T-ARMS PCR多重檢測方法研究*

陶明麗，李瑩雪，李 豪，張 威，李傳宇，周連群，李金澤▲

1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院(蘇州),江蘇蘇州 215123；2.中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所,江蘇蘇州 215163

肝細(xì)胞癌(簡稱肝癌)是一種高度惡性腫瘤。2020年中國癌癥中肝癌發(fā)病率位居男性第3位,女性第7位,死亡率位居惡性腫瘤相關(guān)死亡的第3位[1-2]。到2030年，將有超過100萬人死于肝癌[3]，使其成為全球最致命的癌癥類型之一。因此，肝癌的早期診斷、病情監(jiān)測及預(yù)后評(píng)估是提高肝癌患者治愈率，降低病死率的關(guān)鍵。肝癌的診斷常使用甲胎蛋白(AFP)水平檢測或使用無創(chuàng)成像檢查，如超聲檢查、計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)和磁共振(MRI)，但是這些方法由于靈敏度低，只有在惡性腫瘤晚期時(shí)才能檢測到腫瘤的存在，從而導(dǎo)致治療方案選擇有限且預(yù)后不佳[4]。通過早期檢測和監(jiān)測治療后可能的肝癌復(fù)發(fā)，可以顯著提高治療有效性。肝細(xì)胞癌變離不開單核苷酸多態(tài)性(SNP)突變，SNP檢測常用Taqman探針基因分型法，等位基因富集法則是新興的一種方法[5]。等位基因富集法能在大量野生型等位基因存在的情況下檢測突變型等位基因，減弱野生型背景的干擾，具有用于臨床診斷的潛力。

等位基因富集可以通過去除野生型等位基因或通過選擇性擴(kuò)增突變型等位基因來實(shí)現(xiàn)。振蕩電泳能夠有效去除野生型序列[6-7]；野生型特異探針和雙鏈特異核酸酶被用于選擇性降解野生型DNA分子[8]，通過耗盡野生型等位基因來改善突變型等位基因的擴(kuò)增。突變型等位基因的選擇性富集通常是通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)實(shí)現(xiàn)的，其中野生型DNA序列PCR擴(kuò)增被阻止，其方法包括PCR阻斷劑[9]、鎖核酸和肽核酸鉗PCR[10-11]、改良型完全富集低變性溫度下的復(fù)合PCR(ICE-COLD PCR)[12-13]和阻斷劑置換擴(kuò)增[14]。盡管這些等位基因富集的方法已多種多樣，但是鮮有能實(shí)現(xiàn)多重基因突變檢測的。

多重PCR檢測技術(shù)僅在一支反應(yīng)管中就可檢測出多個(gè)靶標(biāo)，使得檢測時(shí)間和檢測試劑用量減少，具有高效便捷、經(jīng)濟(jì)節(jié)約、特異度和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，具有普通單重PCR方法不可比擬的優(yōu)越性[15]。肝癌相關(guān)的基因突變位點(diǎn)是多個(gè)的，難以預(yù)測的，若能一次檢測多個(gè)位點(diǎn)，將對肝癌的臨床診治帶來極大便捷。因此，多重PCR檢測技術(shù)對肝癌診治及臨床研究有重大意義和價(jià)值。

本研究提出有錯(cuò)配的加尾雙引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR(T-ARMS PCR)的方法，該方法通過熔解曲線和擴(kuò)增曲線分析即可得出結(jié)果，是一種能實(shí)現(xiàn)多重檢測的等位基因富集方法，能有效地抑制野生型DNA序列的擴(kuò)增，達(dá)到富集突變型DNA序列的目的，同時(shí)能解決多重情況下引物二聚體干擾的問題，為動(dòng)態(tài)監(jiān)測肝癌患者的病情狀況、早期檢測肝細(xì)胞癌變及肝癌腫瘤復(fù)發(fā)的實(shí)時(shí)評(píng)估等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 本研究使用的質(zhì)粒是由安徽通用生物股份有限公司合成的野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒。

1.2儀器與試劑 本研究使用的引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，Taq Pro HS Universal Probe Master Mix購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司，EveGreen(20× in water)購于上海翌圣生物科技有限公司，ABI QuantStudio7實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)儀購于美國Applied Biosystems公司。

1.3方法

1.3.1單重體系qPCR 分別對肝細(xì)胞RNA的TP53 R249S、TP53 R273H、CTNNB1 S45F 3個(gè)基因突變位點(diǎn)進(jìn)行分析，檢測均采用染料法qPCR，樣品均設(shè)置3次重復(fù)和空白對照(NTC)，質(zhì)粒濃度均為103copy/μL。染料是EveGreen，其具有極高的靈敏度且PCR抑制性極小，非常適合多重PCR及高分辨率熔解曲線(HRM)的分析。均采用30 μL體系，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s預(yù)變性1個(gè)循環(huán)；然后按95 ℃ 10 s變性，60 ℃ 30 s退火/延伸，共40個(gè)循環(huán)；默認(rèn)擴(kuò)增曲線和熔解曲線熒光采集。引物序列5′端不加一段DNA序列(Tail Free Primer)，采用擴(kuò)增受阻突變體系PCR(ARMS PCR)引物設(shè)計(jì)原理，具體序列見表1。引物序列5′端加一段相同的DNA序列(Tailed Primer)，引物序列見表2。

表1 試驗(yàn)所用Tail Free Primer

表2 試驗(yàn)所用Tailed Primer

1.3.2三重體系qPCR結(jié)果對照 T-ARMS PCR研究方案的原理如圖1所示。將Tail Free Primer三重體系與Tailed Primer三重體系做對比。分別將3對Tail Free Primer及其對應(yīng)模板、3對Tailed Primer及其對應(yīng)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均以野生型模板和突變型模板作對照，采用30 μL體系，qPCR儀器設(shè)置的程序與1.3.1相同，將兩種三重體系擴(kuò)增結(jié)果做對比分析。

圖1 T-ARMS PCR多重檢測方法原理圖

1.3.3突變負(fù)荷的檢測限及特異性檢測 將野生型質(zhì)粒與突變型質(zhì)粒以不同比例混合，野生型質(zhì)粒終濃度為104copy/μL，得到突變型質(zhì)粒與野生型質(zhì)粒的濃度比(突變負(fù)荷)分別為0.00%、0.05%、0.10%、0.25%、1.00%的標(biāo)本，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過擴(kuò)增曲線Ct值及熔解曲線來分析在大背景為野生型質(zhì)粒的情況下該方法對突變型質(zhì)粒突變負(fù)荷的檢測限，比較野生型質(zhì)粒和有突變負(fù)荷的野生型質(zhì)粒的Ct值大小，就可得出突變負(fù)荷的檢測限，同時(shí)觀察引物特異性。每份標(biāo)本進(jìn)行3次重復(fù)平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.4T-ARMS PCR與Taqman探針基因分型方法的對比 Taqman探針基因分型方法的具體引物及探針序列如表3所示，其針對的突變位點(diǎn)是TP53 R249S。反應(yīng)體系有純合子野生型、純合子突變型、雜合子，均加入兩種熒光探針，采用30 μL探針法qPCR，樣品均設(shè)置3次重復(fù)和NTC。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s預(yù)變性1個(gè)循環(huán)；然后按95 ℃ 10 s變性，60 ℃ 30 s退火/延伸，共45個(gè)循環(huán)；最后60 ℃，1 min延伸；默認(rèn)熒光采集程序。

表3 針對突變位點(diǎn)TP53 R249S的基因分型引物及探針序列

2 結(jié) 果

2.13個(gè)基因突變位點(diǎn)Tailed Primer單重體系擴(kuò)增結(jié)果 TP53 R249S突變型質(zhì)粒擴(kuò)增的Ct值為24.23，野生型質(zhì)粒無Ct值(圖2A)；突變型質(zhì)粒解鏈溫度(Tm)為83.06 ℃，NTC無峰值(圖2B)。CTNNB1 S45F突變型質(zhì)粒擴(kuò)增的Ct值為26.99，野生型質(zhì)粒Ct值為38.02(圖2C)；突變型質(zhì)粒Tm為81.96 ℃，NTC無峰值(圖2D)。TP53 R273H突變型質(zhì)粒擴(kuò)增的Ct值為29.52，野生型質(zhì)粒Ct值為39.02(圖2E)；突變型質(zhì)粒Tm為86.45 ℃，NTC無峰值(圖2F)；3個(gè)基因突變位點(diǎn)Tailed Primer單重體系突變型質(zhì)粒的擴(kuò)增均優(yōu)于野生型質(zhì)粒，野生型質(zhì)粒的擴(kuò)增均被有效抑制。

注：ΔRn為每點(diǎn)測量的熒光強(qiáng)度與熒光基線強(qiáng)度的差值。A、B分別為TP53 R249S的單重體系擴(kuò)增曲線、熔解曲線；C、D分別為CTNNB1 S45F的單重體系擴(kuò)增曲線、熔解曲線；E、F分別為TP53 R273H的單重體系擴(kuò)增曲線、熔解曲線。圖2 三個(gè)基因突變位點(diǎn)的Tailed Primer單重體系擴(kuò)增結(jié)果

2.2三重體系qPCR熔解曲線比較 在Tail Free Primer三重體系熔解曲線(圖3A)中，3個(gè)突變型質(zhì)粒反應(yīng)體系熔解曲線出現(xiàn)2個(gè)明顯的峰值且有引物二聚體，未能體現(xiàn)出3個(gè)峰值，2個(gè)Tm分別為84.3 ℃和88.4 ℃；3個(gè)野生型質(zhì)粒反應(yīng)體系熔解曲線出現(xiàn)的峰值為引物二聚體，野生型質(zhì)粒幾乎未擴(kuò)增；NTC有引物二聚體的峰值出現(xiàn)，表明Tail Free Primer三重體系中有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。在Tailed Primer三重體系熔解曲線(圖3B)中，3個(gè)突變型質(zhì)粒反應(yīng)體系熔解曲線出現(xiàn)明顯的3個(gè)峰值，Tm依次為81.11 ℃、82.36 ℃、86.35 ℃，分別對應(yīng)CTNNB1 S45F、TP53 R249S、TP53 R273H，該三重體系的3個(gè)Tm與單重體系的Tm均吻合；野生型質(zhì)粒和NTC反應(yīng)體系熔解曲線均未出現(xiàn)峰值，無引物二聚體，無非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。突變型質(zhì)粒擴(kuò)增明顯優(yōu)于野生型質(zhì)粒擴(kuò)增。

注：A為Tail Free Primer三重體系熔解曲線；B為Tailed Primer三重體系熔解曲線。圖3 三重體系qPCR熔解曲線結(jié)果

2.33個(gè)基因突變位點(diǎn)突變負(fù)荷的檢測限及特異性檢測結(jié)果 3個(gè)基因突變位點(diǎn)突變負(fù)荷的檢測限檢測結(jié)果如表4所示，將沒有添加突變型質(zhì)粒與添加了不同比例突變型質(zhì)粒的Ct值進(jìn)行比較，表中Ct值均為3個(gè)重復(fù)平行實(shí)驗(yàn)的均值，TP53 R249S和R273H突變負(fù)荷的最低檢測限可達(dá)0.05%，CTNNB1 S45F突變負(fù)荷的最低檢測限可達(dá)0.10%。熔解曲線均為單一峰，Tm值唯一，特異性好。

表4 3個(gè)基因突變位點(diǎn)不同突變負(fù)荷的Ct值

2.4T-ARMS PCR與Taqman探針基因分型方法的結(jié)果比較 TP53 R249S基因突變位點(diǎn)T-ARMS PCR結(jié)果顯示，野生型與突變型質(zhì)粒濃度均為103copy/μL，突變型質(zhì)粒擴(kuò)增明顯優(yōu)于野生型，野生型質(zhì)粒擴(kuò)增被抑制(圖4A)。TP53 R249S基因突變位點(diǎn)Taqman探針基因分型方法擴(kuò)增結(jié)果顯示，野生型與突變型質(zhì)?；旌系臐舛染鶠?03copy/μL，以1∶1混合得到雜合子，2個(gè)等位基因的探針分別標(biāo)記FAM和VIC的熒光，野生型和突變型質(zhì)粒的Ct值的大小相差1.8，擴(kuò)增效率差異不大(圖4B)。

注：ΔRn為每點(diǎn)測量的熒光強(qiáng)度與熒光基線強(qiáng)度的差值。A為T-ARMS PCR方案的擴(kuò)增曲線；B為Taqman探針基因分型方法的擴(kuò)增曲線。圖4 TP53 R249S的T-ARMS PCR與Taqman探針基因分型方法的擴(kuò)增曲線

3 討 論

在T-ARMS PCR研究方案中，如圖1A所示，引物均增加相同的DNA序列，若兩引物互補(bǔ)延伸，由于引物尾巴序列相同，提高退火溫度時(shí)則形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，阻止引物二聚體的擴(kuò)增。圖1B是T-ARMS PCR方法抑制野生型等位基因擴(kuò)增的原理圖，傳統(tǒng)的ARMS PCR需要兩對引物，本研究T-ARMS PCR方法只用一對引物，進(jìn)一步減少引物二聚體形成的可能。引入錯(cuò)配堿基能阻止野生型等位基因的擴(kuò)增，起到富集突變型等位基因的目的。

本研究以TP53 R249S、TP53 R273H、CTNNB1 S45F 3個(gè)基因突變熱點(diǎn)進(jìn)行研究，具有一定實(shí)際意義。TP53的表達(dá)與肝癌中的R249S突變顯著相關(guān)[16-17]。而R273H是TP53上與肝癌相關(guān)的另一個(gè)突變熱點(diǎn)。CTNNB1是肝癌最顯著的變異基因之一，其編碼β-catenin蛋白，參與Wnt信號(hào)通路調(diào)控，對于肝癌的機(jī)制發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用。有報(bào)道顯示，肝癌中大約90%的CTNNB1突變發(fā)生在兩個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域，密碼子32～37和41～45，分別占肝癌中所有CTNNB1突變的55%和34%[18-19]，S45F為其突變熱點(diǎn)之一[20]。

多重PCR檢測技術(shù)是一種簡單和經(jīng)濟(jì)的基因突變檢測方法，能在一定程度上解決多重PCR產(chǎn)生引物二聚體的問題。引物序列5′端加一段DNA序列的方法，能調(diào)控產(chǎn)物Tm使不同產(chǎn)物更易區(qū)分，只擴(kuò)增突變型等位基因，使得在多重情況下能減少Tm通道占用，增加檢測靶標(biāo)數(shù)。本研究中，采用ARMS PCR的原理設(shè)計(jì)上游引物，由于多重PCR擴(kuò)增始終存在引物二聚體的干擾，故采用Tailed Primer的方法，來消除引物二聚體的影響[21]。ARMS PCR是檢測SNP基因型的一種簡單和經(jīng)濟(jì)的方法，傳統(tǒng)的ARMS PCR使用4個(gè)引物，擴(kuò)增完成后進(jìn)行凝膠電泳獲取結(jié)果[22]。本研究在此基礎(chǔ)上對該方法進(jìn)行了一定的創(chuàng)新，使用一對引物即可，正向引物引入錯(cuò)配堿基使野生型序列擴(kuò)增受到抑制，只擴(kuò)增突變型，結(jié)合熒光定量PCR染料法分析其擴(kuò)增曲線及熔解曲線可得到最后結(jié)果。相同反應(yīng)體系，質(zhì)粒濃度均為103copy/μL，只是模板差異，野生型質(zhì)粒擴(kuò)增曲線的Ct值明顯大于突變型質(zhì)粒的Ct值，NTC無非特異性產(chǎn)物，則可判斷野生型模板擴(kuò)增受到有效抑制，而突變型擴(kuò)增產(chǎn)物被放大。另外，本研究將Tail Free Primer體系和Tailed Primer體系進(jìn)行比較，可以明確引物5′端加尾能阻止引物二聚體的產(chǎn)生。

Taqman探針基因分型方法是最常見的SNP檢測方法，通過相應(yīng)儀器檢測熒光值的變化就可以得到基因分型的結(jié)果。該方法每個(gè)位點(diǎn)需要合成一對探針，探針合成費(fèi)用高，且野生型和突變型的擴(kuò)增效率差別不大，每次只能檢測一個(gè)SNP位點(diǎn)，通量低。而本研究使用的方法能有效抑制野生型的擴(kuò)增從而減少一個(gè)通道占用，可同時(shí)檢測多個(gè)SNP位點(diǎn)，節(jié)約時(shí)間和成本，且操作簡便。

本研究中3個(gè)突變基因位點(diǎn)突變負(fù)荷的檢測限與特異性檢測結(jié)果顯示，TP53 R249S和TP53 R273H突變負(fù)荷的最低檢測限可達(dá)到0.05%，CTNNB1 S45F突變負(fù)荷的最低檢測限可達(dá)0.10%，且特異性均表現(xiàn)良好，無引物二聚體干擾。通常，qPCR突變負(fù)荷的檢測限低至1%，ARMS PCR低至0.1%[23]，本研究中T-ARMS PCR突變負(fù)荷的檢測限可達(dá)0.10%。未來計(jì)劃進(jìn)一步將該方法應(yīng)用于臨床標(biāo)本，獲得更真實(shí)可靠的結(jié)果。

本研究方法還有待改進(jìn)，下一步實(shí)驗(yàn)方案應(yīng)考慮將其應(yīng)用于多種臨床標(biāo)本，并采用全基因組測序的方法對T-ARMS PCR實(shí)驗(yàn)方法的突變負(fù)荷的檢測限、特異性和重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)對于更多重的檢測方案和靈敏度的提高方面還可以進(jìn)行進(jìn)一步的探索。在患者發(fā)病早期甚至還未發(fā)病前進(jìn)行干預(yù)，有利于患者得到及時(shí)的治療和減少不恰當(dāng)?shù)脑\療，提高生存率。而高靈敏度的檢測方法帶來的也可能是更多的干擾，多重PCR的非特異性擴(kuò)增及引物二聚體的存在等問題的解決仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述，運(yùn)用T-ARMS PCR熔解曲線的方法進(jìn)行一管三重檢測，能有效檢測到目的基因突變，抑制野生型模板的擴(kuò)增，并區(qū)分不同的基因突變位點(diǎn)。同時(shí)Tailed Primer設(shè)計(jì)減少了多重情況下引物二聚體的產(chǎn)生。該方法有望為臨床中肝癌的早期篩查、預(yù)后評(píng)估、病情監(jiān)測提供理論依據(jù)。