精子DNA碎片化指數(shù)對其配偶體外受精-胚胎移植后胚胎質(zhì)量的影響

楊光，李榮香

(漯河市中心醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)與遺傳中心，河南 漯河 462000)

精液常規(guī)分析是評價(jià)男性不育的重要參考指標(biāo)，但無法全面反映精子的質(zhì)量與功能[1]。精子可向胚胎提供50%遺傳物質(zhì)，其染色質(zhì)結(jié)構(gòu)是否正常對精子受精能力、胚胎發(fā)育及后期臨床妊娠具有重要作用[2]。體外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET)對精子的質(zhì)量要求較高[3]。精子DNA碎片(sperm DNA fragmentation，SDF)為精子形成期間受外界有害因素影響產(chǎn)生的一類產(chǎn)物，其含量在正常精子核遺傳物中占比相對較小，可干擾男性生育能力[4]。精子DNA碎片指數(shù)(DNA fragmentation index，DFI)為近年臨床評估男性生育能力的指標(biāo)[5]，DFI含量越高，則男性生育能力越低[6]。本文分析DFI對其配偶IVF-ET后胚胎質(zhì)量的影響，以期為臨床早期干預(yù)提供可參考依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料選取2020年3月至2021年3月漯河市中心醫(yī)院收治的139例行IVF-ET者為研究對象。男、女雙方了解本研究內(nèi)容并自愿簽署知情同意書。依據(jù)DFI含量分為低含量組(DFI<10%，n=37)、中含量組(10%≤DFI<20%，n=76)、高含量組(DFI≥20%，n=26)。低含量組女27～39(33.15±2.72)歲，男27～40(33.67±2.87)歲；不孕時(shí)間2～6(3.97±0.79)a；獲卵數(shù)8～13(10.33±1.12)枚；移植胚胎數(shù)1～3(1.71±0.35)枚；子宮內(nèi)膜厚度8～13(10.32±0.97)mm。中含量組女27～39(33.09±2.85)歲，男27～41(34.01±3.12)歲；不孕時(shí)間2～6(4.10±0.84)a；獲卵數(shù)7～13(10.02±1.09)枚；移植胚胎數(shù)1～3(1.62±0.29)枚；宮內(nèi)膜厚度7～13(10.27±1.14)mm。高含量組女27～40(33.41±2.91)歲，男27～41(33.69±3.24)歲；不孕時(shí)間2～6(3.95±0.86)a；獲卵數(shù)7～13(10.19±1.23)枚；移植胚胎數(shù)1～3(1.68±0.31)枚；子宮內(nèi)膜厚度8～13(10.34±1.08)mm。3組女性年齡、男性年齡、不孕時(shí)間、獲卵數(shù)、移植胚胎數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。本研究已通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核。

1.2 選取標(biāo)準(zhǔn)(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：女方月經(jīng)、子宮正常，具有輸卵管原因不孕；男方輸精管及外生殖器正常；夫妻雙方為首次行IVF-ET術(shù)。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：男、女方染色體異常；女方具有子宮內(nèi)膜異位癥及子宮肌瘤等影響妊娠疾?。荒蟹骄好芏容^低；男、女方存在認(rèn)知障礙或精神障礙而無法配合；男、女方中任意一方伴有傳染類疾病，如乙肝、艾滋病等；男、女方中任意一方伴有惡性腫瘤、肝腎功能嚴(yán)重異常；中途自愿退出。

1.3 研究方法

1.3.1精液收集、分析 男方禁欲2～7 d，經(jīng)手淫方式取精，精液液化后進(jìn)行觀察和分析，結(jié)合計(jì)數(shù)的精液濃度，取一定量的精液稀釋至100 μL，終濃度為(1～2)×106mL-1。

1.3.2精液處理方式 取卵當(dāng)天精液處理方法是密度梯度離心聯(lián)合上游法。精液處理試劑、胚胎培養(yǎng)試劑均購自SAGE公司。于取卵當(dāng)天手淫取精，精液在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)液化后，于鏡下觀察并記錄精液量、性質(zhì)與精子功能等，分別取80%梯度試劑、40%梯度試劑各1.5 mL，加入15 mL離心管中使其產(chǎn)生兩層清晰界面，再加1.5～3 mL液化精液，100 g離心20 min，沉淀混勻后100 g離心5 min，重復(fù)一次，取沉淀精子在培養(yǎng)箱內(nèi)待用。

1.3.3IVF、胚胎觀察和移植 于B超下經(jīng)陰道穿刺取卵，卵母細(xì)胞的受精時(shí)間是絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)注射后39 h，于4 h后拆卵觀察是否存在第二級體排出，次日晨起觀察胚胎原核，同時(shí)進(jìn)行原核評分(結(jié)合原核期核及核仁大小、數(shù)量、排列等分為Z1、Z2、Z3、Z4，Z1等級的囊胚形成率高)鏡下看到原核確認(rèn)受精。第3天胚胎觀察分級，其中正常受精為原核觀察時(shí)的2原核；細(xì)胞數(shù)超出7個(gè)，卵裂球?yàn)榇笮【鶆蚴洽窦壟咛?，為?yōu)質(zhì)胚胎。移植當(dāng)天酌情選胚胎移植。

1.3.4精子DNA碎片化指數(shù)[7]取液化后新鮮精液，用0.1 mol·L-1PBS洗3遍，離心，再次混懸沉淀物，調(diào)精子濃度至5×107mL-1，涂片，待自然干燥；浸入Carnoy’s固定液(甲醇與冰醋酸以3∶1比例進(jìn)行調(diào)配)2 h，待自然干燥；取新鮮配制的吖啶橙工作液浸染約5 min，流水輕柔沖洗，用蒸餾水封片，采用日本Olympus BX51型號熒光顯微鏡(×400)進(jìn)行觀察，每一視野觀察時(shí)長不超出40 s。計(jì)數(shù)300個(gè)精子內(nèi)紅色精子與黃色精子的總百分比，即為精子DFI。注意精子計(jì)數(shù)均由同一醫(yī)生進(jìn)行。

1.4 觀察指標(biāo)(1)精液常規(guī)參數(shù)，即精子濃度、精子活力、前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)。(2)胚胎質(zhì)量，包括優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植成功率、受精成功率。(3)妊娠結(jié)果，包括臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、早產(chǎn)率。

2 結(jié)果

2.1 精液常規(guī)參數(shù)3組精子活力、精子濃度對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低含量組、中含量組前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)高于高含量組(P<0.05)。見表1。

表1 3組精液常規(guī)參數(shù)對比

2.2 胚胎質(zhì)量低含量組受精成功率、種植成功率、優(yōu)質(zhì)胚胎率高于中含量組與高含量組，且中含量組受精成功率、種植成功率、優(yōu)質(zhì)胚胎率高于高含量組(P<0.05)。見表2。

表2 3組胚胎質(zhì)量對比[n(%)]

2.3 妊娠結(jié)局3組流產(chǎn)率、早產(chǎn)率對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；低含量組臨床妊娠率、活產(chǎn)率高于中含量組與高含量組，且中含量組臨床妊娠率、活產(chǎn)率高于高含量組(P<0.05)。見表3。

表3 3組妊娠結(jié)局對比[n(%)]

3 討論

受環(huán)境、飲食等多方面誘因影響，育齡期夫婦不孕不育發(fā)生率持續(xù)升高，而不孕不育的原因涉及男方與女方，其中男方因素包括器官及內(nèi)分泌異常等，女方因素包括排卵異常、輸卵管因素、免疫原因等。有關(guān)調(diào)查結(jié)果指出，全球15%育齡夫婦存在不孕不育問題，給自身與家庭帶來一定困擾，甚至引起家庭矛盾[8]。臨床針對不孕不育夫妻多主張使用輔助生殖技術(shù)進(jìn)行受精，以IVF-ET干預(yù)為主，有助于提高妊娠成功率。隨IVF-ET臨床應(yīng)用的增多，IVF-ET操作期間，存在部分精子和卵子接觸但未受精，或胚胎移植之后因胚胎質(zhì)量差而導(dǎo)致妊娠失敗，在排除卵子問題和實(shí)驗(yàn)室操作問題之后，發(fā)現(xiàn)主要問題為精子質(zhì)量，而精子的常規(guī)檢測中并未發(fā)現(xiàn)顯著異常問題，故認(rèn)為與精子DNA的完整性相關(guān)[9]。精子DNA受損，可影響正常受精和受精卵的發(fā)育[10]。

精子DFI為近幾年生殖醫(yī)學(xué)界一項(xiàng)研究焦點(diǎn)，其可有效反映精子的DNA的完整性。引起精子DNA受損的主要機(jī)制如下：生精期間細(xì)胞凋亡；精子于運(yùn)輸期間受氧自由基的干擾；精子染色質(zhì)包裝存在異常[11]。精子DNA受損時(shí)，可干擾父源基因組完整性，干擾精子染色質(zhì)組裝、精子細(xì)胞異常凋亡以及氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，隨DFI指數(shù)下降，前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)、種植成功率、受精成功率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率逐漸升高。DFI指數(shù)>20%時(shí)，說明精子完整性存在缺失，致使精子與卵子細(xì)胞受精時(shí)受精率降低，或受精成功之后，胚胎發(fā)育不良而胚胎質(zhì)量較差，極易出現(xiàn)流產(chǎn)等狀況[12-13]。而本研究結(jié)果顯示，3組流產(chǎn)率、早產(chǎn)率對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與樣本量小有關(guān)，可擴(kuò)大樣本量對本研究結(jié)果進(jìn)一步論證。以往研究指出，精子DFI和精子核魚精蛋白(P1、P2型)水平成反比，P1/P2下降時(shí)精子DAN損傷情況加重；魚精蛋白含量減少、二硫鍵產(chǎn)生受阻為致使精子染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)松散以及精子DNA完整性減少的主要原因，且P2缺少時(shí)，正常形態(tài)的精子率與精子活力明顯降低[14-15]。本研究結(jié)果指出，3組精子活力對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，精子DFI指數(shù)與精子活力無明顯關(guān)聯(lián)性，可能為本研究中納入研究對象精力活力基本處于正常狀況，而精子DNA完整性出現(xiàn)缺失的原因不包括精子細(xì)胞凋亡，故DFI存在差異，但精力活力無差異。

綜上可知，IVF-ET后胚胎質(zhì)量、妊娠結(jié)局受精子DFI指數(shù)影響，即精子DFI指數(shù)越高胚胎質(zhì)量越差，因此臨床可將精子DFI指數(shù)作為評估IVF-ET后胚胎質(zhì)量、妊娠結(jié)局的指標(biāo)之一，為臨床中制定針對性改善妊娠結(jié)局的干預(yù)措施提供可參考依據(jù)。此外本研究仍具有一定不足，例如樣本量選取相對較小，未來可擴(kuò)大樣本量，通過多中心研究獲得更為可靠的研究結(jié)果。