在線固相萃取-離子色譜法測定再造煙葉漿料中的17種有機(jī)酸

李華雨，李曉瑜，劉寧，薛建中，許紅濤，王茹楠，王毅博，王寧*，高凡欽

1.河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司煙草行業(yè)再造煙葉重點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)研究室，河南省許昌市金葉大道666號 461000 2.漯河市質(zhì)量技術(shù)檢驗(yàn)測試中心國家肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，河南省漯河市召陵區(qū)汾河路22號 462000 3.啟迪浦華水務(wù)有限公司，北京市海淀區(qū)中關(guān)村東路1號院8號樓23層C2602-1 100084 4.賽默飛世爾科技（中國）有限公司北京應(yīng)用中心，北京市東城區(qū)安定門東大街28號雍和大廈2號樓702-715室 100102

造紙法再造煙葉漿料中含有原料中的木質(zhì)素和半纖維素，機(jī)械制漿產(chǎn)生的大量微小纖維，工藝過程中產(chǎn)生的果膠、蛋白、無機(jī)鹽、有機(jī)酸及其他的陰陽離子等成分［1-2］。再造煙葉加工過程中，煙草漿料在密閉管道中運(yùn)行，漿料中豐富的物質(zhì)在適宜條件下滋生微生物且導(dǎo)致微生物種類增多［2-4］，其中的厭氧細(xì)菌在密閉環(huán)境中發(fā)生厭氧消化，釋放出具有難聞氣味的揮發(fā)性脂肪酸，漿料的運(yùn)行時(shí)間與其揮發(fā)性脂肪酸濃度的變化密切相關(guān)［5-7］，同時(shí)再造煙葉漿料中的蘋果酸、草酸、檸檬酸等通過煙梗、煙末的制漿工序以及漿料濃白水的循環(huán)使用而發(fā)生變化。因此，監(jiān)控再造煙葉漿料中有機(jī)酸濃度的變化有利于保證漿料質(zhì)量，同時(shí)也可為生產(chǎn)運(yùn)行中漿料的質(zhì)量評判提供一種技術(shù)手段。

有機(jī)酸的測定方法主要有GC-MS法［8-10］、HPLC法［11-12］、毛細(xì)管電泳法［13］、加壓毛細(xì)管電色譜法［14］和離子色譜法［15-17］等。GC-MS法［8-10］多用于固體樣品中有機(jī)酸的測定；HPLC法［11-12］多用于測定難揮發(fā)性有機(jī)酸，對揮發(fā)性有機(jī)酸測定的研究較少；毛細(xì)管電泳法靈敏度較低，重現(xiàn)性較差［13，18-19］；離子色譜法［15-17］測定有機(jī)酸的研究大多集中在較簡單的樣品體系中。傳統(tǒng)的SPE（Solid phase extraction，固相萃?。┓ǘ嗖捎秘?fù)壓真空萃取裝置，萃取劑流速難以準(zhǔn)確控制，而流速對提取率的影響較大；同時(shí)樣品前處理中通常使用各種對人體有害的有機(jī)溶劑，多批次的樣品前處理耗費(fèi)時(shí)間較長［18］。在線的全自動(dòng)化SPE系統(tǒng)，可提高樣品處理的通量和工作效率，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，安全性強(qiáng)，越來越被廣大實(shí)驗(yàn)室工作者采用［20］。本研究中針對再造煙葉漿料液色度高、渾濁、成分復(fù)雜等特點(diǎn)，利用在線凈化及離子色譜法建立煙草漿料中有機(jī)酸的測定方法，旨在為全面了解漿料中有機(jī)酸對產(chǎn)品品質(zhì)的影響及生產(chǎn)過程中漿料駐留時(shí)間和工藝優(yōu)化提供技術(shù)支持，為再造煙葉產(chǎn)品的安全控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

TS-0006再造煙葉漿料（河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司提供）。

乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；氫氧化鈉（AR，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠）；甲酸鈉（98.9%）、乙酸鈉（99.5%）、丙酸鈉（99.5%）、丁酸鈉（99.7%）、戊酸鈉（99.3%）、丙酮酸鈉（99.5%）、己酸鈉（≥99%）（標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所）；乳酸鈉（89.9%）、異丁酸鈉（99.9%）、異戊酸鈉（99.5%）、3-甲基戊酸鈉（99.5%）、4-甲基戊酸鈉（99.6%）、苯甲酸鈉（99.9%）、酒石酸鈉（99.3%）、草酸鈉（98.4%）、蘋果酸鈉（99.5%）、檸檬酸鈉（99.5%）（標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr.Ehrenstorfer公司）。

DionexTMICS-6000高壓離子色譜儀（配全自動(dòng)在線電解淋洗液發(fā)生器、溫控電導(dǎo)檢測器）、ADRS600自動(dòng)電解連續(xù)再生微膜抑制器（美國Thermo Fisher公司）；ZHP-2102L恒溫振蕩培養(yǎng)箱（常州普天儀器制造有限公司）；Milli-Q型超純水儀（德國Merck Millipore公司）；MS204TS電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）；GL-21M高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；DionexInGuardTMNa SPE柱（9 mm×24 mm）、DionexIonPac AG11-HC離子色譜柱（4 mm×50 mm）、DionexIonPac AS11-HC離子色譜柱（4 mm×250 mm）（美國Thermo Fisher公司）；水系針頭過濾器（0.22μm，天津富集色譜技術(shù)發(fā)展公司）。

1.2. 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量有機(jī)酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，精確至0.1 mg，配制成濃度為1.00 mg/mL的有機(jī)酸鈉單一標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備水溶液。分別移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備水溶液，配制成濃度為100μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制成濃度分別為10.00、9.00、8.00、7.00、6.00、5.00、4.00、3.00、2.00、1.00、0.50、0.10及0.05μg/mL的工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 不同放置時(shí)間再造煙葉漿料的制備

取正常運(yùn)行的TS-0006再造煙葉漿料，搖勻，15 min內(nèi)分裝在24個(gè)250 mL錐形瓶中，塞緊磨口瓶塞，立即放入50℃的恒溫箱中。每間隔1 h取出兩個(gè)平行樣品。

1.2.3 樣品前處理

用孔徑37μm（400目）的滌綸濾布過濾再造煙葉漿料樣品。取25 mL濾液并加入0.1 mL 4 mol/L氫氧化鈉水溶液，混勻，以12 000 r/min離心10 min，將上清液用水系針頭過濾器過濾，用離子色譜法分析濾液。離子色譜儀條件：

柱溫：30℃；恒溫箱溫度：30℃；檢測池溫度：35℃；抑制器電流：160 mA；進(jìn)樣量：25μL。KOH淋洗液洗脫梯度：0～15 min，KOH濃度為0.8 mmol/L；15～27 min，KOH濃度由0.8 mmol/L升至4.0 mmol/L；27～28 min，KOH濃度由4.0 mmol/L升至8.0 mmol/L，保持23 min；51～56 min，KOH濃度由8.0 mmol/L升至45.0 mmol/L，保持7 min；63 min時(shí)，KOH濃度降至0.8 mmol/L；流速：1.50 mL/min。

在線前處理?xiàng)l件：

流動(dòng)相A：去離子水；流動(dòng)相B：乙腈。詳見表1。

表1 在線前處理?xiàng)l件及閥切換時(shí)間Tab.1 Online pretreatment conditions and valve switching time

1.2.4 分析步驟

分析流程見圖1。①將樣品以自動(dòng)進(jìn)樣的方式注入25μL定量環(huán)（閥2）。②樣品被800μL純水帶入Na型SPE柱，重金屬離子和過渡金屬離子被截留在Na柱上，除去金屬離子的樣品從Na柱流出來后全部流入大定量環(huán)和AG11-HC預(yù)處理柱（濃縮柱），樣品基質(zhì)中的疏水物質(zhì)被截留在AG11-HC柱上，有機(jī)酸根不被截留而進(jìn)入后續(xù)的AS11-HC離子交換柱（閥1）。③乙腈將截留在陰離子預(yù)處理柱上的樣品基質(zhì)清洗至廢液中，實(shí)現(xiàn)AG11-HC柱的清洗再生（閥1）。④由淋洗液將被測組分沖洗至AS11-HC分析柱，經(jīng)過抑制器流入電導(dǎo)檢測器。

圖1 漿料樣品中有機(jī)酸的分離分析流程Fig.1 The process of separation and analysis of organic acids in reconstituted tobacco slurry

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的選擇

2.1.1 不同類型SPE柱的選擇

考察了NG1型、H型及Na型SPE柱對樣品中有機(jī)酸測定結(jié)果的影響。分別在不接SPE柱、連接NG1柱、連接H型柱、連接Na型柱4種狀態(tài)下測定添加了標(biāo)準(zhǔn)品的再造煙葉漿料樣品。結(jié)果表明，連接H型柱時(shí)樣品中乳酸、乙酸及甲酸的測定結(jié)果均比其他3種連接方式高，尤其是乙酸的濃度。這是由于H型柱的功能基是羧酸根，分析過程中其會(huì)慢慢脫落乙酸根和甲酸根［21］所致。NG1柱填料沒有帶電荷的功能基團(tuán)，運(yùn)行過程中會(huì)吸附少量的小分子有機(jī)酸，因此樣品中乳酸、乙酸和丙酸的測定濃度偏低。Na型柱測得樣品中乳酸、乙酸、丙酸和甲酸的濃度與不連接SPE柱基本一致。樣品中其他有機(jī)酸在4種連接狀態(tài)下測定結(jié)果的RSD均在5%以下。因此，實(shí)驗(yàn)中選擇Na型在線SPE柱。

2.1.2 樣品pH對有機(jī)酸測定結(jié)果的影響

離子作用力發(fā)生在帶相反電荷的目標(biāo)化合物與SPE吸附劑官能團(tuán)之間，環(huán)境的pH是目標(biāo)化合物和吸附劑帶相反電荷的必需條件［20］。再造煙葉漿料系統(tǒng)中厭氧細(xì)菌發(fā)酵為糖酶，隨漿料放置時(shí)間的不同，釋放出的揮發(fā)性脂肪酸等代謝副產(chǎn)物的量也不同，一般再造煙葉漿料的pH為5.0～6.5。為了考察樣品pH對檢測結(jié)果的影響，分別利用Na型柱＋濃縮柱與僅用濃縮柱2種連接方式測定漿料樣品pH分別為4.1、5.3、6.1、7.0、8.0、9.0、10.9時(shí)有機(jī)酸的濃度。結(jié)果表明，不同pH樣品在僅連接濃縮柱時(shí)乳酸、乙酸、丙酸和甲酸等小分子有機(jī)酸的峰面積均較連接Na型柱＋濃縮柱時(shí)小，其中，僅連接濃縮柱狀態(tài)下酸性或堿性越大的樣品中乳酸、乙酸、丙酸和甲酸的測定結(jié)果越小。圖2為漿料pH為5.3時(shí)2種連接方法的色譜圖，連接濃縮柱時(shí)樣品中乳酸、乙酸、丙酸和甲酸的峰面積均比Na型柱+濃縮柱時(shí)小。

圖2 漿料樣品pH為5.3時(shí)2種連接方式的色譜圖Fig.2 Chromatograms of slurry sample by two connection methods at pH 5.3

離子色譜樣品分析系統(tǒng)中，小分子有機(jī)酸僅發(fā)生靜電作用，帶電才能被保留；較大分子的有機(jī)酸，會(huì)發(fā)生靜電吸附和分子間力2種作用。因此，小分子有機(jī)酸的檢測峰面積較小有2種可能的原因：①堿性較強(qiáng)的樣品會(huì)發(fā)生自淋洗作用而使目標(biāo)組分不被凈化濃縮柱保留；②pH太低的樣品中小分子有機(jī)酸是分子狀態(tài)，在柱子中不保留。

一般離子色譜法的分離過程中，在樣品到達(dá)進(jìn)樣閥時(shí)，會(huì)在進(jìn)樣閥處連接濃縮柱，用于富集樣品中的離子組分［22］。通過計(jì)算進(jìn)樣閥前的死體積，調(diào)整閥切換時(shí)間，加裝1 mL的大定量環(huán)（約2 m長）的方法［22］，從Na型柱流出來的樣品全部經(jīng)過大定量環(huán)進(jìn)入分析系統(tǒng)（圖1），使在線預(yù)處理不受樣品pH的影響，保證了樣品濃度的準(zhǔn)確性和測定結(jié)果的重現(xiàn)性。圖3為pH 5.3的漿料樣品在增加大定量環(huán)后2種連接方式下測定的色譜圖，小分子有機(jī)酸峰面積在2種情況下均無變化。

圖3 加裝大定量環(huán)后空白及pH為5.3時(shí)漿料樣品的色譜圖Fig.3 Chromatograms of slurry sample at pH 5.3 and blank after adding a large quantitative loop

2.2 色譜條件的優(yōu)化

參考高質(zhì)量分?jǐn)?shù)碳酸鹽基體中陰離子的檢測方法［22］并根據(jù)離子色譜的特點(diǎn)，考察了KOH淋洗液質(zhì)量濃度變化對17種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品分離的影響，草酸根與苯甲酸根［23］、碳酸根與酒石酸根［23］、甲酸根與異丁酸根易于在同一時(shí)間被淋洗，經(jīng)過對淋洗液質(zhì)量濃度、分離時(shí)間的優(yōu)化，草酸與苯甲酸、碳酸與酒石酸均達(dá)到了基線分離（圖4）。為了避免煙草原料中含有的Cl-、NO3-、NO2-、SO42-、PO43-等離子對檢測結(jié)果的干擾，在標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液中添加了這5種離子的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（圖4）。17種有機(jī)酸與基質(zhì)中5種無機(jī)酸根離子基本達(dá)到基線分離，經(jīng)過在線SPE處理后的再造煙葉漿料樣品中的17種有機(jī)酸與基質(zhì)中5種無機(jī)酸根離子也基本達(dá)到基線分離（圖5），表明建立的色譜條件及在線處理方式能夠?qū)υ僭鞜熑~漿料中的有機(jī)酸進(jìn)行測定。

圖4 2μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖Fig.4 Ion chromatogram of a standard solution of 2μg/mL

圖5 再造煙葉生產(chǎn)漿料的色譜圖Fig.5 Chromatogram of a reconstituted tobacco slurry

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察

以各有機(jī)酸根離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y）、濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在0.5～10.0μg/mL范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999，見表2。

表2 17種有機(jī)酸的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)（r）、檢出限（LOD）及定量限（LOQ）Tab.2 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients（r），limits of detection（LOD）and limits of quantitation（LOQ）of 17 organic acids

2.3.2 定量限和檢出限

取適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，以信噪比10∶1和3∶1分別計(jì)算檢出限（LOD）和定量限（LOQ），得到LOD為0.002～0.400μg/mL，LOQ為0.010～0.900μg/mL（表2）。表明方法的靈敏度較好。

2.3.3 方法的加標(biāo)回收率和精密度

以稀釋后的再造煙葉漿料為原樣品，在樣品中以2、4、6μg/mL 3個(gè)水平加標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)測定3次，記錄峰面積并計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3。3個(gè)水平平均加標(biāo)回收率范圍為90.5%～117.1%，重復(fù)測試的RSD為0.4%～4.4%。表明方法的準(zhǔn)確度和精密度均能滿足測定要求。

表3 17種有機(jī)酸的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）Tab.3 Spiked recoveries and relative standard deviations（RSDs）of 17 organic acids

2.3.4 精密度及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

同一加標(biāo)后經(jīng)過前處理的漿料樣品進(jìn)行6次日內(nèi)和日間平行測定，考察了方法的精密度。結(jié)果表明，17種有機(jī)酸日內(nèi)、日間測定結(jié)果的變異系數(shù)分別在0.59%～2.57%、0.72%～4.80%之間。因此，該方法精密度較好。

對1個(gè)加標(biāo)后經(jīng)過前處理的漿料樣品和1個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（6μg/mL）在40 d內(nèi)進(jìn)行周期性測試，每次測試完成后更換樣品瓶瓶蓋，然后在4℃條件下密封避光貯存，共測試5次。結(jié)果表明，在40 d內(nèi)，再造煙葉漿料樣品及混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5次測試結(jié)果的變異系數(shù)在0.1%～4.9%之間。

2.4 不同放置時(shí)間再造煙葉漿料中有機(jī)酸濃度變化

再造煙葉漿料中，乳酸、乙酸、甲酸和檸檬酸的濃度遠(yuǎn)高于其他有機(jī)酸（如丁酸、戊酸、己酸等），如果不對樣品進(jìn)行稀釋，濃度大的乳酸、乙酸和甲酸等的色譜峰形較差，定量準(zhǔn)確性差。為了能夠準(zhǔn)確定量，根據(jù)樣品中乳酸、乙酸和甲酸等濃度的不同將其按照不同比例稀釋后測定，結(jié)果見表4。可知，再造煙葉漿料在50℃恒溫箱中放置，隨漿料放置時(shí)間的延長，異戊酸的濃度先逐漸升高然后逐漸降低，放置3 h時(shí)的濃度最高，9 h后濃度變化趨緩；乙酸的濃度呈逐漸升高然后無明顯變化的趨勢；丙酮酸的濃度在4 h時(shí)開始呈較緩慢升高趨勢；4-甲基戊酸的濃度在4 h后呈較緩慢降低趨勢；甲酸、酒石酸和檸檬酸的濃度隨放置時(shí)間的延長無明顯變化；乳酸的濃度呈逐漸降低然后無明顯變化的趨勢；蘋果酸的濃度在放置8 h內(nèi)無明顯變化，然后升高再又降低；草酸的濃度放置3 h后突然升高，至6 h后無明顯變化，放置7 h后突然降低，然后呈無規(guī)律變化狀態(tài)。

表4 再造煙葉漿料樣品中有機(jī)酸的濃度Tab.4 Concentrations of organic acids in reconstituted tobacco slurry samples （μg·mL-1）

再造煙葉漿料在50℃恒溫箱中密閉放置，漿料中的厭氧細(xì)菌在厭氧消化過程中經(jīng)過水解酸化和反硝化2個(gè)階段，水解酸化階段部分有機(jī)酸的濃度逐漸升高，反硝化階段中又消耗有機(jī)酸［24］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，50℃條件下隨放置時(shí)間的延長，再造煙葉漿料中乙酸和異戊酸的濃度隨漿料放置時(shí)間的延長變化顯著。

3 結(jié)論

（1）建立了在線固相萃取-離子色譜法同時(shí)測定再造煙葉漿料中17種有機(jī)酸的方法。

（2）該方法在0.5～10.0μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，方法的檢出限為0.002～0.400μg/mL，定量限為0.010～0.900μg/mL。在2、4、6μg/mL 3個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率在90.5%～117.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.4%～4.4%之間。日內(nèi)測定結(jié)果的變異系數(shù)為0.59 %～2.57%，日間為0.72%～4.80%。

（3）該方法前處理簡單、操作簡便、重復(fù)性好，適用于再造煙葉漿料有機(jī)酸的測定，可為再造煙葉生產(chǎn)過程中漿料的駐留時(shí)間和工藝優(yōu)化提供技術(shù)支持。