環(huán)狀RNA與支氣管哮喘相關(guān)性研究

楊賢苗，錢粉紅

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212000

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類新近發(fā)現(xiàn)有重要作用的共價(jià)閉合環(huán)狀非編碼RNA。最初被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄過(guò)程中異常剪接的副產(chǎn)品。2013年發(fā)表在《自然》雜志上的一篇文章提出，circRNA 可以充當(dāng)微小RNA（microRNA，miRNA）海綿發(fā)揮重要的作用，從此circRNA 成為非編碼RNA 領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［1］。circRNA參與許多疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，在腫瘤領(lǐng)域的研究相對(duì)集中［2］。支氣管哮喘簡(jiǎn)稱哮喘，是由多種細(xì)胞及其組分參與的慢性氣道炎癥，目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確。相關(guān)研究指出circRNA在先天免疫、炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用［3-4］。本文結(jié)合circRNA 領(lǐng)域最新研究成果，就其與哮喘的密切關(guān)系作一綜述。

1 circRNA概述

1.1 circRNA的主要特點(diǎn)和分類

circRNA 是一類特殊的非編碼RNA 分子，與傳統(tǒng)的線性RNA（含5′帽結(jié)構(gòu)及3′多聚腺苷酸尾結(jié)構(gòu)）不同，circRNA 將5′和3′末端共價(jià)連接呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使其不易被核苷酸外切酶降解，在細(xì)胞中穩(wěn)定存在，表達(dá)豐富，具有進(jìn)化的保守性及組織特異性［5-8］。circRNA 主要有以下4 種亞型：外顯子circRNA（ecircRNA）、內(nèi)含子circRNA（ciRNA）、外顯子-內(nèi)含子circRNA（EIciRNA）以及其他非經(jīng)典的circRNA，如tRNA 內(nèi)含子circRNA（tricRNA）、病毒circRNA等。

1.2 circRNA的生物學(xué)功能

circRNA 的細(xì)胞定位在一定程度上決定其行使的功能。ciRNA、EIciRNA 主要位于細(xì)胞核內(nèi)，能與RNA聚合酶等相互作用，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［9］。主要分布于細(xì)胞質(zhì)的ecircRNA，其可能來(lái)自細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的定向運(yùn)輸，也可能來(lái)源于核膜破裂時(shí)的主動(dòng)逃逸，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)。circRNA通過(guò)與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合，在一定程度上影響線性RNA的生成和功能，也可通過(guò)充當(dāng)?shù)鞍组g的支架，調(diào)節(jié)蛋白的修飾和降解，調(diào)節(jié)下游細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［10-11］。同時(shí)，蛋白質(zhì)因子能夠誘導(dǎo)特定circRNA 的環(huán)化，發(fā)揮穩(wěn)定剪接序列和抑制典型的線性剪接的雙重作用［2］。此外，circRNA 雖為非編碼RNA，但部分circRNA 也能夠被翻譯成短肽［12］。人類circRNA 中N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾可以驅(qū)動(dòng)翻譯，且有數(shù)百個(gè)內(nèi)源性circRNA具有翻譯潛能［13］。目前越來(lái)越多證據(jù)表明circRNA參與哮喘發(fā)病的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，從而影響哮喘的一系列病理生理過(guò)程。

2 circRNA與哮喘的相關(guān)性研究

2.1 circRNA與先天免疫

先天免疫細(xì)胞如先天性淋巴樣細(xì)胞（ILC）和樹突狀細(xì)胞（DC）在受到致敏原刺激后募集到肺部，引起肺部炎癥以及免疫異常是化學(xué)性哮喘的發(fā)病機(jī)制之一。circSnx5 能減輕miR-544 介導(dǎo)的負(fù)向調(diào)控SOCS1 及PU.1 的核轉(zhuǎn)運(yùn)作用，調(diào)控DC 的激活以及免疫原性［14］。巨噬細(xì)胞能夠通過(guò)釋放炎性介質(zhì)以及與其他細(xì)胞相互作用來(lái)參與氣道炎癥。有研究報(bào)道［15-16］，circRNA 可能參與巨噬細(xì)胞的活化及免疫應(yīng)答。關(guān)于circRNA 調(diào)控先天免疫目前有以下兩種機(jī)制。雙鏈RNA 依賴的蛋白質(zhì)激酶（doublestranded RNA-dependent protein kinase，PKR）是細(xì)胞經(jīng)干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種蛋白激酶，有較為保守的雙鏈RNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在雙鏈RNA 的激活下可阻止蛋白質(zhì)合成，抑制病毒的復(fù)制和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。而76%的circRNA 能夠在細(xì)胞中形成16～26 bp的雙鏈RNA。這種較短的雙鏈RNA 與PKR 結(jié)合后，可以阻斷PKR 的激活，從而抑制先天免疫反應(yīng)［3］。Chen 等［17］提出，外源性circRNA 可以充當(dāng)抗原誘導(dǎo)體內(nèi)抗原特異性T 細(xì)胞活化、抗體產(chǎn)生和抗腫瘤免疫。m6A 修飾可以降低外源性circRNA 的免疫原性，從而抑制先天免疫。先天免疫的損傷與干擾素的釋放以及抗病毒反應(yīng)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)1 型、3 型干擾素的缺失與下呼吸道病毒感染是兒童哮喘發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素［18］。哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，輔助性T 細(xì)胞亞群功能紊亂是哮喘免疫異常的重要機(jī)制，這種病原體與宿主的相互作用可能激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)導(dǎo)致Th1/Th2 失衡以及Treg/Th17 失衡，從而參與哮喘的發(fā)生發(fā)展［19］。上述兩種circRNA 對(duì)先天免疫的調(diào)控機(jī)制提示了circRNA可能在機(jī)體對(duì)外界刺激做出先天免疫應(yīng)答中具有重要的作用。那么從circRNA 水平出發(fā)，通過(guò)調(diào)控circRNA表達(dá)以及表觀遺傳修飾可能提高機(jī)體先天免疫的能力，從而規(guī)避哮喘發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)防哮喘的發(fā)生發(fā)展。

2.2 circRNA與環(huán)境因素

哮喘的發(fā)病是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。環(huán)境因素的刺激可導(dǎo)致表觀遺傳學(xué)的改變，從而影響某些基因的激活［20］。在與空氣直接接觸的氣道上皮中存在許多哮喘易感基因，其中支氣管上皮在哮喘的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子可以降低哮喘患者支氣管上皮細(xì)胞連接的完整性［21］，使上皮細(xì)胞的屏障功能被破壞，在受到過(guò)敏原、空氣污染物以及病原微生物等刺激時(shí)，支氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和異常的修復(fù)反應(yīng)是哮喘氣道高反應(yīng)性和氣道重塑的重要機(jī)制［22］。研究表明空氣中PM2.5 濃度升高，可加重哮喘患者喘息和呼吸困難的癥狀，但其具體的機(jī)制尚不明確［23］。Jia 等［24］研究發(fā)現(xiàn)circRNA406961 在PM2.5介導(dǎo)的支氣管上皮炎癥反應(yīng)中可能與白介素增強(qiáng)子結(jié)合因子相互作用，通過(guò)激活STST3/JNK 通路下調(diào)炎癥因子白介素（interleukin，IL）-6及IL-8的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抑制炎癥的作用。薛海南等［25］研究發(fā)現(xiàn)稀土氧化釹染毒組的人支氣管上皮細(xì)胞（human bronchial epithelial cell，16HBE）分泌的炎癥因子較對(duì)照組明顯增高，對(duì)80 μg/mL處理組的細(xì)胞微陣列RNA 測(cè)序結(jié)果顯示有1 263 種circRNA 差異性表達(dá)。選取5 個(gè)上調(diào)和5 個(gè)下調(diào)的circRNA 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證結(jié)果與芯片的趨勢(shì)一致。其中下調(diào)趨勢(shì)最明顯的hsa_circRNA_0080083 與氧化釹的濃度呈線性負(fù)相關(guān)。Hua 等［26］研究了circRNA 0039411在稀土氧化釹介導(dǎo)的16HBE炎癥反應(yīng)和功能障礙中的作用和機(jī)制。circRNA 0039411 可以充當(dāng)miR-93-5p的海綿，通過(guò)miR-93-5p/STAT3通路來(lái)調(diào)節(jié)炎癥因子IL-6和IL-8的表達(dá)水平以及影響上皮細(xì)胞周期來(lái)調(diào)控上皮細(xì)胞的增殖。同時(shí)，用二氧化鈦處理16HBE對(duì)circRNA 0039411的表達(dá)并無(wú)明顯影響。circRNA與支氣管上皮的炎癥有一定的相關(guān)性，在不同的刺激原作用下，circRNA可能存在特異性的表達(dá)，不同的circRNA 對(duì)支氣管上皮炎癥反應(yīng)發(fā)揮促進(jìn)或者抑制的不同作用，circRNA 有望成為反映支氣管上皮炎癥及其嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物。

2.3 circRNA與miRNA網(wǎng)絡(luò)

近年來(lái)miRNA 在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制較為明確。miRNA是一種長(zhǎng)度約20～25個(gè)核苷酸的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，與靶基因mRNA的3′-UTR區(qū)域堿基互補(bǔ)配對(duì)，進(jìn)而抑制靶基因的表達(dá)［27］。許多研究表明miRNA與哮喘關(guān)系密切，可作為哮喘的診斷指標(biāo)，也可預(yù)測(cè)哮喘的嚴(yán)重程度，例如miRNA-21通過(guò)靶向10號(hào)染色體上的磷酸酶和張力素同源物抑制PI3K-AKT 通路，促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞增殖，參與氣道重塑，同時(shí)血清中miRNA-21表達(dá)水平對(duì)類固醇敏感和類固醇抵抗型兒童哮喘的鑒別具有預(yù)測(cè)價(jià)值。miRNA-155 和let-7miRNA 有助于兒童哮喘的診斷及嚴(yán)重程度的預(yù)測(cè)等［28-32］。部分非編碼RNA 能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性與miRNA 結(jié)合形成miRNA反應(yīng)元件，從而減弱miRNA對(duì)靶基因的負(fù)性調(diào)控，也稱ceRNA機(jī)制［33-35］。目前，關(guān)于circRNA在哮喘中的直接研究較少，但是上述很多研究表明circRNA 可能通過(guò)ceRNA 機(jī)制參與哮喘的發(fā)生發(fā)展。發(fā)揮這類競(jìng)爭(zhēng)性交互作用的circRNA 大多為ecircRNA，它由一個(gè)或多個(gè)外顯子環(huán)化而成，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有一定豐度且穩(wěn)定存在，具有物種保守性及組織特異性，但具有miRNA結(jié)合位點(diǎn)的ecircRNA只占少數(shù)，并且只有當(dāng)ecircRNA與miRNA的表達(dá)水平處于近似數(shù)量級(jí)時(shí)，這種競(jìng)爭(zhēng)性的交互作用才不會(huì)被弱化［36］。由屋塵螨誘導(dǎo)構(gòu)建的哮喘小鼠模型中鑒定了280個(gè)差異表達(dá)的circRNA，利用miRanda算法預(yù)測(cè)構(gòu)建circRNA-miRNA 互作網(wǎng)絡(luò)，提示差異表達(dá)的circRNA 可能與miRNA 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，通過(guò)“自身免疫性疾病”“細(xì)胞黏附分子”和“吞噬作用”等過(guò)程參與哮喘的發(fā)生［37］。Shang等［38］研究發(fā)現(xiàn)用脂多糖處理的巨噬細(xì)胞與脂肪源性干細(xì)胞分泌的外泌體共培養(yǎng)，過(guò)表達(dá)mmu_circ_0001359 可以通過(guò)海綿miR-183-5p 靶向FoxO1 轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制氣道炎癥反應(yīng)，減輕氣道重塑。circHIPK3能夠作為miR-326的海綿，靶向基質(zhì)相互作用分子1（stromal interaction molecule 1，STIM1）調(diào)節(jié)氣道平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡參與哮喘的氣道重塑［39］。Huang等［40］對(duì)哮喘患者CD4+T細(xì)胞進(jìn)行微陣列分析發(fā)現(xiàn)了有597 個(gè)差異表達(dá)的circRNA，hsa_circ_0005519 在哮喘患者CD4+T 細(xì)胞中上調(diào)變化≥3.7倍。隨后另一個(gè)樣本中通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)、干擾等方法發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005519 可以通過(guò)海綿吸附hsa-let-7a-5p來(lái)上調(diào)IL-6和IL-13的表達(dá)。該研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者CD4+T 細(xì)胞中高表達(dá)的hsa_circ_0005519 與較高水平的呼出氣一氧化氮（fractional exhaled nitric oxide，F(xiàn)eNO）、外周血嗜酸性粒細(xì)胞比例相關(guān)。hsa_circ_0002594 在哮喘患者CD4+T 細(xì)胞中高表達(dá)，且在有哮喘高危因素的人群中有相對(duì)更高的表達(dá)，經(jīng)皮質(zhì)類固醇激素治療后hsa_circ_0002594 表達(dá)降低［41］。上述研究表明circRNA可能成為哮喘診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物。在很大程度上circRNA在哮喘發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用還不明確，大樣本的驗(yàn)證研究相對(duì)較少。但隨著高通量技術(shù)及生物信息學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，以ceRNA 機(jī)制作為理論依據(jù)構(gòu)建circRNA-miRNA互作網(wǎng)絡(luò)也許可以為哮喘表觀遺傳學(xué)研究提供更清晰、有脈絡(luò)的參考。

3 總結(jié)與展望

circRNA 在真核生物體內(nèi)廣泛穩(wěn)定存在且保守性較高，其在骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病等慢性炎癥性疾病中發(fā)揮著重要的作用［42-44］。目前許多研究表明circRNA 參與了哮喘的發(fā)病過(guò)程，如調(diào)控免疫反應(yīng)、支氣管上皮炎癥反應(yīng)以及氣道重塑過(guò)程等，對(duì)哮喘的預(yù)防、診斷、治療均有重要意義，但目前尚缺乏相關(guān)的臨床研究評(píng)估circRNA 與哮喘患者臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性。circRNA 通過(guò)海綿吸附miRNA 調(diào)控靶基因的表達(dá)只是其發(fā)揮作用的一種機(jī)制，circRNA 的其他生物學(xué)功能是否參與哮喘的發(fā)病仍需更多針對(duì)性的研究。隨著不斷深入地研究，circRNA 有望成為哮喘診斷標(biāo)志物及治療的新靶點(diǎn)。