內(nèi)毒素耐受的分子機(jī)制及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

史慧芳，楊妍妍 綜述 盧明芹 審校

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科（溫州 325000）

內(nèi)毒素耐受（endotoxin tolerance，ET）是指細(xì)胞預(yù)先受到小劑量脂多糖（1ipopolysaccharide，LPS）刺激后，對后續(xù)致死劑量的LPS 刺激表現(xiàn)為反應(yīng)性降低甚至無反應(yīng)的現(xiàn)象。內(nèi)毒素耐受作為機(jī)體抵抗炎癥的保護(hù)性機(jī)制，可以改善發(fā)熱、缺氧和休克等癥狀，但目前對內(nèi)毒素耐受形成的具體機(jī)制尚不十分清楚。最近，已有較多關(guān)于內(nèi)毒素耐受的分子機(jī)制研究，主要集中在與LPS 相互作用的受體，以及受體后細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本文就內(nèi)毒素耐受的體內(nèi)和體外模型、Toll樣受體家族及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、表觀遺傳學(xué)及其對內(nèi)毒素耐受機(jī)制的調(diào)控與臨床應(yīng)用研究進(jìn)展做一綜述。

1 內(nèi)毒素耐受的體內(nèi)和體外模型

內(nèi)毒素耐受的體內(nèi)模型，已有鼠、豬、兔、狗、猴子、狒狒等動物模型。最常用的是通過小劑量LPS 預(yù)處理不同種類的實(shí)驗(yàn)鼠得到的。筆者所在團(tuán)隊(duì)近十余年，以0.1 μg/d LPS對小鼠進(jìn)行腹腔注射，連續(xù)5次，建立內(nèi)毒素耐受小鼠模型[1]，將50 g/mL LPS 溶于生理鹽水，以0.1 mg／（kg·d）LPS 對大鼠進(jìn)行腹腔注射，連續(xù)5 次，成功建立了內(nèi)毒素耐受大鼠模型[2-3]。在體外模型方面，主要是培養(yǎng)對內(nèi)毒素敏感的細(xì)胞，通過不同劑量LPS處理而得。單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）被認(rèn)為是內(nèi)毒素耐受體外模型的主要細(xì)胞。有研究顯示耐受的PBMC 在LPS 再刺激后TNFα和IL-1β細(xì)胞因子mRNA表達(dá)和TNFα分泌減弱[4]。內(nèi)毒素耐受還會影響其他骨髓細(xì)胞，如樹突細(xì)胞（dendritic cell，DC）和中性粒細(xì)胞，以及非免疫細(xì)胞如腸內(nèi)皮細(xì)胞。筆者所在團(tuán)隊(duì)的研究表明，與來自正常小鼠的脾臟調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞（regulatory dendritic cells，DCregs）相比，來自ET暴露小鼠的脾臟DCregs（ET-DCregs）的CD40、CD80 和MHC-II標(biāo)志物表達(dá)水平更低，對同種異體T細(xì)胞的抑制和對IL-10 和IL-12 分泌的調(diào)節(jié)更強(qiáng)。此外，脾臟ET-DCregs 中TNF-α和P65 的mRNA 和蛋白質(zhì)水平顯著低于正常小鼠脾臟的DCregs[5]。有研究發(fā)現(xiàn)骨髓源性樹突細(xì)胞（bone marrow-derived dendritic cells，BMDC）對LPS 刺激表現(xiàn)出無反應(yīng)并抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生。隨著內(nèi)毒素耐受的建立，耐受的DCs 中IRAK-M、PDL-1表達(dá)升高[6]。

2 內(nèi)毒素耐受與Toll樣受體家族及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）作為模式識別受體（pattern recognition receptor，PRRs）最重要的家族之一，在啟動固有性免疫反應(yīng)和促進(jìn)適應(yīng)性免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TLRs能夠識別微生物病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMAs），介導(dǎo)機(jī)體的固有性免疫反應(yīng)，從而誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)的發(fā)生。迄今為止，已在哺乳動物中找出了13 種不同的TLR（TLR1-TLR13），其中最重要的是TLR4 受體，它是TLRs 家族中最早被發(fā)現(xiàn)的受體。TLR在受到病原體或危險相關(guān)分子模式的刺激后，通過兩種不同的銜接子途徑介導(dǎo)信號傳導(dǎo)，即骨髓分化因子88（MyD88）和含有TIR 結(jié)構(gòu)域的銜接子誘導(dǎo)干擾素-β（TRIF）。MyD88途徑通過白介素-1受體相關(guān)激酶1（interleukin 1 receptor associated kinase1，IRAK1）和IRAK4和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）來激活NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/激活蛋白1（AP-1）信號傳導(dǎo)，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄。TRIF 通路的激活導(dǎo)致janus激酶（JAK）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）和I 型干擾素激活，并增加干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)。Xiong 等[7]發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素耐受通過抑制Lyn 和c-Src 磷酸化及其向TLR4 的募集來干擾TLR4 信號傳導(dǎo)，同時增加磷酸酶活性和PP2A、PTPN22、PTP1B 和MKP1的表達(dá)。Murphy等[8]的研究揭示了內(nèi)毒素耐受細(xì)胞中TLR4 信號重編程的機(jī)制，包括LPS 介導(dǎo)的TLR4和Mal酪氨酸磷酸化缺陷、IRAK4和TBK1的激活受損以及TLR4 信號傳導(dǎo)負(fù)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)增加，如A20、SOCS-1、SH2肌醇磷酸酶1和IRAK-M，并且發(fā)現(xiàn)Pelli?no-3b作為內(nèi)毒素耐受的重要介質(zhì)，是在MyD88-IRAK1-TAK1-TRAF6 和TRIF-TBK1 信號軸內(nèi)運(yùn)行的TLR2 和TLR4 信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子。故有理由認(rèn)為TLR4在內(nèi)毒素耐受的發(fā)生機(jī)制中具有重要作用。

3 表觀遺傳學(xué)及其對內(nèi)毒素耐受機(jī)制的調(diào)控

近年來，在有關(guān)內(nèi)毒素耐受的機(jī)制研究中，表觀遺傳學(xué)機(jī)制越來越受到重視。表觀遺傳學(xué)是指研究不涉及DNA 序列改變，而基因表達(dá)具有可遺傳特征的學(xué)科。表觀遺傳修飾則是一類可在特定時間內(nèi)不斷發(fā)揮調(diào)控效應(yīng)，在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平影響基因表達(dá)的化學(xué)修飾，主要包括DNA 甲基化、染色質(zhì)重塑、組蛋白修飾，以及長鏈非編碼RNA、微小RNA（microRNA）。

3.1 MicroRNA 與內(nèi)毒素耐受MicroRNA and endo?toxin tolerance

MicroRNA（miRNA）是由19～25個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA 分子，它通過與靶基因的3'端非翻譯區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）結(jié)合，促進(jìn)mRNA的降解或抑制mRNA 的翻譯，從而調(diào)控其靶基因的表達(dá)。在內(nèi)毒素耐受階段，兩種LPS 誘導(dǎo)型miRNA，miR-155 和miR-146a 已顯示通過單等位基因染色體間關(guān)聯(lián)、組蛋白甲基標(biāo)記的改變和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合協(xié)同調(diào)節(jié)，有助于調(diào)節(jié)內(nèi)毒素耐受[9]。miR-146a是第一個被描述為促進(jìn)內(nèi)毒素耐受的miRNA[10]。miR-146a 在巨噬細(xì)胞中TLR 激活后被誘導(dǎo)，其表達(dá)隨著LPS 再刺激而進(jìn)一步上調(diào)。然后miR-146a 靶向IRAK1 和TRAF6，這是TLR 信號下游的關(guān)鍵成分，其長期表達(dá)與內(nèi)毒素耐受和交叉耐受有關(guān)。另一方面，miR-155抑制負(fù)調(diào)節(jié)因子SHIP1 和SOCS1 的表達(dá)，增強(qiáng)TLR 信號，促進(jìn)TNFα翻譯并在巨噬細(xì)胞中建立促炎表型[11]。LI等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p 模擬物通過抑制IRAK-1 上調(diào)來拮抗巨噬細(xì)胞中ABCA1 和ABCG1 對牙齦卟啉單胞菌（Pg）-LPS或晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）刺激的失調(diào)。有研究報道m(xù)iR-155在LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的初始階段主要通過抑制TAB2蛋白翻譯作為抗炎介質(zhì)，在后期通過下調(diào)SOCS1 作為促炎介質(zhì)。同時，巨噬細(xì)胞中TAB2 3'-UTR 的過表達(dá)通過與miR-155 競爭結(jié)合促進(jìn)了內(nèi)毒素耐受的發(fā)展,這使得SOCS1蛋白的表達(dá)水平升高[13]。上調(diào)這些microRNA有助于內(nèi)毒素耐受的形成。miR-98靶向巨噬細(xì)胞中的IL-10，這是形成內(nèi)毒素耐受的關(guān)鍵細(xì)胞因子，并且miR-98 表達(dá)水平和IL-10 分泌呈負(fù)相關(guān)。LPS 刺激巨噬細(xì)胞后，miR-98 明顯下調(diào)，從而無法抑制IL-10[14]。最近的一項(xiàng)研究表明，miR-221 和miR-222被確定為內(nèi)毒素耐受期間巨噬細(xì)胞功能重編程的調(diào)節(jié)劑。在小鼠中長時間用LPS 刺激導(dǎo)致miR-221和miR-222被誘導(dǎo)，兩者均通過調(diào)節(jié)SWI/SNF（開關(guān)/蔗糖不可發(fā)酵）和STAT轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的染色質(zhì)重塑促進(jìn)炎癥基因子集的轉(zhuǎn)錄沉默，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)毒素耐受[15]。

3.2 lncRNA與內(nèi)毒素耐受

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是由大于200個核苷酸組成的非編碼RNA。lncRNA 已成為先天免疫反應(yīng)和TLR 信號傳導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)因子。其中幾種TLR 誘導(dǎo)的lncRNA通過負(fù)調(diào)節(jié)TLR信號來限制過度的炎癥反應(yīng)。THRIL 在TNFα基因的啟動子區(qū)域與hnRNPL 相互作用，誘導(dǎo)TNFα表達(dá)。然而，THRIL在TLR2觸發(fā)時下調(diào)，表明THRIL 抑制可能是控制TNFα水平和促進(jìn)交叉耐受的保護(hù)性反饋回路[16]。Mirt2 在巨噬細(xì)胞中表達(dá)并由LPS 誘導(dǎo)，負(fù)向調(diào)節(jié)TLR4 信號，Mirt2 抑制TRAF6 泛素化，從而抑制NF-κB 和MAPK 通路的激活并限制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[17]。已發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1 通過抑制NF-κB 來負(fù)向調(diào)節(jié)TLR 反應(yīng)；MALAT1 在LPS 激活的巨噬細(xì)胞中上調(diào)并與細(xì)胞核中的NF-κB相互作用，抑制LPS誘導(dǎo)的TNFα和IL-6的表達(dá)[18]。NKILA是另一種調(diào)節(jié)TLR4 信號并抑制NF-κB 激活的lncRNA；NKILA由腫瘤細(xì)胞中的LPS 誘導(dǎo)，并與NF-κB/IκB 復(fù)合物相互作用，抑制IκB 磷酸化和NF-κB 激活[19-20]。此外，NKILA 過表達(dá)還通過調(diào)節(jié)miR-21 表達(dá)來抑制NF-κB 和JNK 通路[21]。lncRNA SeT 響應(yīng)LPS 在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，其同源缺失導(dǎo)致雙等位基因TNFα表達(dá)和TNFα水平增加，表明lncRNA SeT通過調(diào)節(jié)兩個基因等位基因的同源配對并最終調(diào)節(jié)其雙等位基因模式來控制TNFα基因水平[22]。最近發(fā)現(xiàn)LncRNA DRAIC 通過與IKK復(fù)合物相互作用并抑制IKK激酶對IκBα的磷酸化作用，從而抑制NF-κB的激活[23]。

3.3 組蛋白修飾與內(nèi)毒素耐受

組蛋白修飾（histone modification）是指組蛋白在相關(guān)酶的作用下發(fā)生甲基化、乙?；?、磷酸化、腺苷酸化、泛素化等修飾的過程。RelB，SIRT1 是表觀遺傳重編程的基因特異性雙重調(diào)節(jié)因子，它不與抗炎IkBα啟動子結(jié)合，但它抑制TNF-α和IL-1β的轉(zhuǎn)錄，并激活RelB轉(zhuǎn)錄。SIRT1 在啟動子的賴氨酸310 處去乙?；疪elA/p65，以限制內(nèi)毒素耐受啟動期間促炎細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄。因此，SIRT1是協(xié)調(diào)表觀遺傳重編程，以及在急性TLR4 反應(yīng)和膿毒癥炎癥期間改變功能表型的主開關(guān)的一部分[24]。當(dāng)LPS 刺激活化RelB 基因時，組蛋白H3K9 的甲基轉(zhuǎn)移酶G9a 與其相互作用，從而抑制NF-κB 的表達(dá)[25]。有研究發(fā)現(xiàn)抑制EZH2（一種甲基轉(zhuǎn)移酶，是PRC2 的關(guān)鍵組成部分）增強(qiáng)了LPS 誘導(dǎo)的IRAK-M 表達(dá)。相比之下，UTX 是KDM6 亞家族的一種去甲基化酶，參與巨噬細(xì)胞的促炎反應(yīng)，抑制LPS誘導(dǎo)的IRAK-M 表達(dá)。當(dāng)不表達(dá)IRAK-M 時，結(jié)合在IRAK-M啟動子上的H3在初始狀態(tài)的K27處被三甲基化。LPS 刺激后，IRAK-M 啟動子上的H3K27 被去甲基化，從而允許其轉(zhuǎn)錄，這是內(nèi)毒素耐受所需的條件[26]。Wen 等[27]發(fā)現(xiàn)一種名為泛素特異性肽酶25（ubiqui?tin-specific peptidase 25，USP25）的去泛素化酶，與TRAF3 相互作用并穩(wěn)定庫普弗細(xì)胞（Kupffer cells，KCs）中的內(nèi)毒素耐受。USP25 的慢病毒敲低激活了K48連接的TRAF3泛素化和耐受KCs中MyD88相關(guān)多蛋白復(fù)合物的細(xì)胞質(zhì)易位。這一結(jié)果導(dǎo)致隨后MyD88依賴性c-Jun N 末端激酶（JNK）的激活和p38 介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子下調(diào)。TRAF3 的過表達(dá)減弱了USP25 敲低在耐受的KCs中的促炎作用。因此，當(dāng)機(jī)體受到LPS刺激后，可通過不同的組蛋白修飾方式來調(diào)控基因表達(dá)，使促炎因子釋放受抑制，從而促進(jìn)內(nèi)毒素耐受的形成。

4 內(nèi)毒素耐受相關(guān)疾病及臨床應(yīng)用

據(jù)報道，內(nèi)毒素耐受現(xiàn)象不僅見于膿毒癥、SIRS、胰腺炎等感染性疾病，還見于外傷、糖尿病、肝缺血再灌注損傷、囊性纖維化和癌癥等非感染性疾病[28]。近年來,有關(guān)內(nèi)毒素耐受的部分機(jī)制已被揭示,但對其確切機(jī)制仍不十分清楚,而實(shí)驗(yàn)研究得出的部分結(jié)論與臨床結(jié)果又相互沖突,使研究者必須重新回到臨床上去證明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃浴?/p>

4.1 膿毒癥

膿毒癥是一種由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征。膿毒癥期間的一個主要內(nèi)毒素耐受標(biāo)志是單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞無法加強(qiáng)適應(yīng)性反應(yīng)，這可能是膿毒癥期間進(jìn)化不良的原因。內(nèi)毒素耐受狀態(tài)下，來自膿毒癥患者的血液單核細(xì)胞通過誘導(dǎo)HIF1α而在其細(xì)胞表面表達(dá)高水平的PD-L1，并控制內(nèi)毒素耐受期間T 細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)受損[29]。內(nèi)毒素耐受期間，與HLA-DR表達(dá)降低相關(guān)的抗原呈遞減少。此外，來自膿毒癥患者的血液單核細(xì)胞在受到LPS 刺激后，促炎細(xì)胞因子TNF、IL-1、IL-6 和IL-12 分泌減少。與單核細(xì)胞內(nèi)毒素耐受相似，自然殺傷細(xì)胞（natural killer，NK）對TLR 激動劑的體外IFN-γ產(chǎn)生減少。這一觀察結(jié)果表明，NK 細(xì)胞耐受性可能是潛伏病毒（如CMV）重新激活的原因，常在危重患者群體中被提及，并且可能作為治療干預(yù)的潛在目標(biāo)[30]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥免疫抑制中的T細(xì)胞功能障礙可能是由于DCs無反應(yīng)和IRAK-M表達(dá)上調(diào)，因此可作為DCs治療膿毒癥免疫抑制的治療靶點(diǎn)[6]。

4.2 急性肝衰竭

急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）是多種因素導(dǎo)致的肝臟嚴(yán)重受損，會在短時間內(nèi)發(fā)生凝血障礙和肝性腦病，并誘發(fā)涉及多器官的全身炎癥。Li等[31]的實(shí)驗(yàn)顯示在二乙基亞硝胺（DEN）刺激的情況下，可觀察到P38、ERK1/2、JNK 和NF-κB 的磷酸化增加，以及產(chǎn)生TNF-α和IL-1β，而在LPS 預(yù)處理DEN 模型中這些激活受到抑制。LPS 預(yù)處理減少了DEN 誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，表明LPS 預(yù)處理通過誘導(dǎo)肝臟“內(nèi)毒素耐受”來預(yù)防DEN誘導(dǎo)的急性肝損傷。筆者所在團(tuán)隊(duì)通過向大鼠注射D-半乳糖胺（D-GalN）/LPS 來誘發(fā)急性肝衰竭，LPS預(yù)處理能夠顯著降低D-GalN/LPS治療大鼠的血清TNF-α和IL-6 水平，LPS 預(yù)處理顯著提高了大鼠存活率，并明顯減輕了大鼠肝臟組織病理學(xué)損傷，其機(jī)制可能與LPS 預(yù)處理通過TLR4 途徑抑制炎性細(xì)胞因子如NF-κB 和IRAK-1 產(chǎn)生有關(guān)[3，32]。LPS 預(yù)處理還通過負(fù)調(diào)控JAK2/STAT1 通路，轉(zhuǎn)導(dǎo)SOCS1 基因的DC 表現(xiàn)為DCregs，并通過抑制TLR4 通路來改善D-GalN/LPS 誘導(dǎo)的急性肝衰竭[33]。

4.3 癌癥

慢性淋巴細(xì)胞白血病（chronic lymphocytic leuke?mia，CLL）是西方國家血液腫瘤死亡的主要原因。當(dāng)CLL 患者的單核細(xì)胞在體外受到LPS 刺激時，它們表現(xiàn)出內(nèi)毒素耐受特征，包括炎癥因子產(chǎn)生減少、吞噬活性增強(qiáng)和抗原呈遞受損。研究發(fā)現(xiàn)miR-146a參與了這種現(xiàn)象，并發(fā)現(xiàn)IRAK1和TRAF6明顯下調(diào)[34]。與內(nèi)毒素耐受現(xiàn)象相似的還有“腫瘤耐受”，通過LC3 相關(guān)的吞噬作用（LAP）吞噬垂死細(xì)胞解釋了腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的抗炎極化，從而抑制T細(xì)胞功能，并且促進(jìn)了腫瘤耐受[35]。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞不能表達(dá)共刺激分子，因此可以在沒有共刺激的情況下通過與T細(xì)胞受體結(jié)合來誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受。已知腫瘤通過TGF-β和IL-10依賴的方式將平衡從Th1 轉(zhuǎn)移到Th2（免疫偏差）來逃避免疫攻擊。因此，促進(jìn)耐受和免疫偏差的事件是導(dǎo)致癌癥免疫逃避的重要因素[35]。

4.4 囊性纖維化

囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）是一種由囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）突變引起的常染色體隱性遺傳性疾病。CF 患者的感染與其并發(fā)癥有關(guān)，慢性下呼吸道細(xì)菌定植會使患者死亡率增加。有研究表明銅綠假單胞菌是CF 患者中最常見的革蘭氏陰性細(xì)菌病原體。在銅綠假單胞菌定植的CF患者上易位LPS會導(dǎo)致PD-L1 過表達(dá)并產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受現(xiàn)象[36]。CF 患者反復(fù)發(fā)生感染會使肺組織逐漸惡化、肺功能下降，并最終導(dǎo)致90%的CF患者死于呼吸衰竭。用LPS預(yù)處理CF患者的單核細(xì)胞后，IL 表達(dá)模式改變、抗原呈遞能力減弱、吞噬能力增強(qiáng)，并且CF 患者的血漿LPS 濃度顯著高于健康人，這有利于形成內(nèi)毒素耐受。循環(huán)LPS可能是CF患者表現(xiàn)出的內(nèi)毒素耐受等級的標(biāo)志，并且可能為CF患者的全身感染尋找出新的臨床策略[37]。

5 小結(jié)與啟示

內(nèi)毒素耐受是一個涉及多個細(xì)胞信號通路、受體改變和生物分子的復(fù)雜病理生理過程，是機(jī)體對抗過度炎癥反應(yīng)時產(chǎn)生的一種保護(hù)性機(jī)制，同時又與多種疾病的繼發(fā)感染、患者病死率相關(guān)，更好地理解內(nèi)毒素耐受的保護(hù)和調(diào)節(jié)機(jī)制，對各種相關(guān)疾病的臨床治療具有重要啟迪與價值。雖然目前關(guān)于內(nèi)毒素耐受的機(jī)制已有很多研究，但確切機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。

（利益沖突：無）