外源酶制劑對(duì)雪茄茄芯煙葉化學(xué)成分和感官品質(zhì)的影響

鄭霖霖，趙亮，蔡興華，段旺軍，陳震，張勇剛，時(shí)向東*

1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州市金水區(qū)農(nóng)業(yè)路63號(hào) 450002 2.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，杭州市西湖區(qū)科海路118號(hào) 310024 3.四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，成都市成龍大道一段56號(hào) 610066

傳統(tǒng)手工卷制的雪茄由茄衣、茄套和茄芯煙葉組成，其中茄芯為雪茄的主要部分，決定著雪茄吸食時(shí)的主流風(fēng)味特征［1］。除栽培和調(diào)制等技術(shù)之外，發(fā)酵也是提高雪茄茄芯煙葉品質(zhì)的關(guān)鍵措施之一［2］。煙葉發(fā)酵分為一次發(fā)酵和二次發(fā)酵，其中一次發(fā)酵主要是促進(jìn)煙葉內(nèi)在成分的快速轉(zhuǎn)化，二次發(fā)酵主要是彌補(bǔ)初次發(fā)酵中的不足，使煙葉化學(xué)成分更加協(xié)調(diào)，提高煙葉品質(zhì)［3］。前人研究表明，在雪茄煙葉發(fā)酵過程中添加微生物菌劑、酶制劑或其他發(fā)酵介質(zhì)等可改善煙葉品質(zhì)，提高煙葉工業(yè)可用性［4-6］。有研究發(fā)現(xiàn)酶在煙葉發(fā)酵過程中具有重要作用，酶可以催化煙葉中的某些物質(zhì)分解或合成，進(jìn)而提高煙葉化學(xué)成分協(xié)調(diào)性，改善煙葉吸食品質(zhì)［7-8］。目前利用外源酶制劑改善煙葉品質(zhì)的研究報(bào)道較多?？苊麾暤龋?］研究發(fā)現(xiàn)，在雪茄茄芯煙葉發(fā)酵過程中添加蛋白酶可降低煙葉蛋白質(zhì)含量，香氣質(zhì)和燃燒性等得到明顯改善。阮祥穩(wěn)等［10］試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用纖維素酶和蛋白酶處理可縮短煙葉發(fā)酵周期，提高煙葉總糖含量，且香氣量明顯增加。胡捷等［11］研究表明，在煙葉發(fā)酵過程中添加氧化酶有利于降低煙葉淀粉含量，改善煙葉燃吸時(shí)的口感。夏炳樂等［12］研究認(rèn)為，復(fù)合酶制劑處理的煙葉總氮和煙堿含量有所降低，香味物質(zhì)總量增加，感官品質(zhì)明顯提高。說明添加外源酶能明顯改善煙葉香氣和吸味，提高煙葉燃燒性，煙葉化學(xué)成分含量及比值趨于協(xié)調(diào)［13］。而目前的研究主要涉及烤煙及未發(fā)酵雪茄煙葉中添加外源酶制劑，在雪茄茄芯煙葉二次發(fā)酵中添加外源酶制劑的研究則較少。為此，基于四川什邡雪茄茄芯煙葉初次發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量較高、刺激性較大等特點(diǎn)，以初次發(fā)酵的德雪1號(hào)中部煙葉為研究對(duì)象，在二次發(fā)酵前添加不同濃度的植酸酶、纖維素酶、果膠酶和中性蛋白酶制劑，研究外源酶制劑對(duì)二次發(fā)酵雪茄茄芯煙葉化學(xué)成分和感官品質(zhì)的影響，旨在為提高煙葉使用價(jià)值、改進(jìn)雪茄茄芯煙葉的二次發(fā)酵工藝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，試驗(yàn)材料為四川長城雪茄煙廠庫存的2020年產(chǎn)初次發(fā)酵后的德雪1號(hào)中部煙葉。試驗(yàn)前先將煙葉回潮至含水率為23%左右，備用。試驗(yàn)用外源酶試劑：植酸酶（50 000 U/g，山東隆科特酶制劑有限公司）；纖維素酶（10 000 U/g，上海麥克林生化科技有限公司）；果膠酶（30 000 U/g，上海麥克林生化科技有限公司）；中性蛋白酶（20 000 U/g，北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置添加4種外源酶處理，每種酶分別設(shè)置3個(gè)用量水平，以蒸餾水為對(duì)照，共13個(gè)處理，見表1。試驗(yàn)前對(duì)煙葉進(jìn)行回潮，煙葉含水率控制在26%±1%，而后用小型噴霧器（鄭州博祥生物科技有限公司）將配制好的酶制劑均勻噴灑在煙葉表面，對(duì)照為等量蒸餾水，將噴灑過的煙葉置于KBF 240恒溫恒濕柜（德國Binder公司）中進(jìn)行二次發(fā)酵。發(fā)酵條件：溫度45℃，相對(duì)濕度80%，發(fā)酵時(shí)間15 d。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Experimental design

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 化學(xué)成分測(cè)定

煙葉發(fā)酵結(jié)束后，采用半葉法，即取完整葉片的一半混合均勻后于45℃烘箱中干燥2 h，粉碎并過孔徑0.25 mm篩網(wǎng)（60目），采用AA3型連續(xù)流動(dòng)化學(xué)分析儀（天津中通科技發(fā)展有限公司）參照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 159—2019［14］、YC/T 160—2002［15］、YC/T 162—2011［16］、YC/T 217—2007［17］、YC/T 161—2002［18］、YC/T 249—2008［19］測(cè)定總糖、還原糖、煙堿、氯離子、鉀離子、總氮和蛋白質(zhì)含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。根據(jù)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 282—2009［20］測(cè)定煙葉中的氨基酸含量。

1.3.2 可用性評(píng)價(jià)

采用化學(xué)成分可用性指數(shù)（Chemical Components Usability Index，CCUI）進(jìn)行化學(xué)成分評(píng)價(jià)［21］，依據(jù)隸屬度函數(shù)模型指數(shù)和法計(jì)算CCUI：

式中：j為參評(píng)指標(biāo)；i為不同酶處理；f（x）為隸屬度函數(shù)；w為各參評(píng)指標(biāo)的權(quán)重。

選取總糖、還原糖、煙堿、總氮、鉀離子、氯離子、氮堿比和鉀氯比8個(gè)指標(biāo)作為評(píng)價(jià)各處理化學(xué)成分的可用性因子。參照文獻(xiàn)［22-23］選擇拋物線型（P型）作為總糖、還原糖、煙堿、總氮、氯離子和氮堿比的隸屬度函數(shù)，函數(shù)表達(dá)式為：

選擇S型作為鉀離子和鉀氯比的隸屬度函數(shù)，函數(shù)表達(dá)式為：

式中：x為各化學(xué)成分指標(biāo)的實(shí)際數(shù)值；x1、x2、x3、x4分別代表各化學(xué)成分指標(biāo)的下限臨界值、最優(yōu)下限值、最優(yōu)上限值和上限臨界值，取值參照古巴雪茄煙葉各化學(xué)成分指標(biāo)的實(shí)測(cè)值以及文獻(xiàn)［24-27］確定，見表2。運(yùn)用主成分分析法并結(jié)合專家意見，對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算得到各評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重值［28］。

表2 雪茄茄芯煙葉化學(xué)成分指標(biāo)的隸屬函數(shù)類型、拐點(diǎn)值及權(quán)重Tab.2 Function types,inflection points and weights of chemical component indexes of tobacco leaves for cigar fillers

1.3.3 感官品質(zhì)評(píng)價(jià)

將發(fā)酵后的另一半煙葉由同一人員手工卷制成長度110 mm，直徑14 mm的雪茄煙，在溫度18℃、相對(duì)濕度70%的恒溫恒濕柜中醇化養(yǎng)護(hù)4個(gè)月后供評(píng)吸使用。由國家煙草栽培生理生化研究基地組織6名具有行業(yè)感官評(píng)吸資質(zhì)的評(píng)委完成評(píng)吸，采用湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司三峽卷煙廠雪茄原料9分制評(píng)吸方法，對(duì)煙葉香氣質(zhì)、香氣量、余味、雜氣、甜感、刺激性、燃燒性和灰色8個(gè)指標(biāo)進(jìn)行感官品質(zhì)評(píng)價(jià)，并分別賦予18%、16%、16%、10%、10%、12%、10%和8%的權(quán)重，按照公式（4）計(jì)算總分，總分越高代表煙葉的感官品質(zhì)越好。評(píng)價(jià)方法見表3。

表3 雪茄原料感官品質(zhì)評(píng)價(jià)方法Tab.3 Evaluation methods for sensory quality of cigar raw materials

式中：T為感官品質(zhì)評(píng)價(jià)得分；Pi為某單項(xiàng)指標(biāo)權(quán)重；為某單項(xiàng)指標(biāo)平均得分。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖；采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（Duncan's法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源酶制劑對(duì)雪茄茄芯煙葉常規(guī)化學(xué)成分及氨基酸含量的影響

由表4可知，與CK相比，T2和T3處理雪茄茄芯煙葉總糖和還原糖含量增加至適宜范圍內(nèi)或接近適宜范圍，且糖含量隨著酶濃度的增加整體呈增加趨勢(shì)。而T1和T4處理煙葉總糖和還原糖含量與CK相比差異不顯著。噴施酶制劑后煙葉煙堿含量在2.00%～2.43%之間，較CK降低4.33%～21.26%。不同酶制劑均以120 U/g酶濃度處理煙葉煙堿含量最低，且T1A3處理與T2A3、T3A3、T4A3處理間差異顯著。與CK相比，T2處理煙葉總氮含量均下降至適宜范圍內(nèi)，較CK降低3.85%～10.34%，且不同酶用量處理間差異顯著。T4處理煙葉總氮含量隨著酶用量的增加呈上升趨勢(shì)，以T4A3處理煙葉總氮含量最高，較對(duì)照顯著增加3.85%。T1和T3處理則相反，煙葉總氮含量隨著酶用量的增加逐漸降低，其中T1A3和T3A3處理煙葉總氮含量較CK顯著降低，且均處于適宜范圍內(nèi)。與CK相比，不同酶制劑處理（T3A1除外）煙葉蛋白質(zhì)含量均明顯降低，以T4A2處理最低，較CK降低13.66%。氨基酸含量則明顯增加，且T3和T4均以90 U/g酶用量的處理煙葉氨基酸含量最高，與CK相比提高17.57%和21.28%。不同外源酶處理煙葉中鉀含量較CK均增加至適宜范圍內(nèi)，增幅為0.72%～13.77%。不同酶制劑同一酶用量條件下，T4處理煙葉鉀含量顯著高于其他處理。不同酶制劑處理煙葉氯含量之間無顯著差異，均處于或接近適宜范圍（0.60%～0.80%）內(nèi)。

表4 不同外源酶處理對(duì)雪茄茄芯煙葉化學(xué)成分含量的影響①Tab.4 Effects of different exogenous enzyme treatments on contents of chemical components in tobacco leaves for cigar fillers

2.2 雪茄茄芯煙葉化學(xué)成分可用性評(píng)價(jià)

CCUI值越高，表明煙葉化學(xué)成分整體協(xié)調(diào)性越好，煙葉可用性較高［28］。由圖1可知，與CK相比，T2和T3處理雪茄茄芯煙葉CCUI值均有所增加，其中以T3A3處理煙葉CCUI值最高，較CK增加21.21%；T1A1、T1A2和T4A1處理煙葉CCUI值顯著增加，而T1A3、T4A2和T4A3處理則明顯降低，以T4A3處理的CCUI值最低，較CK降低13.64%。與CK相比，不同酶制劑中均以60 U/g酶用量處理的煙葉CCUI值顯著提高，比CK增加9.09%～21.21%。

圖1 不同外源酶處理雪茄茄芯煙葉化學(xué)成分可用性指數(shù)Fig.1 Usability indexes of chemical components in tobacco leaves for cigar fillers under different exogenous enzyme treatments

2.3 外源酶制劑對(duì)雪茄茄芯煙葉感官品質(zhì)的影響

由表5可知，添加酶制劑進(jìn)行二次發(fā)酵后，雪茄茄芯煙葉的感官品質(zhì)評(píng)價(jià)總分均高于CK。但不同酶處理間存在一定差異。整體來看，T1A3處理的煙葉評(píng)吸總分最高，感官品質(zhì)較好，表現(xiàn)為香氣質(zhì)較好、香氣量充足、余味較舒適、雜氣微顯、刺激性微有、煙氣柔和細(xì)膩。T2A3處理次之，T1A1處理的煙葉感官品質(zhì)評(píng)分最低，表現(xiàn)為刺激性較大、灰色偏黑。在同種酶處理下，評(píng)吸總分隨著酶用量的增加而增加，煙葉香氣質(zhì)改善、香氣量增加、余味舒適、甜度明顯提高，雜氣和刺激性降低。因此，以T1A3和T2A3處理的效果最好，香氣和綜合品質(zhì)均表現(xiàn)最優(yōu)。

表5 不同外源酶處理雪茄茄芯煙葉的感官品質(zhì)評(píng)價(jià)Tab.5 Sensory quality evaluation of tobacco leaves for cigar fillers under different exogenous enzyme treatments（分）

3 討論

煙葉化學(xué)成分是煙葉品質(zhì)的內(nèi)在表現(xiàn)，直接影響煙葉的感官品質(zhì)［29］。本研究結(jié)果表明，纖維素酶和果膠酶處理可顯著增加二次發(fā)酵后雪茄茄芯煙葉總糖和還原糖含量，這與李國棟等［30］研究結(jié)果一致，其原因可能是纖維素酶與果膠酶屬于多糖水解酶，可水解纖維素和果膠等物質(zhì)，進(jìn)而增加了煙葉中可溶性總糖含量。此外，研究中還發(fā)現(xiàn)纖維素酶可顯著降低二次發(fā)酵后雪茄茄芯煙葉煙堿含量，這與吳薇［31］、陳洪等［32］的研究結(jié)果一致，可能是因?yàn)槔w維素酶破壞了煙葉細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，細(xì)胞的滲透阻力降低進(jìn)而引起煙葉內(nèi)含物質(zhì)的滲出，煙堿含量相對(duì)降低［33］。添加中性蛋白酶進(jìn)行二次發(fā)酵后，雪茄茄芯煙葉中總氮含量略有增加，蛋白質(zhì)含量明顯降低，氨基酸含量明顯增加，這與王林等［34］研究的不同酶制劑對(duì)烤煙上部葉化學(xué)成分影響的結(jié)果一致，可能是由于中性蛋白酶本身也為蛋白質(zhì)，經(jīng)過酶解后煙葉中蛋白質(zhì)氮含量降低，但總氮含量略有增加所致［35］。鉀、氯含量以及鉀氯比與雪茄煙葉燃燒性密切相關(guān)，燃燒性差的煙葉其內(nèi)含物質(zhì)無法充分分解，會(huì)產(chǎn)生令人不愉快的枯焦氣味。本研究中發(fā)現(xiàn)，添加外源酶制劑進(jìn)行二次發(fā)酵后雪茄茄芯煙葉鉀含量明顯提高，鉀氯比有所增加，可能是因?yàn)樘砑油庠疵钢苿┖?，氨氣等氣體物質(zhì)在二次發(fā)酵過程中大量逸出揮發(fā)導(dǎo)致干物質(zhì)量降低。

煙葉各化學(xué)成分指標(biāo)之間是相互影響、相互作用的，通過CCUI值可比較煙葉常規(guī)化學(xué)成分的協(xié)調(diào)性［36］。本研究結(jié)果表明，外源酶處理可提高二次發(fā)酵后雪茄茄芯煙葉CCUI值與感官品質(zhì)評(píng)價(jià)總分，其中纖維素酶和果膠酶處理煙葉CCUI值與感官品質(zhì)變化規(guī)律基本一致，均隨著酶用量的增加總體呈上升趨勢(shì)，與馬海燕［37］、樊文舉等［38］的研究結(jié)果一致，可能是由于外源酶促進(jìn)了煙葉內(nèi)部物質(zhì)的合成、分解與轉(zhuǎn)化，進(jìn)而改善煙葉化學(xué)成分的協(xié)調(diào)性，提高了煙葉感官品質(zhì)。值得注意的是120 U/g植酸酶、90 U/g和120 U/g中性蛋白酶處理的煙葉CCUI值與感官品質(zhì)評(píng)價(jià)出現(xiàn)了背離現(xiàn)象，其原因一方面是CCUI值受隸屬函數(shù)拐點(diǎn)值和各指標(biāo)權(quán)重值的影響［22］，另一方面是較高用量酶制劑處理的煙葉香味前體物質(zhì)降解轉(zhuǎn)化較為充分，進(jìn)而提高了煙葉感官品質(zhì)。因此，添加外源酶對(duì)二次發(fā)酵后雪茄茄芯煙葉香氣品質(zhì)的影響仍需進(jìn)一步深入研究。而有關(guān)組合酶（纖維素酶和中性蛋白酶、植酸酶和中性蛋白酶等）之間的相互作用及其對(duì)煙葉品質(zhì)的影響方面也有待進(jìn)一步試驗(yàn)。

4 結(jié)論

在雪茄茄芯煙葉二次發(fā)酵前添加不同外源酶制劑后煙葉化學(xué)成分及感官品質(zhì)存在明顯差異。添加120 U/g纖維素酶和120 U/g果膠酶可顯著提高二次發(fā)酵后雪茄茄芯煙葉總糖和還原糖含量，添加90 U/g植酸酶和90 U/g中性蛋白酶可顯著降低雪茄茄芯煙葉煙堿和蛋白質(zhì)含量，提高氨基酸含量。同等酶用量條件下，纖維素酶與果膠酶對(duì)改善二次發(fā)酵后雪茄茄芯煙葉化學(xué)成分協(xié)調(diào)性的效果優(yōu)于植酸酶和中性蛋白酶。同種酶制劑條件下，高用量酶處理提高煙葉感官品質(zhì)的效果優(yōu)于低用量酶處理。綜合考慮煙葉化學(xué)成分協(xié)調(diào)性、感官品質(zhì)和實(shí)際應(yīng)用成本，以120 U/g纖維素酶處理更有利于提高二次發(fā)酵后雪茄茄芯煙葉品質(zhì)。