基于電化學(xué)適配體傳感器超靈敏檢測赭曲霉毒素A的研究進(jìn)展

馬鑫悅， 呂麗娜， 何錦濤， 李喜全， 張寶忠

(河南工業(yè)大學(xué) 環(huán)境工程學(xué)院，河南 鄭州 450001)

0 前言

赭曲霉毒素A(OTA)是生長在糧食、豆類等農(nóng)產(chǎn)品上的曲霉和青霉的代謝物，也是赭曲霉毒素中毒性最強(qiáng)、分布最廣、對農(nóng)產(chǎn)品危害最多的毒素。為防止其在生物體內(nèi)富集，對其進(jìn)行靈敏、快速的檢測一直都是食品與環(huán)境等領(lǐng)域中值得關(guān)注的問題。

目前檢測OTA常用的技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)、電致發(fā)光、免疫分析技術(shù)等[1-3]。但這些傳統(tǒng)技術(shù)往往需要昂貴的儀器、具有專業(yè)知識的操作人員、復(fù)雜的樣品前處理過程且極為耗時，基于抗體的免疫分析技術(shù)還會存在一些不穩(wěn)定、出現(xiàn)假陽性結(jié)果等問題[4]。電化學(xué)適配體傳感器則因兼具快速、便捷、準(zhǔn)確且易于操作等特點(diǎn)成為OTA檢測技術(shù)的一個熱門方向。

1 電化學(xué)適配體傳感器

電化學(xué)傳感器(Electrochemical sensors)是一種對特定物質(zhì)敏感并可以將這種物質(zhì)的濃度轉(zhuǎn)化為電信號進(jìn)行檢測的儀器[5]。由特定物質(zhì)作為識別原件，例如：酶、抗體、抗生素、重金屬等，與相應(yīng)的轉(zhuǎn)化器所構(gòu)成的分析系統(tǒng)。其裝置主要由識別檢測和傳感器兩個部分構(gòu)成。識別檢測部分起到識別靶標(biāo)及其濃度的作用，而傳感器部分則是起到了將識別檢測部分識別到的信息通過電信號轉(zhuǎn)換成顯示器上明確的數(shù)據(jù)，供科研研究。

適配體是指通過體外篩選過程從核酸文庫中分離出來的和靶標(biāo)具有高度特異性的單鏈DNA或RNA寡核苷酸。適配體能夠識別不同類型的分子，在靶標(biāo)存在的情況下，適配體會優(yōu)先與靶標(biāo)結(jié)合，結(jié)合時所發(fā)生的構(gòu)象變化會導(dǎo)致測量信號的變化[6]。

常用的電化學(xué)檢測手段主要有：循環(huán)伏安法(CV)、差分脈沖伏安法(DPV)、方波伏安法(SWV)、電化學(xué)阻抗譜法(EIS)。目前針對OTA檢測的電化學(xué)適配體傳感器的檢測手段部分具體參數(shù)總結(jié)與對比見表1。

表1 基于赭曲霉毒素檢測的電化學(xué)適配體傳感器對比

2 OTA電化學(xué)適配體傳感器研究進(jìn)展

目前，電化學(xué)適配體傳感器可大致分為兩大類：標(biāo)記型和非標(biāo)記型。標(biāo)記型中又可以分為電活性分子標(biāo)記型、納米材料標(biāo)記型和酶分子標(biāo)記型。此外，納米材料不僅可作為標(biāo)記材料，也可作為適配體負(fù)載材料來增強(qiáng)電信號。

2.1 標(biāo)記型

標(biāo)記型電化學(xué)傳感器是指將電活性分子負(fù)載到適配體或檢測物上，通過對電活性分子的檢測對目標(biāo)物進(jìn)行定量檢測[16]。在引入電活性分子后，傳感器的檢測更加靈敏。在三種標(biāo)記材料中，以氧化還原電活性分子標(biāo)記型、納米材料標(biāo)記型應(yīng)用較多。

2.1.1氧化還原電活性分子標(biāo)記型

目前氧化還原電活性分子應(yīng)用較多的主要分為兩大類：一類是以亞甲基藍(lán)(MB)作為標(biāo)記，另一類是以二茂鐵(Fc)作為標(biāo)記。ABNOUS等[17]以MB作為氧化還原指示劑，采用具有大比表面積和高導(dǎo)電率的單壁碳納米管(SWCNTs)進(jìn)一步對電化學(xué)信號進(jìn)行放大的同時，以Apt互補(bǔ)鏈作為輔助，構(gòu)建了一種較為穩(wěn)定的電化學(xué)傳感器。在沒有加入目標(biāo)物OTA時，Apt與其互補(bǔ)鏈保持穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)；當(dāng)目標(biāo)物加入時，因目標(biāo)物與Apt具有更高的結(jié)合力而導(dǎo)致雙鏈裂解，MB和SWCNTs從電極表面脫落，從而使得電化學(xué)信號減弱。這種基于CACS修飾電極表面的籠狀結(jié)構(gòu)更為牢固，便于信號的檢測，但是組裝較為復(fù)雜。除使用單一電活性物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記外，同時用MB和Fc兩種電活性物質(zhì)標(biāo)記的雙信號傳感器也表現(xiàn)出了很好的性能。ZHU等[18]構(gòu)建的電化學(xué)適配體傳感器檢測限為0.003 3 μg/L。其主要是通過將Fc固定在電極表面的cDNA上，加入適配體與其形成雙鏈，在沒有加入標(biāo)靶時添加MB，則Fc與MB的信號不會發(fā)生變化，在加入適配體后再加入MB，會因為電極表面DNA鏈的構(gòu)象發(fā)生變化，從而負(fù)載更多的MB，導(dǎo)致MB的電流信號大大增加，通過對兩種電活性分子的電信號對比實現(xiàn)對目標(biāo)物OTA的電化學(xué)檢測。此外，在進(jìn)行真菌毒素檢測時，由于部分毒素具有協(xié)同作用會導(dǎo)致毒性的增強(qiáng)，所以對其進(jìn)行同時檢測具有重要意義。一起引入MB和Fc不僅可以作為雙比例信號檢測單一目標(biāo)物，也可同時標(biāo)記兩種目標(biāo)物，從而實現(xiàn)對多種目標(biāo)物的同時檢測。ZHU等[19]用Fc標(biāo)記黃曲霉毒素B1(AFB1)適配體，用MB標(biāo)記OTA適配體，將其與電極表面的發(fā)夾DNA雜交，測其電信號，在加入靶標(biāo)后，被標(biāo)記的兩種適配體與靶標(biāo)結(jié)合脫離電極表面，導(dǎo)致兩種電活性分子的電信號降低。根據(jù)其電信號的變化完成了兩種目標(biāo)物的定量檢測，AFB1和OTA的檢測限分別為1.75、1.08 μg/L。該傳感器借助了剛性2D的發(fā)夾DNA，極大地提高了傳感界面的組裝和識別效率，但電極表面的DNA鏈較長，在組裝過程中存在纏繞的風(fēng)險。

2.1.2納米材料

納米材料是一種尺寸很小的結(jié)構(gòu)單元，且具有磁性、光學(xué)或?qū)щ娞匦浴Ｗ?0世紀(jì)80年代中期問世以來熱度一直不減，目前已被應(yīng)用到包括電化學(xué)傳感器等多個領(lǐng)域。將納米材料作為標(biāo)記物與適配體結(jié)合，基于其自身具有的導(dǎo)電理化特性，可以實現(xiàn)傳感器的靈敏檢測。ZHANG等[20]使用聚多巴胺納米球(PDANSs)和銀納米粒子(AgNP)合成的納米復(fù)合材料AgNPs@PDANSs作為OTA的電化學(xué)示蹤劑，通過對PDANS上AgNP的電化學(xué)剝離信號實現(xiàn)對OTA的檢測，并利用PDANS進(jìn)行信號放大。在OTA存在下，適配體由于優(yōu)先與OTA結(jié)合，導(dǎo)致適配體表面信號標(biāo)簽減少，降低了AgNP的電化學(xué)響應(yīng)信號。其檢測限達(dá)到了10-12～10-8μmol/L的寬線性范圍和0.57×10-12mol/L的低檢出限，且具有良好的重現(xiàn)性，在其他有害物質(zhì)的電化學(xué)分析中具有良好的應(yīng)用前景。WANG等[21]以HA作為OTA的識別元件，將其固定在電極表面，并將金納米顆粒(AuNPs)標(biāo)記的雙報告DNA(rDNA1和rDNA2)與HA進(jìn)行對稱雜交，然后進(jìn)一步利用三硫氰尿酸(TCA)聚合AuNPs實現(xiàn)信號放大。加入目標(biāo)物OTA后，HA與OTA將會特異性結(jié)合形成OTA-HA復(fù)合物，導(dǎo)致雙報告DNA從電極上脫落，從而促使DPV響應(yīng)降低。實現(xiàn)了對OTA的靈敏檢測，檢測范圍為0.001～1 μg/L，檢出限為0.5×10-3μg/L。

2.2 非標(biāo)記型

非標(biāo)記型電化學(xué)適配體傳感器的檢測機(jī)制主要是基于靶標(biāo)和適配體結(jié)合會導(dǎo)致構(gòu)象及空間位阻的變化，造成電極表面的電化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，從而獲得電化學(xué)檢測信號。ZHU等[22]提出了一種以g-C3N4納米片(g-CNNS)為基底的電化學(xué)傳感器，利用g-CNNS的類過氧化物酶活性及其高生物相容性，制備了一種無標(biāo)記型傳感器，實現(xiàn)了0.073×10-9mol/L的檢測限。該傳感體系加入目標(biāo)物OTA后，OTA的存在誘導(dǎo)了適配體產(chǎn)生構(gòu)象變化，然后g-CNNS通過pi-pi相互作用與電極上的游離互補(bǔ)鏈非共價組裝，通過捕獲的g-CNNS催化過氧化氫(H2O2)的氧化以放大電流信號。LI等[23]使用金屬有機(jī)骨架(MOF)作為傳感器的信號探頭，具有高電子電導(dǎo)率的金納米顆粒(AuNP)摻雜的二硫化鉬(MoS2)納米復(fù)合材料作為傳感器的基底。在優(yōu)化的實驗條件下，傳感器表現(xiàn)出0.05～100 μg/L的線性范圍，OTA檢測限為0.01 μg/L。納米材料的使用對構(gòu)建超靈敏傳感器起著至關(guān)重要的作用，而納米材料和具有切割作用酶的同時使用，則可以進(jìn)一步實現(xiàn)信號的多種放大。WEI等[24]在電極表面負(fù)載了雙鏈DNA(dsDNA)后，在加入OTA促使雙鏈解開的同時，又加入了RecJ(f)進(jìn)行靶標(biāo)回收實現(xiàn)信號放大，解開的鏈繼續(xù)與作為模擬酶的Au@Pt/MIL-101(Cr)反應(yīng)，重新雜交形成雙鏈，實現(xiàn)在H2O2存在下對苯二酚的催化，導(dǎo)致電信號發(fā)生改變，實現(xiàn)對OTA的定量檢測。該傳感器通過對核酸外切酶的引用，實現(xiàn)了循環(huán)切割，不斷對OTA進(jìn)行回收，進(jìn)一步實現(xiàn)信號擴(kuò)增，獲得了較低的檢測限(0.17×10-3μg/L)。基于RecJ(f)策略，LI等[25]構(gòu)建了一種新型的無標(biāo)記阻抗型電化學(xué)傳感器，該研究以殼聚糖/二肽納米纖維水凝膠薄膜作為電極基底，在上面固定OTA適配體，并引導(dǎo)其與DNA2鏈進(jìn)行雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)以固定DNA2鏈。在目標(biāo)物OTA的存在下，雙鏈解離為單鏈，并通過引入RecJ(f)外切酶循環(huán)消化單鏈DNA實現(xiàn)信號擴(kuò)增，檢測限為0.03 μg/L。除核酸外切酶能夠通過對循環(huán)剪切作用進(jìn)行信號放大外，DNA酶(DNAzyme)、DNA walker和一些協(xié)同作用等在信號放大方面也表現(xiàn)出了優(yōu)異的性能。WEI等[26]基于DNAzyme和DNA walker設(shè)計了一種新型電化學(xué)傳感器，將OTA適配體與DNA walker雜交形成的雙鏈DNA(dsDNA)和含有腺苷核糖核苷酸(rA)位點(diǎn)的HP固定在電極表面。加入OTA后，OTA與適配體優(yōu)先結(jié)合導(dǎo)致雙鏈解離，含有DNAzyme的DNA walker暴露在電極表面，當(dāng)引入Ag+時，由于DNAzyme的存在，DNA walker會不斷循環(huán)剪切電極表面含有rA的HP，從而降低了電極的負(fù)電荷密度，進(jìn)而提高了電子轉(zhuǎn)移速率，導(dǎo)致電信號增強(qiáng)。結(jié)果表明，引入Ag+后的峰值電流比不引入Ag+的峰值電流增加4.58倍，在0.001～5 μg/L內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，檢測限為0.1×10-3μg/L。

WANG等[27]基于表現(xiàn)出優(yōu)異的導(dǎo)電性和較大表面積的三維海綿狀多孔結(jié)構(gòu)氧化石墨烯海綿(GOS)和金納米花(AuNF)設(shè)計了一種在GOS上負(fù)載聚(3，4-乙烯二氧基噻吩)-金納米花(PEDOT-AuNF)復(fù)合材料的無標(biāo)記電化學(xué)適配體傳感器，當(dāng)PEDOT和氧化石墨烯之間的pi-pi填料相互作用，支撐GOS表面的PEDOT-AuNF時，會產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，為適配體提供第二次擴(kuò)增，從而實現(xiàn)多重信號放大。該檢測技術(shù)具有良好的選擇性和重現(xiàn)性，檢測范圍為0.01×10-3～20×10-3μg/L，檢測限為4.9×10-6μg/L。

3 結(jié)語

在眾多傳統(tǒng)技術(shù)和傳感器中，基于OTA適配體的電化學(xué)傳感器能夠脫穎而出，主要是因其操作簡單、靈敏度高、選擇性和重復(fù)性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)。但同時，電化學(xué)適配體傳感器也存在適配體保存較麻煩等缺點(diǎn)。目前電化學(xué)適配體傳感器在檢測OTA的研究上已經(jīng)獲得了很多進(jìn)展，隨著研究的不斷開展與深入，新的傳感器構(gòu)建策略、納米材料的開發(fā)和復(fù)合、DNA或RNA鏈的篩選可以使得電化學(xué)適配體傳感器在未來具有更大的發(fā)展空間。