硫酸-甲醇衍生化對煙草中乙酰丙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定的影響

劉瑞紅，謝復(fù)煒，王曉瑜，潘立寧*，余晶晶，劉克建，陳滿堂，孫學(xué)輝，黃龍

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001 2.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，武漢市東西湖金山大道1355號 430048

乙酰丙酸又稱γ-戊酮酸，是煙葉酸味特征組分中酸味的主要來源之一［1］。研究表明，乙酰丙酸具有甜香、焦甜香，能夠協(xié)調(diào)煙氣、增加煙氣豐滿度，是煙葉風(fēng)格、質(zhì)量研究的重要指標(biāo)［2-5］，也是美國以及我國煙草制品許可使用的添加劑，因此，準(zhǔn)確測定煙草中乙酰丙酸的含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，用α表示）對了解煙葉內(nèi)在質(zhì)量、改進(jìn)葉組配方和加香加料等具有重要指導(dǎo)意義。因煙草中的有機酸大部分以堿金屬鹽或有機堿鹽的形式存在，只有小部分以游離形式存在，所以檢測時一般先進(jìn)行衍生化處理，再使用GC法進(jìn)行分離分析［6-10］。硫酸-甲醇甲酯化-GC法由于具有原料易得、方法簡單可控、結(jié)果準(zhǔn)確度高等優(yōu)點，已成為檢測煙草中包括乙酰丙酸在內(nèi)的難揮發(fā)酸和高級脂肪酸的最常用分析方法之一。如張霞等［11］采用硫酸-甲醇甲酯化-固相萃取富集-氣相色譜法測定了煙草中乙酰丙酸等9種有機酸；郭明全等［12］利用硫酸-甲醇甲酯化-GC-FID法考察了部位、品種、海拔高度對四川煙區(qū)煙葉中乙酰丙酸等有機酸的影響；景延秋等［13］利用硫酸-甲醇甲酯化-GC-MS法檢測了烤煙不同葉位葉片中乙酰丙酸等有機酸的含量。然而，相關(guān)研究表明，生物質(zhì)中的糖類物質(zhì)經(jīng)酸催化水解可產(chǎn)生乙酰丙酸［14-16］。煙草作為一種天然生物質(zhì)，含糖量較高，采用硫酸-甲醇對煙草中乙酰丙酸進(jìn)行衍生化處理時，糖類物質(zhì)可能會隨之水解，進(jìn)而對乙酰丙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（用α乙酰丙酸表示）的測定產(chǎn)生影響。目前測定煙草中α乙酰丙酸均未考慮硫酸-甲醇衍生化時糖類水解的影響?；诖?，本研究中對硫酸-甲醇甲酯化檢測煙草中α乙酰丙酸的過程進(jìn)行探索，分析了甲酯化時間和溫度等對檢測結(jié)果的影響；探究了煙草中5種常見糖類化合物對α乙酰丙酸的貢獻(xiàn)；比較了煙草實際樣品中果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（α果糖）和蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（α蔗糖）與α乙酰丙酸的關(guān)系，旨在為煙草中乙酰丙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的準(zhǔn)確測定提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

263個煙葉樣品（2019年從全國八大香型煙葉產(chǎn)區(qū)的80個取樣點采集的X2F、C3F、B3F 3種等級煙葉）。

乙酰丙酸（97%），己二酸（99%），十六酸（97%）（日本東京化成工業(yè)株式會社）；丁二酸（99%），蘋果酸（99%）（美國ThermoFisher公司）；D-（-）-果糖（99%），D-（+）-葡萄糖（99%），D-（+）-蔗糖（99%），肌醇（99%）（北京百靈威科技有限公司）；甲醇（色譜純，99.9%），二氯甲烷（色譜純，99%），D-（+）-麥芽糖（99%）（德國Merck集團）；蒸餾水（香港屈臣氏集團）；十二水合磷酸氫二鈉（AR，99%），無水硫酸鈉（AR，99%），濃硫酸（AR，95%～98%）（上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（HPLC級，99.9%）（北京迪馬科技有限公司）；氨水（HPLC級，99.9%）（德國CNW公司）。

CP2245電子天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius公司）；HH-ZK4恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；EYELA MMV-1000 W分液漏斗振蕩器（日本東京理化器械株式會社）；HY-8機械振蕩儀（常州國華電器有限公司）；6890N氣相色譜儀（配氫離子火焰檢測器），6890N氣相色譜-5977B質(zhì)譜聯(lián)用儀，1200系列高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；ELSD2000ES蒸發(fā)光散射檢測器（美國Alltech公司）；有機相濾膜，水相濾膜（0.22μm，上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

（1）衍生化試劑。衍生化試劑為5%（體積分?jǐn)?shù)）硫酸-甲醇溶液，配制時采用量筒準(zhǔn)確量取3 800 mL甲醇至5 000 mL燒杯中，量取200 mL濃硫酸，邊攪拌邊加入，冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，常溫密封放置。

（2）Na2HPO4-NaCl混合水溶液。分別稱取90 g Na2HPO4·12H2O和40 g NaCl，加入1 000 mL水，采用630 W的功率超聲，邊超聲邊攪拌，至完全溶解。

（3）有機酸標(biāo)準(zhǔn)工作液。內(nèi)標(biāo)溶液：稱取1.00 g己二酸至150 mL燒杯中，加入約40 mL甲醇超聲至完全溶解，放置至室溫后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容。系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：稱取1.00 g乙酰丙酸（其他有機酸標(biāo)準(zhǔn)溶液稱量：丁二酸0.02 g、蘋果酸1.00 g、十六酸0.10 g）至150 mL燒杯中，加入約40 mL甲醇超聲至完全溶解，放置至室溫后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到乙酰丙酸儲備液；分別移取上述儲備液125μL、250μL、500μL、1 mL、2 mL、5 mL于不同的50 mL容量瓶中，用硫酸-甲醇溶液定容，搖勻，然后轉(zhuǎn)移至100 mL平底燒瓶中，加入300μL內(nèi)標(biāo)溶液和50 mL硫酸-甲醇溶液，將燒瓶與冷凝管緊密連接，在80℃水浴中回流120 min，冷卻至室溫，得到甲酯化溶液。取5 mL甲酯化溶液至125 mL分液漏斗中，依次加入10 mL Na2HPO4-NaCl混合水溶液和7.5 mL二氯甲烷，于分液漏斗振蕩器上以220 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩10 min。振蕩結(jié)束后，取下分液漏斗，靜置10 min，然后取下層二氯甲烷溶液至盛有4.00 g Na2SO4的50 mL錐形瓶中；向分液漏斗中繼續(xù)加入7.5 mL二氯甲烷，重復(fù)萃取，合并兩次萃取液。搖動錐形瓶，使萃取液與Na2SO4充分接觸，然后機械振蕩30 min，振蕩頻率為180 r/min。將萃取液過有機相濾膜，得到系列濃度有機酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

（4）糖混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。稱取約0.12 g果糖、0.12 g葡萄糖、0.08 g肌醇、0.08 g蔗糖、0.08 g麥芽糖，精確至0.1 mg，置于150 mL燒杯中，加入約50 mL水至完全溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度線得到糖類儲備液。依次移取上述儲備液0.312 5、0.625 0、1.250、2.500、5.000 mL于不同的10 mL容量瓶中，用水定容，搖勻，得到系列濃度糖混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品前處理及分析

（1）硫酸-甲醇衍生化。稱取1.00 g煙末樣品（或100 mg糖標(biāo)準(zhǔn)品）至100 mL平底燒瓶中，然后同1.2.1節(jié)（3）中加入300μL內(nèi)標(biāo)和50 mL硫酸-甲醇溶液，于80℃水浴中回流120 min，冷卻至室溫后即得到甲酯化溶液。

（2）提取。同1.2.1節(jié)（3）中步驟：取5 mL上述甲酯化溶液至125 mL分液漏斗中，依次加入10 mL Na2HPO4-NaCl混合水溶液和7.5 mL二氯甲烷，以220 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩10 min后，靜置10 min，然后將二氯甲烷溶液轉(zhuǎn)移至盛有4.00 g Na2SO4的50 mL錐形瓶中；重復(fù)萃取后，合并兩次萃取液。萃取液與Na2SO4充分接觸后，再以180 r/min的頻率機械振蕩30 min。將萃取液過有機相濾膜后，采用GC-FID法分析。

（3）糖含量測定。稱取0.10 g煙末樣品，置于100 mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入50 mL水，超聲萃取30 min，取2 mL超聲后溶液，經(jīng)水相濾膜過濾后，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定。

1.2.3 儀器條件

（1）GC-FID法。色譜柱：DB-5MS（60 m×0.25 mm×0.25μm）石英毛細(xì)管柱；進(jìn)樣量：1μL；分流比：5∶1；進(jìn)樣口溫度：280℃；載氣：氦氣；載氣流速：1.5 mL/min；程序升溫：40℃（3 min）280℃（30 min）。FID檢測器溫度：280℃；氫氣流速：40 mL/min；空氣流速：400 mL/min；尾吹氣：氦氣，流速30 mL/min。所用氣體純度均為99.999%。

（2）GC-MS法。氣相色譜條件同GC-FID法。離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃；質(zhì)量掃描范圍：29～450 amu；采用NIST17質(zhì)譜庫進(jìn)行色譜峰定性。所用氣體純度均為99.999%。該方法主要用于定性煙草樣品和糖在保留時間13.3 min處的甲酯化產(chǎn)物種類。

（3）高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法。色譜柱：Prevail Carbohydrate ES色譜柱（5μm，250 mm×4.6 mm）；洗脫條件：等度洗脫；流動相：向1 L 72%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈水溶液中加入4 mL氨水，預(yù)混合；流速：0.8 mL/min；柱溫：20℃；進(jìn)樣量：10μL；檢測時間：20 min；檢測器：蒸發(fā)光散射儀；氮氣流速：2.2 L/min，純度99.999%；漂移管溫度：100℃；增益：1。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性分析

已知GC-MS和GC-FID均可用于有機酸甲酯化產(chǎn)物的測定，二者各有優(yōu)缺點。GC-MS選擇性強，可通過MS的特定碎片離子掃描區(qū)分沒有被氣相色譜柱完全分離的物質(zhì)，而GC-FID的測量重復(fù)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于GC-MS［17］。國家計量檢定規(guī)程（JJG 700—2016［18］）要 求GC-FID法的定量重復(fù)性的RSD≤3%，而國家計量技術(shù)規(guī)范（JJF 1164—2006［19］）對GC-MS法測量重復(fù)性要求僅為RSD≤10%。因此，針對需長期測定大量樣品及對測定結(jié)果的重復(fù)性要求較高的情況，在滿足待測物質(zhì)分離度的條件下，優(yōu)先選擇GC-FID法進(jìn)行檢測。本研究中基于大批量、長時間測定有機酸的情況，采用GC-FID法對煙草樣品（2.1～2.3節(jié)所用煙葉樣品為X2F、C3F、B3F 3種等級煙葉均勻混制）經(jīng)硫酸-甲醇甲酯化后的二氯甲烷萃取液進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示，發(fā)現(xiàn)保留時間13.3 min處存在一個面積較大的色譜峰。

圖1 煙草樣品甲酯化產(chǎn)物的GC-FID色譜圖Fig.1 GC-FID chromatogram of methyl esterification product of tobacco sample

基于GC-MS法進(jìn)一步分析煙葉樣品甲酯化后的萃取液，保留時間13.3 min處對應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)譜結(jié)果如圖2a所示。通過檢索NIST17譜庫及與乙酰丙酸標(biāo)準(zhǔn)品的甲酯化產(chǎn)物質(zhì)譜圖（圖2b）比對，確認(rèn)了此化合物為乙酰丙酸甲酯。

圖2 保留時間13.3 min處煙葉樣品甲酯化產(chǎn)物和乙酰丙酸甲酯的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of methyl esterification product of tobacco sample and methyl levulinate at retention time of 13.3 min

為進(jìn)一步確認(rèn)該化合物，分別測定了0.02 g乙酰丙酸、1.00 g煙葉樣品和（0.02 g乙酰丙酸+1.00 g煙葉樣品）三者對應(yīng)的硫酸-甲醇甲酯化產(chǎn)物在保留時間13.3 min處的GC-FID色譜圖，如圖3所示。對保留時間13.3 min處的色譜峰進(jìn)行積分，結(jié)果見表1，發(fā)現(xiàn)向1.00 g煙葉樣品中加入0.02 g乙酰丙酸后，其甲酯化產(chǎn)物在13.3 min處的色譜峰面積明顯增大，且其峰面積大小約為0.02 g乙酰丙酸甲酯化產(chǎn)物和1.00 g煙葉樣品甲酯化產(chǎn)物在此處的色譜峰峰面積之和，進(jìn)一步驗證了此化合物為乙酰丙酸甲酯。

圖3 加標(biāo)實驗中甲酯化產(chǎn)物在保留時間13.3 min處的GC-FID色譜圖Fig.3 GC-FID chromatogram of methyl esterification product at retention time of 13.3 min in spiked experiment

表1 加標(biāo)實驗中甲酯化產(chǎn)物在保留時間13.3 min處的GC-FID色譜峰面積Tab.1 GC-FID chromatographic peak areas of methyl esterification product at retention time of 13.3 min in spiked experiment

2.2 硫酸-甲醇衍生化條件對煙草中乙酰丙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定的影響

如圖4a和圖4b所示，為了分析硫酸-甲醇衍生化條件對煙草中乙酰丙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定的影響，分別測定了衍生化時間為120 min時，不同衍生化溫度（60、70、80℃）條件下以及衍生化溫度為80℃時，不同衍生化時間（60、75、90、105、120 min）條件下煙草樣品中有機酸甲酯化產(chǎn)物的響應(yīng)。結(jié)果表明，衍生化時間從60 min延長到120 min時，乙酰丙酸甲酯的響應(yīng)增加約1倍；衍生化溫度由60℃升至80℃時，乙酰丙酸甲酯響應(yīng)增加約2倍，而煙草樣品中丁二酸、蘋果酸、十六酸等其他有機酸的甲酯化產(chǎn)物的響應(yīng)在上述衍生化時間和溫度范圍內(nèi)變化不大。說明乙酰丙酸的衍生化過程和煙草中其他有機酸相比差異較大。

圖4 不同衍生化時間和溫度下煙草樣品中有機酸甲酯化產(chǎn)物的歸一化響應(yīng)Fig.4 Normalized response of methyl esterification product of organic acids in tobacco samples at different derivatization time and temperatures

此外，在上述時間和溫度條件下對乙酰丙酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行甲酯化衍生，結(jié)果如圖5所示?？梢?，乙酰丙酸標(biāo)準(zhǔn)品的甲酯化產(chǎn)物響應(yīng)受衍生化時間和溫度影響不大。說明煙草中乙酰丙酸衍生化的異?，F(xiàn)象和煙草樣品基質(zhì)有關(guān)，初步猜測可能是由煙草中糖類水解導(dǎo)致的。

圖5 不同衍生化時間和溫度下乙酰丙酸標(biāo)準(zhǔn)品甲酯化產(chǎn)物的歸一化響應(yīng)Fig.5 Normalized response of methyl esterification product of levulinic acid standard sample at different derivatization time and temperatures

2.3 硫酸-甲醇衍生化條件下糖的水解

為了驗證上述猜測，分別稱取果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和肌醇等5種糖標(biāo)準(zhǔn)品各0.10 g至不同的100 mL平底燒瓶中進(jìn)行硫酸-甲醇衍生化處理，基于GC-FID法分析硫酸-甲醇甲酯化衍生后的二氯甲烷萃取液，結(jié)果見圖6?？梢?，果糖和蔗糖的甲酯化產(chǎn)物在保留時間13.3 min處均存在較大的色譜峰，而葡萄糖、麥芽糖和肌醇在此處沒有色譜峰產(chǎn)生?；贕C-MS法分析甲酯化后的果糖和蔗糖樣品萃取液，保留時間13.3 min處的質(zhì)譜結(jié)果如圖7所示，與圖2比較發(fā)現(xiàn)果糖和蔗糖在硫酸-甲醇衍生化條件下均水解產(chǎn)生了乙酰丙酸甲酯。

圖6 5種糖類樣品甲酯化產(chǎn)物的GC-FID譜圖Fig.6 GC-FID spectra of methyl esterification products of five sugars

圖7 2種糖類在保留時間13.3 min處的甲酯化產(chǎn)物質(zhì)譜圖Fig.7 Mass spectra of methyl esterification products of two sugars at retention time of 13.3 min

此外，采用GC-FID法對不同衍生化時間和溫度下果糖和蔗糖（均為0.10 g）的硫酸-甲醇甲酯化產(chǎn)物分別進(jìn)行分析，結(jié)果如圖8所示，發(fā)現(xiàn)果糖和蔗糖在保留時間13.3 min處的甲酯化產(chǎn)物響應(yīng)隨衍生化時間和溫度的變化趨勢與煙草樣品中乙酰丙酸甲酯的變化趨勢（圖4）相同。進(jìn)一步說明采用硫酸-甲醇甲酯化法測定煙草中的乙酰丙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)時出現(xiàn)的異常現(xiàn)象與果糖和蔗糖有關(guān)。

圖8 不同衍生化時間和溫度下果糖和蔗糖二者對應(yīng)的甲酯化產(chǎn)物的歸一化響應(yīng)Fig.8 Normalized responses of methyl esterification product corresponding to fructose and sucrose at different derivatization time and temperatures

分析上述不同衍生化條件下果糖和蔗糖產(chǎn)生的乙酰丙酸甲酯的GC-FID色譜峰，結(jié)果見表2，發(fā)現(xiàn)同一衍生化條件下，果糖產(chǎn)生的乙酰丙酸甲酯的峰面積約為相同質(zhì)量蔗糖產(chǎn)生的乙酰丙酸甲酯峰面積的2倍。說明相同衍生化條件下，相同質(zhì)量蔗糖轉(zhuǎn)化生成的α乙酰丙酸約為果糖的1/2，原因可能是在硫酸-甲醇衍生化條件下，蔗糖首先水解生成一分子果糖和一分子葡萄糖，而葡萄糖在甲酯化條件下不產(chǎn)生乙酰丙酸，僅果糖能生成乙酰丙酸。

表2 不同衍生化條件下果糖和蔗糖產(chǎn)生的乙酰丙酸甲酯的色譜峰面積Tab.2 Chromatographic peak areas of methyl levulinate produced from fructose and sucrose under different derivatization conditions

2.4 基于實際樣品分析驗證

為了進(jìn)一步驗證上述結(jié)論，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定了263個煙草樣品中的α果糖和α蔗糖，并采用硫酸-甲醇衍生化-GC法測定相應(yīng)煙草樣品中的α乙酰丙酸，比較了相同樣品中2種糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和α乙酰丙酸的關(guān)系。煙草樣品中α果糖遠(yuǎn)大于α蔗糖，因此，先分析α果糖和α乙酰丙酸的關(guān)系，結(jié)果如圖9a所示?？梢姡昧蛩?甲醇衍生化法測得的α乙酰丙酸與α果糖呈正相關(guān)，說明煙草中的果糖對α乙酰丙酸測定結(jié)果存在顯著影響。2.3節(jié)中的實驗結(jié)果表明，蔗糖水解生成的果糖對α乙酰丙酸也有貢獻(xiàn)，因此，將煙草中原有的果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)及蔗糖水解得到的果糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（用α蔗糖/2表示）加和后，分析其與α乙酰丙酸的關(guān)系，結(jié)果如圖9b所示。圖9a和9b的線性擬合方程和相關(guān)系數(shù)見表3，可知，考慮蔗糖水解得到的果糖成分后線性關(guān)系變好，其相關(guān)系數(shù)大于0.900 0，進(jìn)一步驗證了利用硫酸-甲醇衍生化法測得的α乙酰丙酸受煙草中果糖和蔗糖水解生成的果糖的影響，導(dǎo)致測定結(jié)果不能反映煙草中乙酰丙酸的真實值。若要準(zhǔn)確測定煙草中乙酰丙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，可采用無需高溫或酸性前處理條件的高效液相色譜法或離子色譜法［20-22］。

圖9 煙草實際樣品中α乙酰丙酸與α果糖、α果糖+α蔗糖/2的關(guān)系Fig.9 Relationships of levulinic acid with fructose mass fractions，the mass fraction sum of fructose and fructose obtained by sucrose hydrolysis in tobacco samples

表3 煙草實際樣品中α乙酰丙酸與α果糖、α果糖+α蔗糖/2的線性方程和相關(guān)系數(shù)Tab.3 Linear equations and correlation coefficients between levulinic acid and fructose mass fractions,the mass fraction sum of fructose and fructose obtained by sucrose hydrolysis in tobacco sample

3 結(jié)論

①硫酸-甲醇衍生化時間和溫度對甲酯化后煙草樣品中乙酰丙酸甲酯響應(yīng)的影響不同于其他有機酸甲酯；②在硫酸-甲醇衍生化條件下，對煙草中常見的5種糖類成分進(jìn)行處理，分析其二氯甲烷萃取液發(fā)現(xiàn)果糖和蔗糖在甲酯化條件下能產(chǎn)生乙酰丙酸甲酯，其中，相同質(zhì)量的果糖產(chǎn)生的乙酰丙酸甲酯約是蔗糖產(chǎn)生量的2倍，而葡萄糖、麥芽糖、肌醇在衍生化過程中不產(chǎn)生乙酰丙酸甲酯；③通過比較263個實際煙草樣品中的果糖和蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與硫酸-甲醇衍生化法測定得到的煙草中乙酰丙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系，證明硫酸-甲醇衍生化法測定煙草中的乙酰丙酸受煙草中果糖和蔗糖的影響。