MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達及其臨床價值*

郭麗寧，常 蕊，楊 杰，許汴菊

榆林市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西榆林 719000

子宮內(nèi)膜癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率居女性惡性腫瘤第8位，死亡率僅次于卵巢癌和宮頸癌[1]。子宮內(nèi)膜癌臨床治療主要以“早期發(fā)現(xiàn)、盡早治療”為主，多采取以手術(shù)為主的臨床綜合治療方法，但術(shù)后5年生存率僅維持在67%左右，術(shù)后復發(fā)、轉(zhuǎn)移是影響患者預后的主要原因[2]。因此，從分子生物學角度深入探討子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展及預后的敏感基因已成為臨床研究重點。已有研究證實，黏蛋白4(MUC4)、CUE結(jié)構(gòu)域蛋白2(CUEDC2)均具有癌基因特性，在多種惡性腫瘤中異常表達[3-4]。目前，關(guān)于子宮內(nèi)膜癌組織MUC4、CUEDC2表達水平及其臨床意義的報道較少。微小RNA(miRNA)是腫瘤領(lǐng)域研究熱點，可能為惡性腫瘤早期診斷和預后評估提供新方向[5]。miR-193a-5p是目前學者關(guān)注的新焦點，關(guān)于其功能的報道還較少，初步研究發(fā)現(xiàn)，miR-193a-5p在前列腺癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤中低表達[6-7]。而miR-193a-5p對子宮內(nèi)膜癌生物學行為的影響尚需進一步探討?；诖?，本研究探討MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達水平及其與病理特征、預后的關(guān)系，旨在為相關(guān)機制研究提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年5月至2016年5月在本院接受手術(shù)治療的84例子宮內(nèi)膜癌患者及84例子宮內(nèi)膜息肉患者的病歷資料進行回顧性研究。納入標準：患者均經(jīng)病理檢查明確診斷，且術(shù)前未進行放、化療或靶向等任何形式的治療；子宮內(nèi)膜癌組織及其匹配的癌旁組織、子宮內(nèi)膜息肉組織標本、病歷資料及隨訪資料完整。排除標準：遠處轉(zhuǎn)移患者；合并其他惡性腫瘤、急慢性炎癥、血液性疾病患者；合并心、肝、腎等重要臟器嚴重病變患者；嚴重感染性疾病或免疫性疾病患者；妊娠期或哺乳期患者；隨訪過程中失訪患者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1資料收集 通過查閱電子病歷獲得患者臨床病理特征信息，包括年齡、腫瘤最大徑、腫瘤分化程度、組織類型、肌層浸潤深度、FIGO分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。

1.2.2MUC4、CUEDC2檢測 采用免疫組織化學法進行檢測。甲醛固定處理子宮內(nèi)膜癌組織、癌旁組織及子宮內(nèi)膜息肉組織標本，石蠟包埋，連續(xù)切片(4 μm)，脫蠟至水，高溫抗原修復15 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗3次(每次5 min)，二甲苯脫蠟，0.3%過氧化氫孵育10 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶。再次PBS沖洗3次(每次5 min)，山羊血清封閉，室溫下孵育30 min，分別滴加一抗鼠抗人MUC4抗體、CUEDC2抗體(均購自美國Abcam公司，MUC4抗體稀釋比1∶800，CUEDC2抗體稀釋比1∶300)，4 ℃過夜孵育，加入相應二抗，室溫下孵育2 h。DAB顯色3 min，蘇木素復染，梯度脫水封片。細胞染色強度評分標準：不著色、顏色淺、顏色深分別為0分、1分、2分；陽性細胞評分標準：無著色細胞、陽性細胞數(shù)<25%、陽性細胞數(shù)25%～50%、陽性細胞數(shù)>50%分別為0分、1分、2分、3分。以細胞染色強度評分×陽性細胞評分為最終結(jié)果，0～2為陰性，3～6為陽性。

1.2.3miR-193a-5p檢測 采用Trizol法提取子宮內(nèi)膜癌組織、癌旁組織及子宮內(nèi)膜息肉組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，后進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增，擴增條件：95 ℃預變性5 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40個循環(huán)，以U6為內(nèi)參。miR-193a-5p上游引物為5′-TGGGTCTTTGCGGGC-3′，下游引物為5′-GAATACCTCGGACCCTGC-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′，下游引物為5′-AACGATTCACGAATTTGCGT-3′。結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行分析。

1.2.4隨訪 對患者進行隨訪，隨訪時間5年，記錄隨訪期間患者預后(死亡、生存)情況。

1.3觀察指標 (1)記錄子宮內(nèi)膜癌組織、癌旁組織及子宮內(nèi)膜息肉組織MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表達情況。(2)比較不同病理特征子宮內(nèi)膜癌組織MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表達情況。(3)分析不同MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表達情況子宮內(nèi)膜癌患者的生存情況。(4)分析子宮內(nèi)膜癌患者預后影響因素。

2 結(jié) 果

2.1子宮內(nèi)膜癌組織、癌旁組織及子宮內(nèi)膜息肉組織MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表達情況 子宮內(nèi)膜癌組織MUC4、CUEDC2陽性表達率高于癌旁組織、子宮內(nèi)膜息肉組織，miR-193a-5p表達水平低于癌旁組織、子宮內(nèi)膜息肉組織(P<0.05)；癌旁組織和子宮內(nèi)膜息肉組織MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p的表達情況差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 子宮內(nèi)膜癌組織、癌旁組織及子宮內(nèi)膜息肉組織MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表達情況

2.2不同病理特征子宮內(nèi)膜癌組織MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表達情況比較 不同年齡、腫瘤最大徑、腫瘤分化程度、組織類型子宮內(nèi)膜癌組織MUC4、CUEDC2陽性表達率及miR-193a-5p表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與肌層浸潤深度<1/2、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌組織比較，肌層浸潤深度≥1/2、FIGO分期Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌組織MUC4、CUEDC2陽性表達率更高，miR-193a-5p表達水平更低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 癌組織MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表達與病理特征的相關(guān)性

續(xù)表2 癌組織MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表達與病理特征的相關(guān)性

2.3不同MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表達情況子宮內(nèi)膜癌患者5年預后情況比較 以子宮內(nèi)膜癌組織miR-193a-5p表達水平均值為界，≥0.76為高表達，<0.76為低表達。子宮內(nèi)膜癌組織MUC4、CUEDC2陽性患者5年生存率低于陰性患者(χ2=4.235、7.090，P=0.040、0.008)，miR-193a-5p低表達患者5年生存率低于高表達患者(χ2=4.495，P=0.034)。見表3、圖1。

注：A、B、C分別為不同MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表達情況子宮內(nèi)膜癌患者的生存曲線。圖1 子宮內(nèi)膜癌患者生存曲線

表3 不同MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表達情況子宮內(nèi)膜癌患者5年預后情況比較[n(%)]

2.4子宮內(nèi)膜癌患者預后影響因素的單因素分析 肌層浸潤深度、FIGO分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是子宮內(nèi)膜癌患者預后的影響因素(P<0.05)。見表4。

表4 子宮內(nèi)膜癌患者預后影響因素的單因素分析[n(%)]

續(xù)表4 子宮內(nèi)膜癌患者預后影響因素的單因素分析[n(%)]

2.5子宮內(nèi)膜癌患者預后影響因素的多因素分析 以子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)后5年生存情況為因變量，將表3、4中差異有統(tǒng)計學意義的項目為自變量建立Cox回歸模型，具體賦值見表5。Cox回歸模型分析結(jié)果顯示，將肌層浸潤深度、FIGO分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移控制后，陽性的MUC4、CUEDC2及低表達的miR-193a-5p是子宮內(nèi)膜癌患者5年內(nèi)死亡的獨立危險因素(HR=3.582、4.171、0.390，P<0.05)。見表6。

表5 子宮內(nèi)膜癌患者預后影響因素賦值表

表6 子宮內(nèi)膜癌患者預后影響因素的Cox回歸模型分析

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機制尚不清楚，目前普遍認為是多因素、多機制共同作用的結(jié)果，涉及多種癌基因、抑癌基因、核苷酸序列、轉(zhuǎn)錄因子等的改變[8]。目前，子宮內(nèi)膜癌治療還存在巨大挑戰(zhàn)，尤其轉(zhuǎn)移性及復發(fā)性子宮內(nèi)膜癌患者[9]。因此，仍需深入研究子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，為患者臨床診治及預后改善提供理論依據(jù)。

黏蛋白(MUCs)是一種高相對分子質(zhì)量的糖蛋白，在機體中廣泛存在，具有細胞保護和潤滑作用[10]。MUC4是跨膜型MUCs家族成員，位于人染色體3q29，由26個外顯子組成，具有癌基因特性，參與惡性腫瘤發(fā)生和進展過程[11]。CUEDC2是一種含CUE結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，參與細胞周期、炎癥等多種生物學過程[12]。新近研究發(fā)現(xiàn)，CUEDC2在乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤組織中高表達[13]。目前，關(guān)于MUC4、CUEDC2在子宮內(nèi)膜癌中表達情況的研究較少，它們的作用機制尚未完全明確。本研究顯示，子宮內(nèi)膜癌組織MUC4陽性表達率高于癌旁組織(P<0.05)，且與腫瘤肌層浸潤深度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。MUC4參與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的可能機制：MUC4含3個類表皮細胞生長因子樣結(jié)構(gòu)域，均可結(jié)合ERBB3形成穩(wěn)定異源二聚體，進而激活MAPK、JNK和STAT-1等信號通路，促進腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移；MUC4還能調(diào)節(jié)N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白信號通路，促進上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化；此外，MUC4中大的寡糖側(cè)鏈可形成空間障礙，抑制正常細胞與細胞、細胞與基質(zhì)及配體與受體的相互作用[14-15]。同時，子宮內(nèi)膜癌組織中CUEDC2也存在高表達(P<0.05)，且與病理特征有關(guān)(P<0.05)，考慮原因：CUEDC2表達水平升高可引起抑癌基因APC編碼蛋白功能失活，導致染色體錯聚和非整倍性，對腫瘤形成及進展起到促進作用，并促進p38磷酸化，激活絲裂原活化蛋白激酶途徑，進而促進腫瘤細胞惡性增殖，還可通過激活應答細胞因子信號傳導核因子κB，調(diào)控腫瘤進展[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，癌組織MUC4、CUEDC2陽性表達的子宮內(nèi)膜癌患者5年生存率降低(P<0.05)，且陽性的MUC4、CUEDC2是子宮內(nèi)膜癌患者5年內(nèi)死亡的獨立危險因素(HR=3.582、4.171，P<0.05)。主要可能的原因是隨MUC4、CUEDC2表達提升，子宮內(nèi)膜癌惡性進展，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險升高，患者生存情況往往更差。因此，臨床針對上述影響因素采取針對性干預措施，有望最大程度改善患者預后。

基因的表達和結(jié)構(gòu)改變是導致正常組織細胞惡性轉(zhuǎn)化重要因素[18]。近年大量研究表明，非編碼miRNA在調(diào)節(jié)惡性腫瘤基因表達中發(fā)揮重要作用[19-20]。miR-193a-5p是新近報道的與腫瘤密切相關(guān)的miRNA[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中miR-193a-5p表達下調(diào)(P<0.05)，且與患者肌層浸潤深度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預后不良相關(guān)(P<0.05)，表明miR-193a-5p參與子宮內(nèi)膜癌的惡性進展。子宮內(nèi)膜癌組織中陰陽因子-1(YY1)高表達，且在體內(nèi)和體外均可促進癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移[22]。而miR-193a-5p可下調(diào)YY1表達，抑制癌細胞生長能力[23]。長鏈非編碼RNA腫瘤易感候選者9(IncRNA CASC9)是子宮內(nèi)膜癌相關(guān)lncRNA，可促進腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[24]。王婷婷等[25]采用StarBase v2.0在線軟件預測發(fā)現(xiàn)IncRNACASC9與miR-193a-5p存在結(jié)合位點。推測miR-193a-5p可能是lncRNA CASC9的內(nèi)源競爭RNA。因此，miR-193a-5p在子宮內(nèi)膜癌中可能發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌組織中MUC4、CUEDC2高表達，miR-193a-5p低表達，它們均與腫瘤肌層浸潤深度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。特異性阻斷MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p的病理效應有望成為子宮內(nèi)膜癌治療的新方法，可能為靶向治療藥物開發(fā)提供依據(jù)。