影響豬精子冷凍保存效果的研究進(jìn)展

張 涵，王赫川，李天峰，張 群，王 騫，郭銘暉，李雁冰，魏國(guó)生，李井春

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

隨著我國(guó)居民生活水平的提高，豬肉已經(jīng)成為我國(guó)乃至世界上需求量最廣泛的肉類(lèi)。為了滿(mǎn)足人類(lèi)的需求，就必須專(zhuān)注于用更少的種豬生產(chǎn)更多品質(zhì)優(yōu)異的豬肉。目前精液保存方法主要有常溫、低溫和冷凍保存，常溫保存精液技術(shù)操作簡(jiǎn)單，但精液保存時(shí)間超過(guò)48 h就會(huì)品質(zhì)下降，而冷凍保存精液與常溫保存精液相比，具有保存時(shí)間長(zhǎng)、便于遠(yuǎn)距離運(yùn)輸和成本低等優(yōu)點(diǎn)。豬精液在冷凍-解凍過(guò)程中易遭受損傷，造成精子受精能力下降。因此，人們開(kāi)始不斷探索在精液稀釋液中加入一定量的抗氧化劑、保護(hù)劑、抗菌劑等物質(zhì)來(lái)改善解凍后豬精子質(zhì)量。加快豬精液冷凍保存技術(shù)的改良研究，有助于推動(dòng)畜牧業(yè)發(fā)展，提高人民生活品質(zhì)。

1 豬精液冷凍原理及損傷機(jī)制

豬精液冷凍主要是指新鮮采集的精液經(jīng)過(guò)稀釋等預(yù)處理后，利用液氮（-196℃）、干冰（-79℃）作為冷源，通過(guò)熏蒸或其他處理方式緩慢降溫，然后在超低溫狀態(tài)下保存，使精子代謝速率降低或處于靜止?fàn)顟B(tài)，便于長(zhǎng)期保存，待解凍后精子仍具有活性和受精能力。

精子在冷凍保存過(guò)程中極易受到不同程度的物理?yè)p傷、氧化損傷和化學(xué)損傷。物理?yè)p傷通常指在精液冷凍時(shí)因溫度下降過(guò)快，細(xì)胞內(nèi)液體形成冰晶體從而對(duì)精子細(xì)胞內(nèi)部及細(xì)胞膜造成不可逆損傷。通過(guò)控制溫度下降速度可減少冰晶數(shù)量維持微晶狀態(tài)，減少冷凍造成的物理?yè)p傷。氧化損傷是精子在冷凍過(guò)程中溫度下降過(guò)快，精子氧化應(yīng)激產(chǎn)生過(guò)多活性氧，造成膜上不飽和脂肪酸被氧化，產(chǎn)生大量脂質(zhì)過(guò)氧化物，打破原本的氧化還原平衡狀態(tài)和精子的完整結(jié)構(gòu)，對(duì)精子造成不可恢復(fù)的損傷，也是細(xì)胞凋亡的重要因素之一。化學(xué)損傷是指精液在冷凍過(guò)程中，細(xì)胞外液最先形成冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓不平衡，使細(xì)胞外液滲透壓大于細(xì)胞內(nèi)滲透壓，水分從細(xì)胞內(nèi)部流向細(xì)胞外液，造成精子脫水死亡。

2 影響豬精液冷凍保存質(zhì)量的因素

2.1 冷凍溫度和速率

降溫處理是精液冷凍保存過(guò)程中重要的一步程序，降溫主要指由新鮮采集的精液溫度降低到冷凍保存的溫度。降溫需跨越一個(gè)危險(xiǎn)溫度區(qū)域，即-5℃至-60℃，溫度的變化會(huì)影響精子的代謝功能，也會(huì)損害精子的頂體膜，降低膜的通透性，這種影響稱(chēng)為低溫打擊。低溫打擊對(duì)不同動(dòng)物的精子影響程度不同，豬精子最敏感，牛、羊、馬次之，兔、人和禽類(lèi)較差。許多研究表明，控制降溫速度可以減少或阻止低溫打擊的發(fā)生。精子細(xì)胞內(nèi)冰晶未形成前，細(xì)胞外已結(jié)冰被認(rèn)為是豬精子理想的冷凍效果。冷凍速率的快慢影響了冰晶的數(shù)目和大小，過(guò)快、過(guò)慢都會(huì)對(duì)精子造成嚴(yán)重的損害。

2.2 添加抗氧化劑

由于精子在冷凍過(guò)程中，精子膜上的不飽和脂肪酸會(huì)產(chǎn)生活性氧，活性氧的過(guò)量產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，造成精子線粒體損傷、質(zhì)膜不完整、解凍后活力下降。許多研究為提高精液冷凍質(zhì)量在精液的稀釋液中加入一定的抗氧化劑來(lái)降低活性氧的含量，提高精子的存活率，增強(qiáng)豬冷凍精子的效用。

2.2.1 白藜蘆醇

白藜蘆醇是1940年從藜蘆中分離出的多酚類(lèi)二苯乙烯類(lèi)化合物，葡萄、花生、虎杖是其主要的天然來(lái)源。由于其具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗菌、防治心血管疾病等特性，使得它在食品添加劑、保健、化妝品、醫(yī)藥方面等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。在雞、豬、人類(lèi)和水牛的基礎(chǔ)稀釋液中添加白藜蘆醇，其凍精的活力與鮮精差異不顯著。菅芯蕊等應(yīng)用25、50、100、200 μmol/L濃度的白藜蘆醇對(duì)松遼黑豬精液進(jìn)行冷凍保存，30 d后檢測(cè)結(jié)果表明，在精液冷凍前添加50 μmol/L白藜蘆醇效果最好，可改善解凍后的精子質(zhì)量。

2.2.2 蝦青素

蝦青素屬于酮式類(lèi)胡蘿卜素，是自然界中的一種強(qiáng)抗氧化劑，在真菌和海洋微生物中廣泛分布，通常以游離形式存在。由于其結(jié)構(gòu)式中含有異戊二烯共軛雙鍵、羥基和不飽和酮基，容易和未配對(duì)的電子反應(yīng)，所以能夠有效地清除活性氧，保護(hù)脂肪酸免受脂質(zhì)過(guò)氧化。Basioura等探討了在豬精液冷凍保存過(guò)程中，添加蝦青素對(duì)改善低溫保存精子的質(zhì)量和功能狀態(tài)具有的潛在影響，且在解凍稀釋液中添加0.5 μmol/L蝦青素對(duì)公豬冷凍精子凋亡變化有微弱的促進(jìn)作用。胡亞美在對(duì)豬精液常溫保存時(shí)得出，添加0.25 μg/mL蝦青素能提高精液ATP水平（腺嘌呤核苷三磷酸簡(jiǎn)稱(chēng)三磷酸腺苷，是一種不穩(wěn)定的高能化合物）和乳酸脫氫酶活性，高線粒體膜電位比例增加，對(duì)精子的活力和運(yùn)動(dòng)參數(shù)都有所提高，但差異不顯著。

2.2.3 蘆丁及其他

蘆丁又稱(chēng)維生素P，屬于黃酮類(lèi)化合物，是一種呈淡綠色或淡黃色的粉末，在蕓香葉、棗、杏、番茄中廣泛存在。其具有抗脂質(zhì)氧化、抗自由基、抗病毒等作用。目前蘆丁在豬冷凍精液保存中的研究還是比較少見(jiàn)的。吳林在長(zhǎng)白豬的稀釋精液中添加0.6 mmol/L的蘆丁，使解凍后的精子運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，提高了精子的生理特征，顯著降低了精子發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。此外，在豬的基礎(chǔ)稀釋液中加入合適濃度的γ-谷維素、芝麻酚、綠原酸等抗氧化劑都能有效提高豬冷凍精子的質(zhì)量。

2.3 添加抗菌物質(zhì)

精液從采集、處理和保存中經(jīng)常會(huì)被微生物污染，微生物會(huì)使精子質(zhì)量下降并縮短精子壽命，受污染嚴(yán)重的精液可能會(huì)導(dǎo)致母畜發(fā)生子宮內(nèi)膜炎等疾病，在精液稀釋液中適當(dāng)添加抗菌素可有效防止精子退化和疾病傳播。Feng等結(jié)果表明在17℃液體儲(chǔ)存公豬精液時(shí)，在稀釋液中加入0.02 g/L磺胺與對(duì)照組相比，葡萄球菌和假單胞菌減少，并且將保存的精液用于人工授精后，母豬產(chǎn)仔數(shù)高于其對(duì)照組。

由于使用抗菌素會(huì)使部分細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，對(duì)人類(lèi)的健康造成了嚴(yán)重影響，所以學(xué)者們把研究重心放在了抗生素的替代品上。Alberto等研究茶樹(shù)（互葉白千層）和迷迭香精油的非殺精濃度在冷藏豬精劑量液相上的抗菌能力時(shí)表明：互葉白千層和迷迭香精油，在0.4 mg/ml濃度下，對(duì)20%的精漿和80%的豬受精液混合物都能產(chǎn)生與氨芐青霉素相似的效果?？咕腜MAP-37被認(rèn)為是能代替抗生素的候選物質(zhì)之一，它能有效保持精子活力并控制細(xì)菌數(shù)量。另外，在豬精液低溫保存技術(shù)中，溫度也能夠影響儲(chǔ)存過(guò)程中細(xì)菌的傳播，Waberski等證明，低溫儲(chǔ)存5℃，可減少抗菌素的使用。

2.4 冷凍保護(hù)劑

冷凍保護(hù)劑是豬精液稀釋液中必不可少的組成部分，為了降低精子在冷凍保存過(guò)程中所遭受的冷打擊傷害程度，許多學(xué)者選擇在稀釋液中添加一定量的冷凍保護(hù)劑來(lái)確保精液冷凍保存效果。目前，有滲透性和非滲透性?xún)煞N冷凍保護(hù)劑，它們?cè)诶鋬霰４孢^(guò)程中均可形成保護(hù)玻璃態(tài)，可以保存豬精子生物分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

2.4.1 滲透性保護(hù)劑

滲透性保護(hù)劑大多是一些小分子物質(zhì)，主要包括二甲基亞砜、甘油、二甲基甲酰胺、乙二醇等，它們?cè)诩?xì)胞冷凍懸液凝固之前，透過(guò)細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞內(nèi)部，使細(xì)胞內(nèi)外溶液產(chǎn)生濃度差，而精子細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度降低，避免精子細(xì)胞脫水皺縮引起的損傷。但滲透性冷凍保護(hù)劑對(duì)精子而言，尤其是在高濃度情況下具有一定的毒害作用。目前豬精液冷凍保護(hù)劑中使用最常見(jiàn)的是甘油，其結(jié)構(gòu)中的3個(gè)羥基可結(jié)合精液中的水分，使水分子形成冰晶得到控制，其烴鏈屬于疏水基團(tuán)，通過(guò)阻礙精子內(nèi)水分滲透來(lái)保護(hù)精子免受損傷。Yang等研究不同濃度的甘油（0%，1%，2%，3%和5%）和二甲基乙酰胺（DMA：0%，1%，3%和5%）對(duì)豬精液冷凍后精子質(zhì)量的影響得出，精液中含有5%的甘油的干冰冷凍精液組，解凍后精子活力、活率和頂體完整率優(yōu)于其他組合，但含有3%甘油的干冰冷凍精液組，解凍后的精液質(zhì)量指標(biāo)效果最好；甘油和DMA聯(lián)合使用和其他組相比，對(duì)提高冷凍存活率影響不大。但一些研究結(jié)果顯示，稀釋液加入甘油的濃度較高時(shí)，對(duì)精子產(chǎn)生毒害作用，降低受孕率，破壞精子的核膜。Pinho等在評(píng)估不同保護(hù)劑對(duì)Piau豬精液冷凍的可行性時(shí)，得出單獨(dú)使用酰胺（3%）和甘油（2%）或與二甲基乙酰胺（5%）的組合比單獨(dú)使用甘油對(duì)冷凍保護(hù)更有效。

2.4.2 非滲透性保護(hù)劑

非滲透性保護(hù)劑大多是一些大分子物質(zhì)，主要包括卵黃、脫脂乳、羥乙基淀粉、海藻糖、白蛋白等，它們對(duì)精子不會(huì)產(chǎn)生毒性，主要通過(guò)調(diào)節(jié)精子細(xì)胞外液滲透壓來(lái)控制細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而保護(hù)精子免受損傷。近年來(lái)，非滲透性保護(hù)劑使用最廣泛的是卵黃。卵黃中的膽固醇能夠保持精子活力，卵黃中的脂質(zhì)蛋白、卵磷脂類(lèi)物質(zhì)可防止精子遭受冷打擊。汪俊躍等研究豬精子冷凍保存凋亡時(shí)，以高壓均質(zhì)蛋黃+Tris-檸檬酸-葡萄糖（TCG）稀釋劑為處理組和普通蛋黃+三檸檬酸-葡萄糖（TCG）稀釋劑為對(duì)照組，比較得出以高壓均質(zhì)蛋黃處理的精液，解凍后精子活力、活率、DNA完整率、線粒體膜電位和頂體完整率均優(yōu)于對(duì)照組，推測(cè)高壓后的蛋黃中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)能更好地融合，降低了卵黃自身帶有的微生物對(duì)冷凍后精液的影響，而Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性明顯低于對(duì)照組，降低了在豬精液冷凍細(xì)胞的凋亡水平。鐘觀新對(duì)廣東小耳花豬精液冷凍保存時(shí)發(fā)現(xiàn)，在稀釋液中加入新鮮雞蛋卵黃比陳舊雞蛋卵黃效果好。

2.5 解凍溫度和時(shí)間

豬精液在解凍過(guò)程中也需要跨過(guò)-25～-5℃的解凍危險(xiǎn)區(qū)，并且解凍速率過(guò)慢會(huì)導(dǎo)致豬精子內(nèi)部發(fā)生重結(jié)晶，與解凍液接觸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)使精子遭受破壞；解凍速率過(guò)快會(huì)損害質(zhì)膜完整性或出現(xiàn)沒(méi)完全解凍的現(xiàn)象。因此，合適的解凍溫度和速度對(duì)豬精子解凍至關(guān)重要。冷凍保存的豬精液目前有低溫冰水解凍（0～5℃）、溫水解凍（30～40℃）、高溫解凍（50～70℃）等解凍方式。目前主要采用從液氮罐中取出豬冷凍精液的細(xì)管后，快速放入50℃的水浴鍋中解凍10 s的方法解凍。Tomás等評(píng)估表明凍精在70℃解凍8 s時(shí)公豬精子活力和曲線速度、直線速度、平均路徑和頭部平均側(cè)向位移幅度均高于凍精在37℃解凍20 s時(shí)觀察的結(jié)果。凌培鳳研究結(jié)果表明37℃解凍30 s和65 ℃解凍5 s是豬冷凍精液的最佳解凍溫度。

3 小結(jié)

豬精液冷凍技術(shù)的發(fā)展充分利用了優(yōu)秀的種豬資源，克服了地域間差異引起的不便，為養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展提供了巨大幫助。目前，冷凍保存技術(shù)在抗氧化劑、抗菌物質(zhì)、冷凍保護(hù)劑等方面研究取得一定進(jìn)展，但豬冷凍精液因解凍后效果不佳，經(jīng)濟(jì)成本較高等問(wèn)題，在實(shí)際生產(chǎn)中的實(shí)踐應(yīng)用還需進(jìn)一步研究與探討。