芹菜素對一氧化碳中毒致神經(jīng)元凋亡的影響?

白美玲，劉星亮，焦 宏△

(1.河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北 張家口 075000)

芹菜有水芹、旱芹兩種，功能相近。中醫(yī)認(rèn)為藥用以旱芹為佳，又稱藥芹。旱芹得青陽之氣而生，氣味辛竄，能理胃中濕濁。旱芹氣味甘寒，能除心下煩熱。或有得于陽氣之微，故味苦而多濕；得于陽氣之濃，故味多辛而燥[1]。芹菜中分離純化的活性成分以芹菜素為高[2]。芹菜素(Apigenin)又名芹黃素，是一種可以從多種中草藥和食物中提取的黃酮類化合物。有研究表明，芹菜素在抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥等方面療效顯著[3]。近年來，芹菜素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中對神經(jīng)細(xì)胞的保護功效受到學(xué)者們的關(guān)注[4]。

一氧化碳(carbon monoxide, CO)中毒是較為常見的中毒事件，由于CO占據(jù)氧氣與血紅蛋白結(jié)合位點，間接引起人體缺氧而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多器官受損，出現(xiàn)嗜睡、昏迷、神經(jīng)官能癥等神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀和體征[5，6]，而CO中毒引發(fā)的缺血缺氧又可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族蛋白與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

本實驗通過建立體外CO中毒的神經(jīng)元模型，以實驗常用的神經(jīng)元模型[7]，即大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞為靶點，通過外源性一氧化碳釋放分子(carbon monoxide releasing molecules, CORM-2)對PC12細(xì)胞作用，檢測芹菜素對CO中毒后神經(jīng)元凋亡情況及相關(guān)凋亡蛋白Caspase-3、BCL2-Associated X的蛋白質(zhì)(BCL2-Associated X, Bax)和Bcl-2含量，探討芹菜素對CO引起的細(xì)胞凋亡的影響，為臨床CO中毒患者的治療和預(yù)后康復(fù)提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞(高分化型)由我校藥學(xué)系老師惠贈，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細(xì)胞庫。CORM-2(美國Sigma公司288144-500 MG)；芹菜素(陜西慧科植物開發(fā)有限公司，CAS：520-36-5)；兔抗鼠Caspase-3單克隆抗體(sc-56051)、Bax單克隆抗體(sc-7480)和Bcl-2單克隆抗體(sc-7382)，美國Santa Cruz公司；細(xì)胞早期凋亡檢測試劑盒(559763)，美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與模型建立

PC12細(xì)胞中加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2孵育箱進行培養(yǎng)。待細(xì)胞覆蓋率達90%左右時，常規(guī)胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行下一步實驗。

收集PC12細(xì)胞后計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度，以2.5×104個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔100 μL，每組設(shè)平行復(fù)孔6個。分別以50 μM、100 μM和200 μM的CORM-2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞2 h和4 h，建立外源性CO中毒神經(jīng)元模型。

1.3 MTT實驗檢測細(xì)胞存活率和細(xì)胞分組

選擇490 nm波長，在全自動熒光酶標(biāo)儀上檢測各孔的吸光度(optical density, OD)值。通過下列公式計算各組細(xì)胞生長抑制率：生長抑制率(%)=(實驗組OD值-對照組OD值)/對照組OD值×100﹪。MTT實驗通過細(xì)胞活性和半數(shù)致死量來確定CORM-2最佳誘導(dǎo)濃度并確定分組。本次實驗分為Control組(常規(guī)培養(yǎng)PC12細(xì)胞)、CORM-2組(最佳誘導(dǎo)濃度)、低劑量芹菜素干預(yù)組(CORM-2+5 μM芹菜素)和高劑量芹菜素干預(yù)組(CORM-2+20 μM高濃度芹菜素)4組。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

收集4 h作用的各組細(xì)胞1×106個，離心后棄去培養(yǎng)基，采用1 mL PBS緩沖液洗滌2遍，按照試劑盒說明依次向每組細(xì)胞中分別加入185 μL緩沖液，5 μL Annexin V及10 μL 碘化丙啶(propidium iodide, PI)，混勻避光20 min。離心并棄去上清液，再加入1 mL PBS洗滌1次。1 mL PBS緩沖液懸起細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期凋亡情況。

1.5 Western blot檢測凋亡蛋白含量

各組加入蛋白裂解液提取總蛋白，用Bio-Rad蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉分別加入兔抗鼠Caspase-3單克隆抗體(稀釋度為1∶1000)、Bax單克隆抗體(稀釋度為1∶1000)和Bcl-2單克隆抗體(稀釋度為1∶1000)，4 ℃過夜。清洗后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，加 3,3-N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride(DAB)顯色。顯影后照相，圖像分析軟件Image J進行定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析，2組均數(shù)比較采用t檢驗，多組資料統(tǒng)計采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外PC12細(xì)胞CO中毒模型的建立與最佳作用濃度篩選

PC12細(xì)胞分別于2 h和4 h經(jīng)50、100和200 μM濃度的CORM-2誘導(dǎo)后，利用MTT法測定細(xì)胞活性。圖1示，相同誘導(dǎo)時間下細(xì)胞活力隨CORM-2濃度的增高而逐漸下降，確定100 μM CORM-2誘導(dǎo)4 h為CO中毒細(xì)胞模型最佳作用濃度和最佳作用時間，作為后續(xù)實驗CORM-2組。

圖1 MTT法檢測CORM-2誘導(dǎo)下PC12的細(xì)胞活性率

2.2 各組PC12細(xì)胞凋亡檢測

采用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC和PI雙染檢測細(xì)胞早期凋亡率。Control組細(xì)胞凋亡率為2.21%，CORM-2誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡率急劇上升至29.49%；加入5 μM芹菜素干預(yù)后，細(xì)胞凋亡率下降至8.28%，與CORM-2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，以上結(jié)果說明，芹菜素能有效抑制CORM-2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

2.3 各組PC12細(xì)胞凋亡蛋白的表達

圖3示，CORM-2組Caspase-3表達明顯高于Control組(P<0.05)，低劑量芹菜素干預(yù)組和高劑量芹菜素干預(yù)組Caspase-3表達均明顯低于CORM-2組(P<0.05)。Control組Bax表達水平顯著低于CORM-2組(P<0.05)，低劑量芹菜素干預(yù)組的Bax表達明顯低于CORM-2組(P<0.05)。CORM-2組Bcl-2表達明顯高于Control組(P<0.05)，低劑量芹菜素干預(yù)組和高劑量芹菜素干預(yù)組Bcl-2表達水平均顯著高于CORM-2組(P<0.05)。結(jié)果表明，芹菜素可以通過下調(diào)Caspase-3及Bax，上調(diào)Bcl的表達，減緩PC12的細(xì)胞凋亡過程。

注：L-Api為低濃度芹菜素干預(yù)組, H-Api為高濃度芹菜素干預(yù)組

注：C表示Control組，L-Api為低濃度芹菜素干預(yù)組，H-Api組為高濃度芹菜素干預(yù)

3 討論

腦組織尤其神經(jīng)元對缺血缺氧最不耐受[8]，其次是膠質(zhì)細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞耐受力最佳[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，CO中毒死亡者尸檢結(jié)果中，大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元有不同程度凋亡[10]，表明CO中毒所致的嗜睡、昏迷等臨床表現(xiàn)與神經(jīng)元的凋亡可能有很大的相關(guān)性。而CO中毒所引發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷表現(xiàn)出的臨床癥狀屬于中醫(yī)學(xué)“頭痛”“健忘”“癡呆”等范疇。有學(xué)者根據(jù)中醫(yī)辨病辨證方法，將CO中毒的機理病因病機和相應(yīng)臨床癥狀解釋為CO穢濁毒氣由肺而入，毒邪入內(nèi)耗散正氣，毒邪生熱化痰，痰瘀互結(jié)，上蒙清竅，氣滯血瘀，痰濁阻滯，竅絡(luò)閉阻[11]。

臨床對于CO中毒患者以高壓氧治療為主，但起效較慢[12]。學(xué)者們正在探究用安全高效的中草藥或某些植物的活性成分進行輔助治療，以減緩神經(jīng)元凋亡，增強高壓氧療效，減輕患者中毒癥狀，提升患者的生活質(zhì)量。

芹菜作為一種藥食同源的原料，性涼、味甘辛且無毒，入肺、胃、肝經(jīng)，可清熱利濕、平肝健胃、除煩消腫、涼血止血、解毒宣肺、健腦鎮(zhèn)靜?！侗静菥V目》云：“旱芹，其性滑利。”《衛(wèi)生通訊》載芹菜“清胃滌熱，通利血脈，利口齒潤喉，明目通鼻，醒腦健胃，潤肺止咳”。《本草推陳》載芹菜“治肝陽頭痛，面紅目赤，頭重腳輕，步行飄搖等癥”[13]。芹菜中以活性成分芹菜素含量為高，芹菜素分子式為C15H10O6，相對分子量270屬于4’,5,7-三羥基黃酮，是一種藥食同源的活性化合物，廣泛存在于芹菜、毛葉藜蘆等植物以及日常多種豆類、茶葉等食物中[14]。有研究顯示，芹菜素具有降血壓、抗癌、降血脂、保護神經(jīng)元等活性作用，其用藥安全性高[15]。

近年來學(xué)者們通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)，芹菜素對神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括脊髓損傷、神經(jīng)退行性疾病、失眠及抑郁等神經(jīng)官能癥均有一定的治療效果[16，17]。有報道，芹菜素可通過血腦屏障進入腦組織中，發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡作用，通過減緩氧化應(yīng)激反應(yīng)，在一定程度上恢復(fù)或改善大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能的缺失，減輕神經(jīng)元凋亡，有效保護神經(jīng)元活力[18]。在一項阿爾茨海默病的臨床研究中[19]，通過對患者進行兩年的觀察和隨訪后發(fā)現(xiàn)，長期服用芹菜素復(fù)方制劑的患者認(rèn)知評分明顯高于未服用者，說明芹菜素在一定程度上能有效改善阿爾茨海默病患者的臨床癥狀，促進患者康復(fù)。此外也有臨床報道證實，芹菜素在改善失眠、調(diào)節(jié)人體生物節(jié)律等方面有重要功效[20]。

動物實驗也證實，芹菜素對神經(jīng)元損傷有治療效果，其機制與芹菜素調(diào)控氧化應(yīng)激和促凋亡方面有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，服用芹菜素在抗抑郁及改善小鼠認(rèn)知能力等方面有顯著作用[21]。此外，芹菜素在帕金森病轉(zhuǎn)基因果蠅模型中，也表現(xiàn)出抑制氧化應(yīng)激、減緩細(xì)胞凋亡的作用[22]。通過阻斷Ca2+的細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑，減少促凋亡蛋白caspase-3和caspase-7的釋放，可抑制神經(jīng)元凋亡，保護神經(jīng)元的活性和穩(wěn)定性[23]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，芹菜素能有效降低CORM-2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡率,提示芹菜素可通過對減緩抗神經(jīng)元凋亡來降低CO對神經(jīng)元造成的損傷。細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡的過程，是由一些病理因素刺激細(xì)胞引發(fā)凋亡通路的激活、表達和調(diào)控的一系列生化反應(yīng)。大多數(shù)凋亡的啟動、激活與調(diào)控都與Bcl-2家族和Caspase家族有關(guān)[24]。Caspase家族可以通過細(xì)胞內(nèi)通路(線粒體途徑)、細(xì)胞外通路(細(xì)胞膜途徑)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路等激活細(xì)胞凋亡[25]。有研究顯示，Caspase的激活是包括一系列生化反應(yīng)，凋亡的啟動因子與信號蛋白結(jié)合后激活引起線粒體功能障礙，導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體釋放入細(xì)胞胞漿并與胞漿中的凋亡蛋白酶激活因子1聚合成為復(fù)合體，這種多聚復(fù)合物激活Caspase-9引起級聯(lián)反應(yīng)，進而激活Caspase-3引起染色體斷裂，引起細(xì)胞凋亡[26]。Bcl-2家族中包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩部分。抗凋亡蛋白如Bcl-2通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位阻斷細(xì)胞色素C的釋放，并阻止凋亡誘導(dǎo)因子進入細(xì)胞質(zhì)。而Bax蛋白發(fā)揮促凋亡活性，可促進細(xì)胞色素C的釋放，故認(rèn)為Bcl-2通過抑制細(xì)胞色素C的釋放，以阻止Caspase-3的激活[27]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，與CORM-2組比較，芹菜素能夠降低CORM-2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中Bax和Caspase-3蛋白的表達，同時上調(diào)Bcl-2蛋白的表達，其作用效果與芹菜素的濃度呈正相關(guān)。本實驗結(jié)果說明，芹菜素可以通過有效抑制促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表達，同時促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，以減輕CO中毒導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡，具有潛在的保護神經(jīng)元作用。