廣西煙草一種斑枯病新病原菌的鑒定

范東升，張得平，藍達愉，袁高慶，盧燕回*

1.中國煙草總公司廣西壯族自治區(qū)公司，南寧市青秀區(qū)茶花園路25號 530022 2.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)大學(xué)東路100號 530004

煙草（Nicotiana tabacum L.）是我國主要的經(jīng)濟作物之一，生長過程中常受多種病害的影響，導(dǎo)致煙葉產(chǎn)量與品質(zhì)下降。按照病害發(fā)生部位歸類，由主要侵染植株葉片的病原引起的病害統(tǒng)稱為葉斑病。煙草葉斑病種類繁多，發(fā)生普遍，常見的葉斑病有煙草赤星病、煙草蛙眼病、煙草靶斑病、煙草棒孢霉葉斑病和煙草野火病等［1］。近年來，隨著氣候環(huán)境、耕作制度、栽培條件和栽培品種的改變，不斷有新的煙草葉斑病種類或已知煙草葉斑病的新記錄病原出現(xiàn)［2-6］。祖燕青等［4］通過形態(tài)學(xué)和rRNA-ITS序列分析，明確引起河南省煙區(qū)煙草赤星病的病原菌種類有鏈格孢（Alternaria alternata）、長柄鏈格孢（A.longipes）和鴨梨鏈格孢（A.yaliinficiens）3種，其中鴨梨鏈格孢是引起煙草赤星病的首次報道。Sun等［5］通過形態(tài)學(xué)和rRNA-ITS序列分析將引起貴州煙草靶斑病的病原菌鑒定為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）AG-6，該病原菌是引起煙草靶斑病的新的立枯絲核菌菌絲融合群。Wang等［6］于2017年在貴州正安縣發(fā)現(xiàn)一種未知的煙草葉斑病，將其命名為煙草斑枯病。該病病斑呈褐色，形狀不規(guī)則，與健康組織之間有明顯的黃色暈圈，發(fā)病嚴重時多個病斑可融合成片，導(dǎo)致整張葉片枯萎，在近3萬平方米的發(fā)病范圍內(nèi)發(fā)病率達30%。隨后通過開展病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定、rRNA-ITS和TUB2序列分析，將引起該病害的病原菌鑒定為瓜擬多隔孢（Stagonosporopsis cucurbitacearum），這是煙草斑枯病的首次報道。2021年3月，廣西百色市田林縣八渡鄉(xiāng)局部煙田的K326煙草品種上也出現(xiàn)了一種與煙草斑枯病癥狀類似的病害，主要危害團棵期煙株的中下部葉片，發(fā)病面積約2 000 m2，田間病株率約8%。為明確該病害的病原，于發(fā)病煙田采集不同病株上的典型發(fā)病葉片，通過組織分離法進行病原菌的分離，按照柯赫氏法則驗證病原菌的致病性，將病原菌的形態(tài)鑒定和分子鑒定相結(jié)合，確定病原菌的分類地位，以期為該病害的科學(xué)防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

用于病原菌分離的煙草病葉標樣采集于廣西百色市田林縣八渡鄉(xiāng)發(fā)病煙田的病株，置于封口袋中，保存在4℃冰箱中備用。健康煙草植株來自廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院溫室，品種為K326，用于分離菌株的致病性測定。

1.2 病害癥狀觀察與病原菌的分離純化

觀察廣西百色市田林縣八渡鄉(xiāng)煙田病害發(fā)生的煙草生育期、危害部位、病斑形狀和顏色、病斑大小、病斑上有無病征等癥狀特點，并與已知煙草病害癥狀進行對比。

采集病葉，采用常規(guī)組織分離法［7］分離病原菌，具體步驟為：剪取病健交界處葉片組織并用75%（體積分數(shù)）酒精表面消毒30 s，再用0.1%（質(zhì)量分數(shù)）氯化汞溶液消毒30 s，無菌水沖洗3次。用無菌剪刀將消毒后的病葉組織塊剪成5 mm×5 mm的小塊，移到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d，待菌絲長出后，在無菌條件下用接種針挑取菌落邊緣的菌絲塊，轉(zhuǎn)移至新的PDA培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)5 d，再用PDA斜面試管培養(yǎng)7 d后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分離菌株的致病性測定

將保存的代表性菌株轉(zhuǎn)移至PDA平板上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，按照柯赫氏法則對分離菌株的致病性進行測定［8］。采用菌絲塊接種法［9］對健康煙草葉片進行有傷和無傷接種。選取5～6葉期煙株中下部葉片，葉片左半邊的接種部位用無菌針頭刺3個小孔，右半邊無傷處理。用打孔器取直徑為5 mm的菌絲塊，將菌絲面朝下貼于葉片上，每張葉片接種4個菌絲塊，然后在菌絲塊上覆蓋無菌水濕潤后的棉花薄層，并套袋保濕。每個處理接種3張葉片，重復(fù)3次。對照組接種PDA培養(yǎng)基塊。將接種后的煙株置于28℃光照培養(yǎng)箱中，觀察并記錄發(fā)病情況。待葉片發(fā)病后，從發(fā)病部位再次分離菌株進行鑒定，以完成柯赫氏法則驗證。

1.4 病原菌的形態(tài)特征觀察

在28℃和12 h光照/12 h黑暗條件下將菌株分別在PDA和V8培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。待形成子實體后，在尼康Eclipse 80i顯微鏡（日本株式會社尼康公司）下鏡檢子實體和分生孢子形態(tài)特征，并隨機挑選30個子實體和50個分生孢子測量其大小。

1.5 病原菌的rRNA-ITS和TUB2序列分析

將純化后的菌株按照真菌基因組DNA提取試劑盒（杭州博日科技股份有限公司）說明書的方法提取基因組DNA。使用通用引物組ITS1/ITS4、Bt2a/Bt2b分別擴增ITS、TUB2序列［10］。PCR擴增體系（25μL）：Taq PCR MasterMix 12.5μL，上下游引物各1μL，模板DNA 1μL，用ddH2O將反應(yīng)體系補至25μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸60 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。取5μL PCR擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，觀察到單一條帶后，委托上海生物工程股份有限公司對擴增產(chǎn)物進行測序。使用NCBI網(wǎng)站的Blastn在線工具對序列進行比對分析，在GenBank數(shù)據(jù)庫中下載Aveskamp等［11］提供的參考菌株基因序列，與本研究中菌株的序列比對剪切后按ITS-TUB2的順序進行拼接，利用MEGA 6.0軟件以鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀描述及病原菌的分離純化

經(jīng)田間觀察，于廣西百色市田林縣新發(fā)現(xiàn)的煙草葉斑病主要危害團棵期的中下部煙葉，發(fā)病初期時葉片上呈現(xiàn)褐色小斑點且黃暈明顯，然后擴展形成橢圓形或不規(guī)則形病斑，大小不一，病斑邊緣深褐色，病健交界清晰，多個病斑可融合成片，導(dǎo)致葉片枯黃脫落（圖1A、圖1B）。該病癥狀與Wang等［6］報道的煙草斑枯病癥狀相似。從典型發(fā)病煙葉的病健交界處分離獲得多株菌落特征一致的菌株，經(jīng)純化培養(yǎng)后，選取代表性菌株NL-2-1進行后續(xù)致病性測定和鑒定。

2.2 病原菌的致病性測定

按照柯赫氏法則測定代表性菌株NL-2-1的致病性。結(jié)果顯示，接種健康煙草葉片3 d后，接種部位邊緣呈黃色病變，且從有傷接種處開始變褐，病斑逐漸擴展，7 d后發(fā)病部位嚴重變褐壞死，病健交界處有明顯黃暈，有傷接種病斑擴展更快（圖1C），空白對照葉片未發(fā)病（圖1D）。

圖1 煙草斑枯病癥狀及菌株NL-2-1的致病性測定Fig.1 Symptoms of tobacco spot blight and pathogenicity determination of strain NL-2-1

從接種發(fā)病的煙葉中再分離得到的病菌與田間發(fā)病煙葉中分離的菌株NL-2-1形態(tài)一致，證明菌株NL-2-1對煙草葉片具有致病性，是引起廣西煙草斑枯病的病原菌。

2.3 病原菌的形態(tài)特征

菌株NL-2-1在PDA培養(yǎng)基中氣生菌絲不發(fā)達，菌落初期呈白色，隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸變?yōu)榛野咨匆姰a(chǎn)孢（圖2A）。在V8培養(yǎng)基中培養(yǎng)約10 d能形成小黑點，為該菌株形成的分生孢子器。分生孢子器近球形，直徑70～150μm，多埋生，在培養(yǎng)基中集中生長，形成約45°的扇形產(chǎn)孢區(qū)域（圖2B、圖2C）。擠壓小黑點鏡檢，能觀察到大量的分生孢子。分生孢子單胞，無色，呈橢圓形，大小為4.8～12.3μm×2.1～3.8μm（平均大小為7.1μm×2.7μm）（圖2D），與Bracale等［12］描述的Stagonosporopsis屬形態(tài)特征相近。

圖2 菌株NL-2-1的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of strain NL-2-1

2.4 病原菌的rRNA-ITS和TUB2序列分析

經(jīng)測序，菌株NL-2-1的rRNA-ITS和TUB2序列分別為536 bp（NCBI登錄號為OM062578）和336 bp（NCBI登錄號為OM240593）。Blastn比對結(jié)果顯示，其與Stagonosporopsis caricae的相似度分別為99.61%（ITS，MH860977）和100%（TUB，MK255067）。選取Aveskamp等［11］提供的相關(guān)菌株Stagonosporopsis caricae，S.cucurbitacearum，S.heliopsidis，S.andigena，S.dorenboschii的rRNA-ITS和TUB2序列聯(lián)合建立系統(tǒng)發(fā)育樹進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示，菌株NL-2-1與Stagonosporopsis caricae親緣關(guān)系最近，以100%的自展支持率聚為同一個分支（圖3）。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及分子鑒定結(jié)果，確定引起廣西煙草斑枯病的病原菌為Stagonosporopsis caricae。

圖3 菌株NL-2-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain NL-2-1

3 討論

根據(jù)病原菌的致病性測定、形態(tài)特征觀察、rRNA-ITS和TUB2序列分析結(jié)果，明確了廣西煙草斑枯病的病原菌為Stagonosporopsis caricae，這是該病原菌在煙草上發(fā)生危害的首次報道。Stagonosporopsis屬之前被歸屬于殼二孢屬Ascochyta，因其偶爾形成多隔分生孢子（Stagonospora-like）而被劃分為新屬，與莖點霉屬Phoma親緣關(guān)系相近，所以Stagonosporopsis caricae也曾命名為Ascochyta caricae-papayae Tarr.和Phoma caricae-papayae（Tarr.）Punith.［13］。2010年，Aveskamp等［11］根據(jù)LSU（28S large subunit of the nrDNA）、rRNA-ITS和TUB2（beta-tubulin 2 gene）多基因序列分析，研究了莖點霉屬Phoma和格孢腔菌目Pleosporales內(nèi)相關(guān)屬的遺傳進化關(guān)系，并將該病原菌重新命名為Stagonosporopsis caricae（Sydow & P.Sydow）Aveskamp，Gruyter & Verkley。2021年，何蘇琴等［14］將Stagonosporopsis caricae的中文名命名為木瓜擬多隔孢，該病原菌可引起番木瓜（Carica papaya）莖干腐爛。

Stagonosporopsis caricae除了是侵染番木瓜科（Caricaceae）作物的重要病原菌，與另外兩個近緣種S.cucurbitacearum和S.citrulli一樣還可引起西瓜（Citrullus lanatus）、黃 瓜（Cucumis sativus）、甜 瓜（Cucumis melo）、南瓜（Cucurbita moschata）和苦瓜（Momordica charantia）等多種葫蘆科（Cucurbitaceae）作物的蔓枯病和葉疫?。?5-17］。發(fā)生在貴州的煙草斑枯病的病原菌為S.cucurbitacearum，本研究中鑒定出引起廣西煙草斑枯病的病原菌為S.caricae，進一步豐富了該病原菌的寄主范圍和煙草斑枯病的病原菌種類。目前該病害在廣西田林縣煙區(qū)局部田塊輕度發(fā)生，后期通過噴施廣譜殺菌劑控制了病情的擴展。后續(xù)應(yīng)持續(xù)關(guān)注該病害的危害程度、分布范圍和發(fā)病規(guī)律，以避免其對當?shù)責熑~生產(chǎn)造成不利影響。

4 結(jié)論

明確了廣西煙草新記錄病害為煙草斑枯病，該病在煙草團棵期即可危害中下部煙葉，導(dǎo)致葉片提前枯黃脫落。通過致病性測定、形態(tài)學(xué)觀察、rRNA-ITS與TUB2基因序列聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹分析，鑒定出引起廣西煙草斑枯病的病原菌為木瓜擬多隔孢（Stagonosporopsis caricae），是該病原菌在煙草上發(fā)生危害的首次報道，且木瓜擬多隔孢與貴州報道的煙草斑枯病病原菌同屬不同種，表明將rRNA-ITS和TUB2基因序列聯(lián)合分析，可有效區(qū)分Stagonosporopsis屬的不同種類。