顱腦損傷患者miR-124水平變化及其對預后的預測價值分析*

王上橋，孫占玉，吳運橋，梁定興

海南西部中心醫(yī)院神經(jīng)外科，海南儋州 571700

目前顱腦損傷(TBI)已成全球公共衛(wèi)生問題之一，其病情危急、致殘及致死率高，其中致殘率、致死率位居各類創(chuàng)傷首位，是人類第三大致死病因[1]。臨床上主要通過磁共振及擴展格拉斯哥結局量表(GOS-E)[2]評估TBI病情，但前者僅可評價病情無法直觀描述病情進展，而GOS-E存在一定主觀性，亦無法提供客觀評估依據(jù)。盡管當前也有較多研究從血清學層面入手評估TBI患者病情轉歸，但鑒于此疾病轉歸機制復雜，仍無有效預測機制。因此，積極探索TBI患者損傷程度及預后評估機制仍是臨床研究重點、熱點之一。微小RNA(miRNA)是廣泛分布在機體內(nèi)的一種非編碼微小核糖核酸，其不僅參與機體代謝、細胞增殖分化等多種生物過程，且具有相對穩(wěn)定性及組織特異性等特征[3]。miR-124是一種神經(jīng)系統(tǒng)特異性miRNA，約占大腦皮質(zhì)總miRNA的25%～48%[4]。研究證實，腦損傷大鼠血miR-124水平增加，提示其可能參與損傷后神經(jīng)修復等生理病理過程[5]。但TBI患者miR-124水平及其對預后的預測價值如何尚無定論，本研究擬為臨床完善相關預警機制提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年5月至2021年8月本院收治的108例TBI患者作為研究對象，其中72例作為訓練組，36例作為驗證組。另選取同期36例健康體檢者作為對照組。納入標準：(1)訓練組及驗證組有明確頭部外傷史，符合TBI診斷標準[6]；(2)訓練組及驗證組傷后入院時間不足12 h；(3)訓練組及驗證組傷前營養(yǎng)狀況良好；(4)對照組身體健康，無創(chuàng)傷史及臟器病變。排除標準：(1)傷前存在感染者；(2)有既往顱腦損傷史；(3)腫瘤患者；(4)存在嚴重心、肝、腎等系統(tǒng)疾病者。本研究經(jīng)醫(yī)學倫理委員會審批通過(批號：20190424145)。所有研究對象知情研究內(nèi)容，并簽署同意書。

訓練組中男42例，女30例；年齡28～57歲，平均(41.89±5.78)歲；體質(zhì)量指數(shù)18～26 kg/m2，平均(22.26±1.33)kg/m2；合并高血壓11例，合并糖尿病6例，合并高脂血癥12例。驗證組中男20例，女16例；年齡25～58歲，平均(40.77±5.91)歲；體質(zhì)量指數(shù)18～26 kg/m2，平均(22.12±1.25)kg/m2；合并高血壓7例，合并糖尿病4例，合并高脂血癥7例。對照組中男21例，女15例；年齡24～58歲，平均(41.23±6.01)歲；體質(zhì)量指數(shù)18～26 kg/m2，平均(21.92±1.30)kg/m2；合并高血壓8例，合并糖尿病5例，合并高脂血癥6例。3組研究對象性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、慢性疾病史比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1TBI治療方法 參照《顱腦創(chuàng)傷臨床救治指南》[7]，TBI患者入院后均予以積極治療，治療措施包括監(jiān)護病情，維持呼吸道暢通，降顱壓，治療腦水腫，防范呼吸、心腦及消化道等并發(fā)癥。若存在手術指征則積極手術治療?；颊叱鲈汉笸ㄟ^進行電話、門診隨訪，了解患者康復情況，并通知患者出院后3個月時到院進行預后恢復狀態(tài)評估。

1.2.2檢測方法 于TBI患者入院時、出院前1 d及對照組體檢當日，采用非抗凝真空管采集肘靜脈血4 mL，在4 ℃下，以轉速3 000 r/min、半徑8 cm離心15 min，收集血清，液氮保存。采用賽默飛Paris試劑盒提取總RNA，檢測RNA純度、濃度。采用賽默飛反轉錄試劑盒測定miR-124水平。miR-124正向引物：5′-GCTAAG-GCACGCGGTG-3′，反向引物：5′-GTGCAGGTC-CGAGGT-3′。U6正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，0.8 μL上游引物，2 μL cDNA，雙蒸水加至20 μL。反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算miR-124水平。

1.2.3觀察指標 (1)比較對照組及訓練組入院時、出院前1 d miR-124水平。(2)分析入院時miR-124水平與訓練組損傷程度的關系。采用格拉斯哥昏迷量表(GCS)評分[8]評估損傷程度，13～15分為輕度，9～12分為中度，3～8分為重度。(3)評估訓練組出院后3個月時的GOS-E評分，5～8分為預后良好，1～4分為預后不良，比較不同預后TBI患者資料。(4)采用Cox回歸模型分析TBI患者預后影響因素。(5)采用受試者工作特征(ROC)曲線分析miR-124對TBI患者預后的預測價值。(6)檢測驗證組miR-124水平進行組外驗證。

2 結 果

2.1訓練組與對照組及訓練組治療前后miR-124水平比較 訓練組入院時miR-124水平為2.58±0.61，出院前1 d為1.43±0.40，對照組為1.06±0.27。訓練組入院時、出院前1 d miR-124水平均高于對照組(t=14.244、5.004，P<0.05)，訓練組出院前1 d miR-124水平低于入院時(t=13.401，P<0.05)。

2.2訓練組入院時miR-124水平與損傷程度的關系 72例患者中輕度20例、中度35例、重度17例，輕、中、重度TBI患者miR-124水平分別為2.21±0.49、2.57±0.58、3.04±0.70。不同損傷程度TBI患者miR-124水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F=9.173，P<0.05)；隨著患者損傷程度加重，miR-124水平呈升高趨勢(P<0.05)。訓練組入院時miR-124水平與損傷程度呈正相關(r=0.628，P<0.05)。見圖1。

圖1 訓練組入院時miR-124水平與損傷程度的關系

2.3訓練組預后影響因素的單因素分析 訓練組72例患者隨訪3個月，失訪2例，有效隨訪70例，其中預后良好52例，預后不良例18例。單因素分析結果顯示，損傷程度、中線移位>5 mm、合并腦疝、瞳孔對光反應比例及腦血腫體積、入院時及出院前1 d miR-124水平在預后良好與預后不良患者間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 訓練組預后影響因素的單因素分析或n(%)]

續(xù)表1 訓練組預后影響因素的單因素分析或n(%)]

表2 變量賦值

2.4訓練組預后影響因素的多因素Cox回歸模型分析 將結果2.3中P<0.05的因素進行多重共線性檢驗，發(fā)現(xiàn)入院時miR-124水平、損傷程度存在共線性(VIF>5)，故手動移除損傷程度、入院時miR-124。將預后情況作為因變量，中線移位>5 mm、合并腦疝、瞳孔對光反應比例、腦血腫體積、出院前1 d miR-124作為自變量，具體賦值見表2。采用多因素Cox回歸模型進行分析，結果顯示，校正合并腦疝、中線移位>5mm、瞳孔對光反應、腦血腫體積后，出院前1 d miR-124水平是預后的獨立影響因素(P<0.05)。見表3。

表3 訓練組預后影響因素的多因素Cox回歸模型分析

2.5出院前1 d miR-124對預后的預測價值 將預后不良患者數(shù)據(jù)作為陽性數(shù)據(jù)，預后良好患者數(shù)據(jù)作為陰性數(shù)據(jù)繪制ROC曲線，結果顯示，出院前1 d miR-124預測TBI患者預后不良的AUC為0.784(95%CI：0.669～0.873，P<0.05)，Youden指數(shù)最高值為0.487，預測的cut off值為1.41，靈敏度為83.33%，特異度為75.38%。見圖2。

圖2 出院前1 d miR-124預測TBI患者預后的ROC曲線

2.6組外驗證 以出院前1 d miR-124≤1.41為預后不良的判斷標準對驗證組36例患者進行組外驗證，結果顯示，出院前1 d miR-124預測TBI患者預后不良的靈敏度為80.00%，特異度為80.77%，準確度為80.56%。見表5。

表5 組外驗證的預測結果(n)

3 討 論

TBI主要包括兩個層面，一是原發(fā)性機械腦損傷，二是傷后出現(xiàn)的一系列病理生理變化所致神經(jīng)退行性改變[9]。近年來隨著醫(yī)療技術的快速發(fā)展，TBI病死率得到顯著控制，但由于此類患者腦神經(jīng)組織損傷嚴重，預后多數(shù)存在不同程度殘疾，而早期評估其預后積極完善干預治療方案是改善預后的關鍵環(huán)節(jié)。

近年有關TBI預后的研究較多，如：孫國章等[10]提出，首診GCS評分是此類患者預后的獨立相關因素；郭異之等[11]研究表明，白細胞介素-6等炎癥因子水平升高是重度TBI患者近期預后的危險因素，可為臨床評估預后提供參考。但從TBI病情轉歸的病理生理相關機制角度分析不難發(fā)現(xiàn)，其預后轉歸涉及炎癥反應、神經(jīng)組織損傷修復等多個過程，而此過程中神經(jīng)修復相關調(diào)控機制如何變化尚無定論。miR-124屬神經(jīng)系統(tǒng)特異性miRNA，其能憑借5′端種子序列與3′端非編碼區(qū)不完全或完全配對結合實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的合成及功能的調(diào)控，繼而控制、調(diào)節(jié)各項生理功能[12-14]。研究證實，miR-124基因缺失鼠存在大腦體積減小、軸突發(fā)育缺陷、神經(jīng)細胞死亡等發(fā)育表型變化[15]。據(jù)此推測miR-124可能在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中負責促進神經(jīng)元分化及軸突再生修復等重要生理過程，或可為臨床評估TBI病情提供新視角。本研究結果顯示，TBI患者入院時miR-124水平明顯升高，而出院前1 d降至較低水平，反映出miR-124水平降低與病情康復有關。可能原因：TBI發(fā)生后主要由神經(jīng)干細胞遷移并整合進入損傷腦神經(jīng)組織中，并對TBI引起的神經(jīng)結構損傷及功能損毀進行修復，而miR-124作為促神經(jīng)細胞增殖、分化的重要活性物質(zhì)，TBI發(fā)生后出現(xiàn)的一系列生理病理反應能激活miR-124大量表達以滿足腦神經(jīng)損傷修復的需求，且損傷越嚴重，可能其水平越高以滿足神經(jīng)損傷修復的需求，同時隨病情康復，此需求量逐漸減少，故表現(xiàn)為外周血miR-124水平降低[16-18]。由此上述推測得以證實。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，預后良好患者miR-124水平較高，與部分動物實驗研究[19-20]的結論相符。經(jīng)Cox回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，miR-124水平升高是TBI患者預后不良的獨立保護因素，此特征和miR-124水平與損傷程度呈正相關的結論相悖，但深入分析主要是因TBI病理機制復雜，可能會損傷促miR-124表達的功能結構模塊，致miR-124表達相對不足或?qū)嶋H情況下miR-124表達能力有限，無法滿足TBI所致神經(jīng)結構及功能損害修復所需，因此，當miR-124水平較低時患者預后不良，miR-124仍保持較高水平時可能更利于促進神經(jīng)損傷修復[21]。這與臨床案例中重度TBI患者也可恢復最佳臨床狀態(tài)，而中度TBI患者反而恢復不佳的實例相符。但也有研究顯示，miR-124可能在神經(jīng)損傷中具有雙重作用，如在急性腦梗死患者中miR-124水平越高梗死體積越小，但過高水平可促進炎癥反應，反而不利于預后恢復[22]，其具體的水平梯度尚未明確。但本研究未發(fā)現(xiàn)此特征，分析可能與病例選取不同有關，TBI的損傷程度決定因素更側重于外界暴力作用情況，而腦梗死體積受自身內(nèi)部影響較大，miR-124在TBI患者中是否具有類似的水平梯度仍需繼續(xù)探討。ROC曲線分析結果顯示，出院前1 d miR-124預測TBI患者預后不良的AUC為0.784，并以出院前1 d miR-124≤1.41為預后不良的判斷標準進行組外驗證，結果顯示，miR-124預測TBI患者預后不良的靈敏度為80.00%，特異度為80.76%，準確度為80.56%，證實miR-124在預測TBI患者預后中具有重要價值。

綜上所述，TBI患者入院時外周血miR-124水平明顯升高，且與損傷程度呈正相關，其是TBI患者預后的獨立影響因素，可為臨床預后評估提供參考。