東營(yíng)鹽堿土壤浸泡水用于螺旋藻的培養(yǎng)研究

＊彭人勇 徐嘉男 劉天中

（1.青島科技大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院 山東 266042 2.中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所 山東 266101）

植物和藻類的生物固碳被認(rèn)為是減排以CO2為主的溫室氣體最有效和可持續(xù)的途徑之一。國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)微藻固碳展開了一系列的研究[1]。全世界鹽堿地存量以及因?yàn)E用化肥而土壤鹽堿化增量面積共計(jì)約10億公頃，對(duì)這些鹽堿（化）土壤的改造是一個(gè)世界性難題。目前以土工作業(yè)為主的物理修復(fù)以及添加改良劑的化學(xué)修復(fù)等壓堿降鹽方法，均不能從本質(zhì)上對(duì)土壤結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進(jìn)行改善，且成本高、可持續(xù)性效果差。利用生物質(zhì)來提升鹽堿土壤中的有機(jī)質(zhì)含量，從而改善其團(tuán)粒結(jié)構(gòu)、通氣、透水性的生物修復(fù)與工程與生物修復(fù)的結(jié)合已成為鹽堿土壤的重要趨勢(shì)。張巍[2]、Singh[3]等均發(fā)現(xiàn)固氮藍(lán)藻能夠增加土壤孔隙度，降低可交換性Na+含量，增加土壤有機(jī)質(zhì)。螺旋藻具有生長(zhǎng)迅速、有機(jī)質(zhì)含量高[4]，能夠適應(yīng)多種復(fù)雜環(huán)境（如污水）等優(yōu)點(diǎn)，因此利用大水浸泡壓堿排鹽的鹽堿地改造工程中的鹽堿浸泡水進(jìn)行螺旋藻的培養(yǎng)，既可以實(shí)現(xiàn)CO2的固定[5]，又可以為鹽堿土壤提供豐富的有機(jī)質(zhì)，有助于形成鹽堿地改良的長(zhǎng)效機(jī)制。東營(yíng)鹽堿地土壤含有大量的Cl-、Na+、SO42-，而植物生長(zhǎng)所需的N、P、K等營(yíng)養(yǎng)離子卻極度貧乏。目前對(duì)其采取的水利工程措施（如深耕、埋暗管）、化學(xué)措施（如脫硫石膏）、生物措施（如耐鹽堿植物的培養(yǎng)）等改良方法，改良周期較長(zhǎng)且易反鹽。本研究擬利用東營(yíng)鹽堿土壤浸泡水來培養(yǎng)螺旋藻，探討螺旋藻在鹽堿土壤浸泡水的生長(zhǎng)特性及對(duì)生化組分進(jìn)行分析，以確定最佳培養(yǎng)條件，提高生長(zhǎng)固碳效率，從而為未來建立在鹽堿地大水漫灌土工作業(yè)時(shí)利用鹽堿浸泡水的螺旋藻培養(yǎng)固碳—有機(jī)質(zhì)提升的土壤改造技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1.材料與方法

(1)藻種與培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)所用螺旋藻藻種（Spirulina platensis）來自中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所。其基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Zarrouk培養(yǎng)基（g/L）：NaNO32.5，K2HPO40.5，K2SO41，NaCl 1，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.04，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，Na2-EDTA 0.08，NaHCO316.8，1mlA5溶液[H2BO32.86，MnCl2·4H2O 1.8，ZnSO4·7H2O 0.222，Na2MoO40.39，CuSO4·5H2O 0.079，Co(NO3)2·6H2O 0.049。

(2)鹽堿土及其浸泡水

實(shí)驗(yàn)用鹽堿土取自山東省東營(yíng)市東營(yíng)區(qū)東七路與南二路交叉口（37°24′15.0″N，118°44′10.0″E），取土深度0～10cm，鹽堿土經(jīng)充分混合、風(fēng)干、研磨、過篩后備用。利用蒸餾水按照5:1的水土比浸泡該鹽堿土，機(jī)械攪拌使其充分混勻后，過濾保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)條件和方法

螺旋藻的培養(yǎng)在柱式玻璃光生物反應(yīng)器中進(jìn)行。反應(yīng)器直徑為3cm，高70cm，每次裝液量為300mL。培養(yǎng)以日光燈為光源，光照強(qiáng)度為100μmol·m-2·s-1，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)溫度控制在24±1℃，并依實(shí)驗(yàn)條件通入含不同體積分?jǐn)?shù)的CO2的混合空氣。

①氮源質(zhì)量濃度的影響：以1.2獲得的浸泡水為水源按Zarrouk培養(yǎng)基的組成要求進(jìn)行培養(yǎng)基配制，其中作為氮源的NaNO3設(shè)置了4個(gè)質(zhì)量濃度梯度：0.625g/L，1.25g/L，1.875g/L，2.5g/L。

②磷源質(zhì)量濃度的影響：同上，作為磷源的K2HPO4設(shè)置了4個(gè)質(zhì)量濃度梯度：1.343g/L，0.671g/L，0.500g/L，0.336g/L。

③光照強(qiáng)度的影響：實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了6 個(gè)光強(qiáng)：即20μmol·m-2·s-1，50μmol·m-2·s-1，90μmol·m-2·s-1，120μmol·m-2·s-1，150μmol·m-2·s-1，200μmol·m-2·s-1。

④光照周期設(shè)置了3個(gè)光照周期（L/D）：10:14，14:10，24:0。

⑤無機(jī)碳源的影響：利用CO2替代NaHCO3，通氣量為0.2vvm，設(shè)置了5個(gè)CO2（v/v）體積分?jǐn)?shù)梯度，即0.038%（空氣），1%，2%，3%，5%。

⑥簡(jiǎn)易培養(yǎng)基對(duì)螺旋藻培養(yǎng)的影響：以1.2獲得的浸泡水為水源，只添加氮和磷元素，并設(shè)置不同的質(zhì)量濃度：A.添加0.500g/L K2HPO4，改變NaNO3質(zhì)量濃度：0.75g/L，1g/L，1.25g/L，1.5g/L，1.75g/L，2.5g/L；B.添加2.5g/L NaNO3，改變K2HPO4質(zhì)量濃度：0.671g/L，0.500g/L，0.448g/L，0.395g/L，0.336g/L。

(4)分析方法

①生物量的測(cè)定

吸取5ml（V）的藻液，抽濾至事先稱重過的醋酸硝酸纖維素膜（W0），并用3倍的去離子水沖洗3次，去掉附著在細(xì)胞表面的營(yíng)養(yǎng)鹽分，置于105℃烘箱中烘干至恒重后再次稱重（W1），生物量計(jì)算方法為W0=(W1-W0)/V[6]。

②固碳速率計(jì)算

CO2固定速率計(jì)算公式如下：CO2的最終固碳速率（Rc）與生長(zhǎng)率（Px）和干藻細(xì)胞含碳量（Ce）有關(guān)，

其中，X1和X2分別為t1和t2天的生物量；Ce為干藻細(xì)胞含碳量，通常藻細(xì)胞中分子量為CO0.48H1.83N0.11P0.01；Mco2為CO2的相對(duì)分子質(zhì)量；Mc是C的相對(duì)原子質(zhì)量。

③生化組成分析

藻液離心后收集藻細(xì)胞，利用冷凍干燥機(jī)凍干后，稱取一定量的干燥藻粉，加入石英砂，充分研磨后，利用元素分析儀[7]進(jìn)行氮元素的測(cè)定，采用苯酚-硫酸法測(cè)定藻細(xì)胞中多糖含量。

④培養(yǎng)基中NaNO3-N和K2HPO4-P質(zhì)量濃度的測(cè)定

NaNO3-N的測(cè)定：新鮮藻液離心后去數(shù)毫升上清液，置于石英比色皿中，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量；K2HPO4-P的測(cè)定：參考《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB11894-89水質(zhì)總磷的測(cè)定鉬酸銨分光光度法》。

⑤鹽堿土壤可溶性鹽含量的測(cè)定

取處理后土壤與蒸餾水按照1:5的比例混合，充分震蕩混合3min后過濾，取濾液利用離子色譜進(jìn)行測(cè)定；碳酸根和碳酸氫根含量利用雙指示劑滴定法進(jìn)行測(cè)定；土壤pH值利用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

2.結(jié)果與分析

(1)土壤可溶性鹽含量測(cè)定

鹽堿土壤浸泡液可溶性鹽含量如表1所示。土壤中含有大量的C l-和Na+，總量達(dá)到土壤可溶性鹽含量的91.3%，NH4+和HCO3-含量較低，但K+、Mg2+、Ca2+等離子較豐富，未檢測(cè)出磷元素和CO32-含量。比較螺旋藻生長(zhǎng)的Zarrouk培養(yǎng)基組成可知，要用浸泡水來培養(yǎng)螺旋藻，必須加入必要質(zhì)量濃度的氮源和磷源。

表1 鹽堿土壤可溶性鹽含量的測(cè)定（c/mg·L-1)

(2)氮源和磷源質(zhì)量濃度對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)的影響

圖1為在不同培養(yǎng)條件下連續(xù)培養(yǎng)15d時(shí)，螺旋藻的生物量變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：氮質(zhì)量濃度為2.5g/L時(shí)，最高生物量可達(dá)14.36g/L（圖1-a）；磷質(zhì)量濃度過高或過低均不利于螺旋藻的生長(zhǎng)，0.5g/L為其最適磷質(zhì)量濃度，此時(shí)螺旋藻所能達(dá)到的最大生物量為12.49g/L，明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組（圖1-b）；雖然鹽堿土浸泡水中Na+和Cl-質(zhì)量濃度較高，對(duì)螺旋藻細(xì)胞的生長(zhǎng)影響不明顯，表明螺旋藻能夠耐受較高質(zhì)量濃度的鹽分。

(3)光照條件對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)的影響

不同光照強(qiáng)度條件下螺旋藻的生長(zhǎng)情況如圖2（a）。隨著光照強(qiáng)度的增加，螺旋藻的生長(zhǎng)速度加快，在120μmol·m-2·s-1時(shí)生物量最大，達(dá)到11.68g/L，但當(dāng)光強(qiáng)大于120μmol·m-2·s-1后，螺旋藻的生長(zhǎng)會(huì)受到光抑制，這與Converti A等[8]的研究結(jié)果相一致，表明120μmol·m-2·s-1左右的光強(qiáng)是螺旋藻生長(zhǎng)的飽和光強(qiáng)。按照夏季和冬季不同的晝夜時(shí)長(zhǎng)，本研究選擇光/暗比分別為10:14和14:10，以24h光照為參照時(shí)進(jìn)行螺旋藻培養(yǎng)，結(jié)果如圖2（b）所示。在24h光照條件下螺旋藻生物量最高，達(dá)到10.95g/L；相比全光照，光暗的交替使螺旋藻生物量的積累變慢，且這一趨勢(shì)隨著光照時(shí)間的減少而愈加明顯。在后期實(shí)驗(yàn)中，采用光強(qiáng)為120μmol·m-2·s-1、24h光照的條件進(jìn)行培養(yǎng)。

(4)螺旋藻對(duì)CO2的利用

Zarrouk培養(yǎng)基中含有大量的NaHCO3，一方面用來為螺旋藻的生長(zhǎng)提供碳源，另一方面調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，使之能夠在適宜的堿性條件下正常良好地生長(zhǎng)。除了NaHCO3，也可以利用CO2作為碳源培養(yǎng)螺旋藻，這樣既可減少無機(jī)鹽的使用，又有利于實(shí)現(xiàn)CO2的固定。本研究考察了在不添加NaHCO3的情況下，不同體積分?jǐn)?shù)的CO2氣體對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)的影響。如圖3（a）所示，當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)由對(duì)照的0.038%（空氣）增長(zhǎng)到3%，生物量迅速增加。當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)超過3%時(shí)，生物量降低，這表明本實(shí)驗(yàn)中，3%是最佳的CO2體積分?jǐn)?shù)。

通入不同體積分?jǐn)?shù)CO2下螺旋藻的CO2固定速度變化如圖3（b）所示。與對(duì)照的通入空氣相比，3% CO2(v/v)體積分?jǐn)?shù)下螺旋藻的生長(zhǎng)達(dá)到最大值，對(duì)應(yīng)的固碳速率也達(dá)到最大值，為2.21g·L-1·d-1，繼續(xù)升高CO2體積分?jǐn)?shù)，螺旋藻固碳速率降低。

(5)簡(jiǎn)易培養(yǎng)基培養(yǎng)螺旋藻

前述結(jié)果表明鹽堿土壤浸泡水來配置Zarrouk培養(yǎng)基可以很好地用于螺旋藻培養(yǎng)。但Zarrouk培養(yǎng)基中除氮磷外的全微量元素的加入是不經(jīng)濟(jì)的。因此基于成本考量，本研究進(jìn)一步考察了直接用鹽堿土壤浸泡水適當(dāng)添加氮、磷元素和通入體積分?jǐn)?shù)為3% CO2（v/v）配置簡(jiǎn)易培養(yǎng)基中螺旋藻的生長(zhǎng)情況。

在加入0.5g/L K2HPO4和不同質(zhì)量濃度的NaNO3下的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基中螺旋藻的生長(zhǎng)情況如圖4（a）所示。NaNO3質(zhì)量濃度從0.75g/L升高到2.5g/L時(shí)，培養(yǎng)8d后螺旋藻細(xì)胞質(zhì)量濃度約為6.5～7.5g/L，與圖1（a）的Zarrouk全培養(yǎng)基下螺旋藻的生長(zhǎng)差別不大，表明鹽堿土壤浸泡水中的微量營(yíng)養(yǎng)元素能夠滿足螺旋藻生長(zhǎng)所需。氮質(zhì)量濃度的高低對(duì)螺旋藻的生長(zhǎng)速率影響不大。

土壤浸泡水中加入不同初始質(zhì)量濃度NaNO3的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基培養(yǎng)螺旋藻過程中培養(yǎng)基氮質(zhì)量濃度的變化如圖4（b）所示。從圖4（b）中可以看出，隨著培養(yǎng)過程的進(jìn)行，培養(yǎng)基中的氮源逐漸被消耗。不同初始氮源質(zhì)量濃度的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基中氮源的消耗速率基本相同，只是當(dāng)初始氮源質(zhì)量濃度較低時(shí)，如初始NaNO3質(zhì)量濃度分別是為0.75g/L、1.0g/L、1.25g/L，1.5g/L和1.75g/L時(shí)，培養(yǎng)基中的氮源分別是在2d、3d、4d、5d和6d就基本上就被螺旋藻細(xì)胞完全吸收。但比較圖4（a），即使培養(yǎng)基中氮源在被消耗完全后，細(xì)胞的生長(zhǎng)仍然沒有停止。這可能與螺旋藻的生化組成特性相關(guān)。不同于其他微藻，螺旋藻細(xì)胞的主要組成部分是蛋白質(zhì)，其從培養(yǎng)基中的高效攝取的無機(jī)氮主要用于蛋白質(zhì)的合成。當(dāng)外界環(huán)境中氮源不足時(shí)，蛋白質(zhì)的繼續(xù)積累雖然受限，但螺旋藻能夠分解利用自身合成蛋白質(zhì)繼續(xù)供給細(xì)胞固定CO2合成有機(jī)碳等骨架分子繼續(xù)生長(zhǎng)。從表2所示不同初始NaNO3質(zhì)量濃度下培養(yǎng)獲得的螺旋藻細(xì)胞的蛋白質(zhì)和多糖組成可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基初始氮質(zhì)量源濃度較低時(shí)，螺旋藻細(xì)胞中的蛋白質(zhì)含量較低，只有18%～25%，而作為諸能物質(zhì)的多糖等碳水化合物受氮脅迫誘導(dǎo)，含量較高，可達(dá)20%～30%。而當(dāng)培養(yǎng)基中氮源充足時(shí)，如NaNO3為2.5g/L時(shí)，其8d培養(yǎng)終點(diǎn)的螺旋藻細(xì)胞中蛋白含量最高，可達(dá)47%左右，這個(gè)時(shí)候細(xì)胞的多糖含量卻只有16%左右。這與Madkour[9]所報(bào)道結(jié)果相一致。培養(yǎng)基成分的改變導(dǎo)致藻細(xì)胞中生化組分發(fā)生變化。

表2 不同NaNO3質(zhì)量濃度培養(yǎng)螺旋藻中蛋白質(zhì)和多糖的含量分析

同樣，在加入0.75g/L NaNO3及不同質(zhì)量濃度的K2HPO4下的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基中螺旋藻的生長(zhǎng)情況如圖5（a）所示。類似地，K2HPO4質(zhì)量濃度從0.336g/L升高到0.671g/L時(shí)，培養(yǎng)8d后螺旋藻細(xì)胞質(zhì)量濃度約為5～6g/L，與圖1（b）的Zarrouk全培養(yǎng)基下螺旋藻的生長(zhǎng)相比，差別不大。初始磷質(zhì)量濃度的高低對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)速率的影響也不明顯。

上述這一結(jié)果表明，只要在鹽堿土壤浸泡水中加入適量的氮和磷源，鹽堿土壤浸泡水中的微量營(yíng)養(yǎng)元素能夠滿足螺旋藻生長(zhǎng)所需。

土壤浸泡水中加入不同初始質(zhì)量濃度K2HPO4的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基培養(yǎng)螺旋藻過程中培養(yǎng)基磷質(zhì)量濃度的變化如圖5（b）所示。從圖中可以看出，與圖4（b）中氮的消耗類似，隨著培養(yǎng)過程的進(jìn)行，培養(yǎng)基中的磷源在培養(yǎng)前期均快速被消耗。K2HPO4質(zhì)量濃度較低時(shí)（0.336g/L和0.395g/L），培養(yǎng)第二天磷的吸收率就達(dá)到92%以上。隨著初始磷質(zhì)量濃度的增大，磷源的完全吸收時(shí)間延長(zhǎng)，如當(dāng)K2HPO4質(zhì)量濃度為0.671g/L時(shí)，培養(yǎng)基中的磷源在第5天才被完全吸收。相較于氮元素，同大多數(shù)微藻一樣，螺旋藻在生長(zhǎng)初期對(duì)于磷源的吸收速度更快。與圖5（a）相似，即使在培養(yǎng)基中磷源被消耗吸收后，細(xì)胞的生長(zhǎng)仍在繼續(xù)。有研究發(fā)現(xiàn)，微藻吸收的無機(jī)磷酸鹽能夠以多磷酸鹽的形式儲(chǔ)存在藻細(xì)胞的多磷酸鹽顆粒中，當(dāng)培養(yǎng)基中磷源缺少時(shí)，這些顆粒就會(huì)消失，釋放出磷源供細(xì)胞生長(zhǎng)。從表3可以看出，與氮源對(duì)微藻細(xì)胞組成的影響不同，不同初始K2HPO4質(zhì)量濃度下螺旋藻細(xì)胞中的蛋白質(zhì)及多糖含量的變化不大，蛋白質(zhì)含量在40%～46%之間，多糖含量在11%～16%之間，這與正常培養(yǎng)基NaNO32.5g/L，K2HPO40.5g/L條件下螺旋藻中蛋白質(zhì)與多糖含量相差不大，由此推斷出磷元素對(duì)螺旋藻細(xì)胞生物量及生化組分變化的影響弱于氮元素對(duì)藻細(xì)胞的影響。

表3 不同初始K2HPO4質(zhì)量濃度的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基中培養(yǎng)螺旋藻的蛋白質(zhì)和多糖含量

3.結(jié)論

利用東營(yíng)鹽堿土壤浸泡水培養(yǎng)螺旋藻，考察了不同氮源和磷源質(zhì)量濃度的鹽堿土壤浸泡水Zarrouk培養(yǎng)基、光照條件、通氣二氧化碳質(zhì)量濃度等對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，利用表明鹽堿土壤浸泡水的Zarrouk培養(yǎng)基完全可用于螺旋藻的培養(yǎng)。在此基礎(chǔ)上考察了土壤浸泡水中只加入氮源和磷源和簡(jiǎn)易培養(yǎng)基對(duì)螺旋藻培養(yǎng)的影響，表明該簡(jiǎn)易培養(yǎng)基培養(yǎng)螺旋藻的效果與Zarrouk全培養(yǎng)基無明顯差別。培養(yǎng)基質(zhì)量氮源濃度和磷源質(zhì)量濃度對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)影響不大，但低氮源質(zhì)量濃度下抑制了螺旋藻蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)了細(xì)胞多糖的合成。東營(yíng)鹽堿土壤浸泡水加入2.5g/L的NaNO3和0.50g/L的K2HPO4，可以支撐螺旋藻的快速生長(zhǎng)。研究結(jié)果為未來建立在鹽堿地大水漫灌土工作業(yè)改造時(shí)利用鹽堿浸泡水培養(yǎng)螺旋藻來實(shí)現(xiàn)固碳—有機(jī)質(zhì)提升的土壤改造技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。