基于蒽的衍生物的合成與性能研究

＊王宏亮 蘇曉蕊 孫曉敏 薛婧婧 宋佳星 張曉娟

（忻州師范學(xué)院 山西 034000）

1.研究背景

谷胱甘肽（GSH）是有機(jī)體中許多小分子的重要組成部分[1]。有抵抗氧化和清除自由基的功能，作用十分重要。近年來(lái)，很多熒光探針都有了谷胱甘肽的身影。然而，在氧化應(yīng)激條件下，谷胱甘肽水平經(jīng)常升高，對(duì)ROS/RNS損傷的敏感性與谷胱甘肽水平密切相關(guān)。在這一方面，谷胱甘肽穩(wěn)態(tài)失調(diào)已被確定可以成為許多的指標(biāo)[2-3]。鑒于這些硫醇在生物學(xué)上的重要性，我們有興趣開(kāi)發(fā)合適的熒光探針，以實(shí)現(xiàn)其對(duì)谷胱甘肽的選擇性測(cè)量和定位。傳統(tǒng)的電化學(xué)方法、液相色譜法需要大量精確的樣本，且只能檢測(cè)到硫醇的總量。熒光分析法，也具有直接標(biāo)記活細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)限低而且易于操作，成為當(dāng)前檢測(cè)硫醇分子最被廣泛使用的一種方法[4-5]。這次實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容是合成一種開(kāi)啟型熒光探針，檢測(cè)機(jī)理是“巰基對(duì)缺電子芳環(huán)的親核取代”[6]?；诖?，我們開(kāi)發(fā)了一種反應(yīng)后發(fā)出黃色熒光的開(kāi)啟型熒光探針，以9-蒽甲醛衍生物為熒光團(tuán)，與2,4-二硝基苯磺酰氯發(fā)生一個(gè)反應(yīng)，熒光猝滅，使目標(biāo)探針?lè)肿由韼缀鯖](méi)有熒光，紫外燈照射下基本看不見(jiàn)其發(fā)光。該探針的熒光開(kāi)啟響應(yīng)來(lái)自于它與谷胱甘肽的反應(yīng)，加入響應(yīng)物質(zhì)之后，巰基本身由于非常強(qiáng)的親核能力，導(dǎo)致磺酸酯鍵極易斷裂，熒光探針的主體結(jié)構(gòu)恢復(fù)，從而熒光增強(qiáng)[7]。

當(dāng)某一指定物質(zhì)，吸收了外界給它的能量之后，會(huì)釋放出不同強(qiáng)度、不同波長(zhǎng)的光，就是我們所說(shuō)的“熒光”[8]。可以說(shuō)是這一物質(zhì)吸收了特定波長(zhǎng)入射光的能量，緊接著又發(fā)出波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光。物質(zhì)吸收了紫外光之后可以發(fā)出紫外熒光或可見(jiàn)熒光，可以發(fā)現(xiàn)它們的波長(zhǎng)變化，就是比紫外波長(zhǎng)更長(zhǎng)，如果是吸收了波長(zhǎng)較短的可見(jiàn)光，那么就可以發(fā)射出波長(zhǎng)變化更加大、更長(zhǎng)的可見(jiàn)熒光[9]。

熒光探針是熒光性質(zhì)可以隨著所處環(huán)境變化而變化的一類(lèi)熒光分子。熒光探針的應(yīng)用在我們的生產(chǎn)、生活中非常廣泛[10]。熒光探針不僅在化學(xué)應(yīng)用，在生物、環(huán)境領(lǐng)域也發(fā)揮了很大的作用。熒光探針通常是由識(shí)別基團(tuán)、熒光基團(tuán)和連接體部分組成，當(dāng)與被檢測(cè)物質(zhì)接觸時(shí)可以看到探針熒光信號(hào)的變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)被檢測(cè)物質(zhì)的定性與定量。在生物化學(xué)和環(huán)境檢測(cè)研究上具有重要意義[11-12]。9-蒽甲醛衍生物是一種穩(wěn)定的光化學(xué)物質(zhì)，具有良好的熒光性能，基于此我們開(kāi)發(fā)了一種亮黃色的熒光探針。9-蒽甲醛衍生物與2,4-二硝基苯磺酰氯反應(yīng)生成一種熒光探針，可以稱(chēng)為“磺酸脂”用于檢測(cè)存在于生物活細(xì)胞中的硫醇分子。2,4-二硝基苯磺酰氯的吸電子能力很強(qiáng)，可以讓熒光團(tuán)熒光猝滅。加入被檢測(cè)的物質(zhì)以后，由于硫醇分子中的巰基的強(qiáng)親核作用，發(fā)生一個(gè)反應(yīng)使合成的探針?lè)肿踊撬狨ユI斷裂，導(dǎo)致熒光探針發(fā)光主體結(jié)構(gòu)恢復(fù)，熒光逐漸變強(qiáng)。9-蒽甲醛衍生物原料便宜易得、制備方法簡(jiǎn)便、條件溫和，有良好的應(yīng)用前景。該類(lèi)材料的生產(chǎn)在生物與環(huán)境檢測(cè)的應(yīng)用具有重要作用及意義[13]。

2.實(shí)驗(yàn)部分

(1)儀器

電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市，三水科學(xué)儀器有限公司）；數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器（上海市，予名儀器設(shè)備有限公司）；WFH2 204B型手提式紫外燈（上海精科有限公司）；循環(huán)水式真空泵（鞏義市，予華儀器有限責(zé)任公司）；Bruker AV-400型超導(dǎo)核磁共振儀（德國(guó)，Bruker公司）；F-4600熒光分光光度計(jì)（日本日立公司）。

(2)原料與試劑

原料：對(duì)羥基苯乙腈；4-甲基苯磺酸吡啶；3,4-二氫-2H吡喃；9-蒽甲醛；2,4-二硝基苯磺酰氯；三乙胺（以上原料均購(gòu)買(mǎi)于薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司，中國(guó)）；試劑：無(wú)水乙醇（99%）；二氯甲烷；四氫呋喃；氫氧化鈉（96%）（以上試劑均購(gòu)買(mǎi)于天津歐博凱化工有限公司，中國(guó)）除特別注明以外，均未經(jīng)處理直接使用。

(3)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

①合成路線

②合成步驟

A.中間體1的合成

量取對(duì)羥基苯乙腈（3g，0.014mol）和4-甲基苯磺酸吡啶（2.83g，0.011mol）于100mL茄形瓶中，加入溶劑二氯甲烷50mL，攪勻。在冰水浴條件下滴加（3.08mL，0.035mol）3,4-二氫-2H吡喃，室溫下攪拌12h。反應(yīng)結(jié)束后，先用水萃取三次洗去4-甲基苯磺酸吡啶鹽，再用飽和碳酸鈉水溶液洗去未反應(yīng)完的原料對(duì)羥基苯乙腈，最后，取洗滌過(guò)的有機(jī)相旋干，固體用石油醚超聲洗滌除去3,4-二氫-2H吡喃。產(chǎn)物自然晾干，得產(chǎn)物2.5g，產(chǎn)率為62.6%。

B.中間體2的合成

稱(chēng)取9-蒽甲醛（0.5g，0.0024mol）和中間體1（0.58g，0.0026mol）于有冷凝裝置的100mL茄形瓶中，取50mL無(wú)水乙醇作溶劑，超聲10min使其充分溶解。取氫氧化鈉固體（0.097g，0.0024mol）于10mL無(wú)水乙醇中，超聲使其溶解后滴加于反應(yīng)體系，室溫下攪拌過(guò)夜。反應(yīng)結(jié)束后先抽濾，用水洗滌后用無(wú)水乙醇洗滌得固體，烘干后得產(chǎn)物0.6g，產(chǎn)率為61.7%。

C.中間體3的合成

稱(chēng)取中間體2（0.5g，0.0012mol）于有冷凝裝置的100mL茄形瓶中，加入10mL四氫呋喃作溶劑，使其溶解后滴加濃鹽酸0.5mL，70℃下回流30min。等待反應(yīng)結(jié)束后，先旋干溶劑，后加水洗滌抽濾得固體，烘干得0.3g，產(chǎn)率為75.9%。

D.目標(biāo)產(chǎn)物4的合成

取中間產(chǎn)物3（0.16g，0.005mol）和三乙胺（0.1g，0.001mol）于100mL茄形瓶中，取二氯甲烷20mL溶劑，?。?.15g，0.00056mol）2,4-二硝基苯磺酰氯溶解于少量二氯甲烷中。將溶解后的2,4-二硝基苯磺酰氯在攪拌和冰水浴的條件下滴加于茄形瓶中，室溫?cái)嚢?.5～5.5h。反應(yīng)完畢，先用水猝滅反應(yīng)，取有機(jī)相旋干得固體產(chǎn)物，重結(jié)晶后得純凈產(chǎn)物0.18g，產(chǎn)率為65.6%。

目標(biāo)產(chǎn)物4的核磁表征：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 9.15(d,J=2.2Hz,1H)，9.02(s,1H),8.77(s,1H),8.67(d,J=8.7,2.3Hz,1H),8.36(d,J=8.7Hz,1H),8.25-8.17(m,2H),8.12-8.04(m,4H),7.64-7.58(m,4H),7.48-7.42(m,2H)。

3.結(jié)果與討論

(1)結(jié)構(gòu)表征: 核磁共振氫譜

如圖2所示，使用核磁共振氫譜進(jìn)行表征，確為目標(biāo)產(chǎn)物。

(2)光譜性質(zhì)

為了研究探針4對(duì)谷胱甘肽的檢測(cè)是否可行，我們使用紫外分光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)，分別作了有無(wú)谷胱甘肽時(shí)的紫外光譜圖和熒光光譜圖。研究了探針4的光譜性質(zhì)。研究結(jié)果如下所示：

①紫外-可見(jiàn)吸收光譜

如圖3所示：取目標(biāo)探針?lè)肿优渲茲舛葹?.0×10-5mol·L-1的溶液，溶劑為二甲基亞砜（DMSO）。測(cè)得目標(biāo)探針?lè)肿拥淖贤馕展庾V，化合物在DMSO溶液中的吸收光譜顯示出目標(biāo)探針?lè)肿釉?91nm處有一個(gè)顯著的吸收峰。如圖4所示，加入濃度為1.0×10-5mol·L-1的谷胱甘肽30μL，此時(shí)，吸光度增大，吸收峰藍(lán)移，由原來(lái)的391nm藍(lán)移至371nm處，這是由于加入谷胱甘肽后，磺酸酯鍵斷裂，恢復(fù)為中間產(chǎn)物3，共軛強(qiáng)度增大。

②熒光發(fā)射光譜

取目標(biāo)探針?lè)肿优渲茲舛葹?.0×10-5mol·L-1的溶液，化合物以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑、在激發(fā)波長(zhǎng)為391nm下進(jìn)行熒光發(fā)射光譜的測(cè)定。如圖5所示，測(cè)得探針?lè)肿拥臒晒獍l(fā)射光譜圖中的最大吸收波長(zhǎng)為472nm。加入濃度為1.0×10-5mol·L-1的谷胱甘肽30μL以后，最大吸收波長(zhǎng)由472nm紅移至506nm，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，表明探針?lè)肿优c谷胱甘肽發(fā)生了反應(yīng)，對(duì)谷胱甘肽有響應(yīng)。如圖6所示，隨著放置時(shí)間的增長(zhǎng)，分別放置1min、2min、3min以及后續(xù)隨著時(shí)間加長(zhǎng)熒光強(qiáng)度繼續(xù)增強(qiáng)的趨勢(shì)變化不大，受時(shí)間影響程度很小。

發(fā)光機(jī)制如圖7：熒光探針4在加入響應(yīng)GSH后，得到了中間體3，熒光增強(qiáng)。

4.結(jié)論

（1）在相對(duì)溫和的條件下以9-甲醛為原料且以較高收率合成了一種磺酸脂化合物，通過(guò)核磁和質(zhì)譜等分析手段對(duì)此化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了進(jìn)一步的表征。

（2）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種新型的磺酸脂在DMSO中具有良好的溶解性，在紫外吸收光譜中發(fā)現(xiàn)其具有較好的吸收強(qiáng)度，以此測(cè)定其在熒光中的強(qiáng)度。熒光圖譜表明該種物質(zhì)能夠與谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸等硫醇小分子發(fā)生反應(yīng)，和這為其今后在熒光探針領(lǐng)域的發(fā)展提供了一定的基礎(chǔ)。

蒽的衍生物有著相當(dāng)良好的熱穩(wěn)定性，光化學(xué)穩(wěn)定性?？捎米鳠晒夤倌軋F(tuán)。利用9-蒽甲醛合成此熒光探針具有很多優(yōu)勢(shì)，原料便宜易得，合成方法簡(jiǎn)單溫和，而且提純非常容易，這一類(lèi)化合物在活體細(xì)胞檢測(cè)中有許多重要的應(yīng)用。