞來源的惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。這3種類型EMT的轉(zhuǎn)歸是相同的，即上皮細胞發(fā)生極化，獲得間質(zhì)細胞的特性。但與Ⅰ、Ⅲ型EMT明顯不同的是，Ⅱ型EMT的始動因素主要是炎癥和損傷[6]。在持續(xù)性炎癥和損傷作用下上皮細胞失去E-cad等標志物，脫離黏膜層，進入受損基底膜并遷移至間質(zhì)組織，獲得間質(zhì)細胞表型，分泌大量ECM，導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。

2 EMT參與COPD的氣道重塑

香煙煙霧等有害氣體/顆粒引發(fā)氣道氧化應(yīng)激和持續(xù)性炎癥，誘導(dǎo)氣道上皮組織屏障功能下降并發(fā)生EMT[7]，向成纖維細胞/肌成纖維細胞分化。轉(zhuǎn)分化的上皮細胞間黏附力下降，細胞骨架蛋白構(gòu)成改變、遷移能力增加，進一步激活相關(guān)信號通路，引發(fā)ECM過度沉積，上皮周圍纖維化，加劇COPD小氣道內(nèi)實質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞和氣流受限，最終導(dǎo)致氣道重塑進行性發(fā)展[8]。

MILARA等[9]通過分離了COPD患者小氣道原代細胞，并與對照組比較，結(jié)果顯示，上皮細胞標志物——E-cad、ZO-1、細胞角蛋白5表達均明顯降低，而間質(zhì)標志物——α-SMA、波形蛋白、CollagenⅠ表達均明顯增高。有研究也發(fā)現(xiàn)，COPD大鼠氣道纖維化程度明顯增高，E-cad表達降低，α-SMA表達增加[10]。進一步體外研究證實，在香煙煙霧刺激下，鵝卵石狀排列的支氣管上皮細胞分化為梭樣的間質(zhì)細胞形態(tài)，同樣檢測到E-cad表達降低，而間質(zhì)標志物——α-SMA表達增高。通過對小氣道上皮細胞緊密連接的基因芯片的研究發(fā)現(xiàn)，在肺功能正常的吸煙者和COPD患者氣道內(nèi)均存在E-cad向N-cad轉(zhuǎn)化，而這種鈣黏蛋白的轉(zhuǎn)換不僅早于臨床癥狀的出現(xiàn)，也是發(fā)生EMT的重要標志[11]。此外，在COPD患者肺內(nèi)也觀察到內(nèi)皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，提示氣道纖維化可能存在多重間質(zhì)細胞來源[12]。

總之，在吸煙者特別是吸煙的COPD患者氣道內(nèi)存在明顯EMT的激活，EMT是COPD小氣道增厚和纖維化的重要因素。肺功能正常的吸煙者氣道內(nèi)EMT的出現(xiàn)，提示EMT可能是香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道早期病理改變[13]。

3 EMT在COPD氣道中的作用機制

氣道上皮細胞受生長因子、炎性細胞因子、缺氧等不同信號分子刺激后相關(guān)信號通路被激活，激活下游各級轉(zhuǎn)錄因子參與EMT過程，影響其增殖、遷移及分泌等生物學(xué)行為。

3.1 轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號通路

TGF-β是一種多功能多肽類細胞因子，在器官發(fā)育、組織修復(fù)、炎癥、細胞增殖及分化等方面均發(fā)揮著重要作用。TGF-β尤其是TGF-β1被認為是促使多種上皮組織發(fā)生EMT的“開關(guān)因子”。多項研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者血清、支氣管肺泡灌洗液及肺組織中TGF-β1表達均明顯增高[14-16]。TGF-β1首先與TGF-β受體2(TGF-β receptor 2，TGF-βR2)結(jié)合并發(fā)生構(gòu)象變化，并被TGF-βR1識別結(jié)合形成三聚體，三聚體中TGF-βR1被TGF-βR2磷酸化，進一步活化細胞內(nèi)下游信號傳導(dǎo)分子——Smad2，磷酸化的Smad2(pSmad2)與Smad3形成同源寡聚體，再與Smad4結(jié)合形成異源寡聚體轉(zhuǎn)入核內(nèi)，與不同的DNA結(jié)合蛋白協(xié)同激活下游轉(zhuǎn)錄因子，如鋅指E盒結(jié)合蛋白(zinc finger E-box binding homeobox，ZEB)1、ZEB2、Snail、Slug等，進而抑制E-cad、ZO-1等緊密連接蛋白表達，上調(diào)α-SMA等靶基因表達，促進EMT的發(fā)生[17]。體外TGF-β1刺激肺上皮細胞48 h后，原本呈鵝卵石排列的細胞呈現(xiàn)間質(zhì)細胞形態(tài)，細胞間隙增加，E-cad表達明顯下降，N-cad、α-SMA表達均增加，且與TGF-βR2、TGF-βR1、pSmad2、pSmad3上調(diào)呈正相關(guān)[18]。體外研究證實，應(yīng)用TGF-βR1抑制劑——SB431542或利用小干擾RNA沉默Smad2可拮抗氣道上皮細胞EMT過程，增加E-cad表達，降低α-SMA、N-cad、波形蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)表達[19-20]。表明抑制TGF-β/Smad通路有助于減輕EMT，改善COPD氣道重塑的發(fā)展。除Smad信號通路外，TGF-β1還通過激活絲裂原活化蛋白激酶通路，如細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、p38、c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK) 家族等促進EMT的發(fā)生[21]。YANG等[22]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1體外刺激肺上皮細胞后ERK、p38磷酸化水平均明顯增高，分別抑制ERK、p38后可調(diào)節(jié)下游E-cad，使其表達增加，并降低α-SMA、波形蛋白、纖維連接蛋白表達，抑制細胞遷移，減輕EMT。

3.2 Wnt/β-聯(lián)蛋白(β-catenin)通路

Wnt是一種分泌性糖蛋白，與其膜受體——卷曲蛋白受體結(jié)合后作用于細胞內(nèi)Dishevelled蛋白，抑制糖原合成酶激酶-3活性和細胞質(zhì)中β-catenin的降解，使β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)蓄積增加，進入細胞核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子淋巴樣增強子形成復(fù)合物，激活下游目的基因——c-myc、細胞周期蛋白D1等表達誘發(fā)EMT[23-24]。體外用尼古丁刺激人支氣管上皮細胞24 h后檢測到Wnt3a表達明顯增高，且呈尼古丁劑量依賴改變，進而促使β-catenin核轉(zhuǎn)位增加，激活下游基因，增加α-SMA、波形蛋白、MMP-9、Ⅰ型膠原蛋白表達，降低E-cad水平，進一步靶向阻斷Wnt/β-catenin通路可，逆轉(zhuǎn)尼古丁誘導(dǎo)的EMT[25]。

3.3 磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素蛋白(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B/ mammalian target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR)通路

PI3K具有異二聚體結(jié)構(gòu)，活化的PI3K二聚體構(gòu)象變化，磷酸化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate,PIP2)轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇4,5-三磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate，PIP3)，PIP3與細胞內(nèi)信號蛋白——Akt、3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)結(jié)合，促使PDK1磷酸化Akt蛋白的Ser308，活化的Akt進一步激活下游靶點——mTOR，調(diào)控下游靶基因表達，在細胞增殖、分化、凋亡、極性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。有研究表明，PI3K/Akt/mTOR通路不僅促進炎癥細胞的激活，也參與了對COPD氣道重塑的調(diào)節(jié)[26-27]。CHEN等[28]用脂多糖體外誘導(dǎo)支氣管上皮細胞發(fā)生EMT，結(jié)果顯示，p-Akt、p-mTOR蛋白表達明顯上調(diào)，繼續(xù)以PI3K/Akt通路抑制劑——Ly294002干預(yù)可上調(diào)E-cad水平并降低波形蛋白、α-SMA、MMP-2、MMP-9、纖維連接蛋白表達，抑制EMT的發(fā)生。

3.4 多種微小RNA(micro RNA，miRNA)參與了EMT的調(diào)節(jié)

miRNA是一類由19～24個核苷酸組成的非編碼小分子RNA，通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合形成沉默復(fù)合體，抑制其翻譯或促進其降解，從而達到調(diào)控相關(guān)蛋白表達的作用。近年來，大量研究表明，miRNA參與了氣道EMT的反饋調(diào)節(jié)，如miR-29b在COPD患者體內(nèi)表達下調(diào)，影響細胞周期；體外研究表明，miR-29b可通過作用于一些多功能轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)肺上皮細胞增殖、遷移，并抑制其間質(zhì)標志物表達[29-30]。miR-200b-3p通過下調(diào)鋅指蛋白532、ZEB2表達，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞EMT的發(fā)生[31]。有研究發(fā)現(xiàn)，COPD小鼠肺組織miR-515-5p表達明顯降低；進一步體外試驗證實，外源性增加miR-515-5p可降低香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞間質(zhì)標志物的表達，并上調(diào)E-cad水平，這一過程與miR-515-5p直接負反饋調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白C1/Snail有關(guān)[32]。miRNA種類多，作用機制紛繁復(fù)雜，一種miRNA可通過多重機制調(diào)控機體功能，一種病理過程也可能受到多種miRNA的協(xié)同調(diào)控，COPD是多基因介導(dǎo)的疾病，未來需要更大樣本的臨床隨機對照試驗和更深入的基礎(chǔ)研究驗證。

4 小結(jié)與展望

香煙煙霧無疑是導(dǎo)致吸煙者肺內(nèi)EMT的重要“驅(qū)動力”，但戒煙本身并不能逆轉(zhuǎn)氣道中已出現(xiàn)的EMT，即使失去了最初的誘導(dǎo)刺激，EMT依然可通過一種自我延續(xù)的方式繼續(xù)進展[33-35]。EMT的終止受哪些因素控制、何種因子啟動了非吸煙COPD人群的EMT過程、COPD中EMT的具體調(diào)控機制等仍有許多未解之謎，多個信號通路的交叉協(xié)同促進了EMT的發(fā)生和進展。對于COPD而言，關(guān)鍵在于早期預(yù)防，EMT為COPD的治療開辟了新的領(lǐng)域，更深入、更系統(tǒng)的探究EMT在COPD氣道重塑中的具體作用機制，尋找關(guān)鍵靶點，對COPD的精準預(yù)防與治療具有十分重要的意義。