轉(zhuǎn)基因庫安托楊對根際土壤微生物及酶活性的影響1)

李永進(jìn) 湯玉喜 唐潔 吳敏 楊艷

(湖南省林業(yè)科學(xué)院，長沙，410004)

轉(zhuǎn)基因庫安托楊對根際土壤微生物及酶活性的影響1)

李永進(jìn) 湯玉喜 唐潔 吳敏 楊艷

(湖南省林業(yè)科學(xué)院，長沙，410004)

對4年生轉(zhuǎn)基因庫安托楊在生長過程中的土壤微生物和酶活性變化情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因株系的3大類根際微生物數(shù)量和蛋白酶活性分別表現(xiàn)為“增→減→增→減”和“減→增→減”的倒“S”型變化趨勢，土壤脲酶、磷酸酶酶活性的變化趨勢均呈“增→減”的倒“V”字型的變化趨勢，且轉(zhuǎn)基因庫安托楊基本未對微生物數(shù)量和酶活性產(chǎn)生顯著影響。

轉(zhuǎn)基因庫安托楊；根際土壤；土壤微生物；土壤酶活性

From the changes of soil microorganisms and enzyme activity caused by the growth of four-year transgenicPopulus×euramericana‘Guariento’, the number of microorganisms and proteinase activities showed “M” slope and lain letter S slope, respectively. But the change trend of soil urease and phosphotase activities showed lain letter V slope, and transgenicPopulus×euramericana‘Guariento’ had no significant effect on the number of microorganisms and proteinase activities (P>0.05).

20世紀(jì)90年代以來，轉(zhuǎn)基因生物的安全性受到學(xué)術(shù)界和整個(gè)社會的高度重視，轉(zhuǎn)基因植物對非目標(biāo)生物和生態(tài)系統(tǒng)的影響成為一個(gè)研究熱點(diǎn)[1-5]。轉(zhuǎn)基因植物外源基因通過根系的分泌物、植物殘?bào)w和根系脫落物進(jìn)入土壤中，一旦影響到土壤微生物的組成、區(qū)系和酶活性，就有可能影響整個(gè)土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的健康穩(wěn)定，因此轉(zhuǎn)基因植物對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響進(jìn)行研究是生態(tài)系統(tǒng)安全評價(jià)的重要方面。

楊樹是世界上中緯度地區(qū)廣泛栽培的重要用材樹種，同時(shí)也是林木基因工程領(lǐng)域的模式樹種。以往楊樹轉(zhuǎn)基因多是利用單個(gè)目的基因改良林木的個(gè)別性狀,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將多種基因轉(zhuǎn)入楊樹改良其復(fù)雜性狀相對較少[6-9]。2006年王建革等[10]利用基因槍法同時(shí)將5個(gè)外源基因成功轉(zhuǎn)入庫安托楊(Populus×euramericana‘Guariento’)并將成活植株進(jìn)行田間耐澇生理試驗(yàn)[11-12]。但轉(zhuǎn)基因庫安托楊是否會對土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響研究較少，有關(guān)洞庭湖區(qū)的轉(zhuǎn)基因庫安托楊對根際土壤微生物及酶活性的研究更未見報(bào)道。因此，我們對洞庭湖區(qū)轉(zhuǎn)基因庫安托楊對根際土壤微生物、酶活性進(jìn)行了研究，以期為轉(zhuǎn)基因楊樹的推廣應(yīng)用提供參考，并為進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于岳陽市君山區(qū)(28°59′～29°38′N，112°43′～113°15′E)，屬中亞熱帶向北亞熱帶過渡氣候區(qū)，具有濕潤的大陸亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫17 ℃,極端高溫39.3 ℃,極端低溫-11.8 ℃,年平均降水量1 237.9 mm,年均相對濕度80%。土壤為湖潮土，土質(zhì)肥沃，透水性較高。

2 材料與方法

2.1 供試材料

2009年以中國林業(yè)科學(xué)院提供的22個(gè)轉(zhuǎn)基因庫安托楊系號為材料，在岳陽市君山區(qū)上反嘴村進(jìn)行環(huán)境釋放試驗(yàn)，試驗(yàn)林面積約0.25 hm2，造林密度為3 m×4 m。本研究選取轉(zhuǎn)基因庫安托楊其中的4個(gè)株系(D5-4、D5-9、D5-21、D5-25)及一個(gè)非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗?D5-0)，這4個(gè)株系含有不同數(shù)量的外源基因，其目的基因數(shù)量和種類已經(jīng)過測定。轉(zhuǎn)基因庫安托楊所轉(zhuǎn)化的5個(gè)外源基因包括透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)、果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因(SacB)、BtCry3A基因、OC-1基因、JERF36基因。

2.2 土樣采集

于2012年5—11月的中旬用抖根法采集試驗(yàn)林地內(nèi)4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和1個(gè)非轉(zhuǎn)基因株系0～50 cm的根際土壤，取樣采取隨機(jī)取樣法，每個(gè)株系每次重復(fù)4次，將土樣裝入滅菌布袋中混合均勻。土樣采集后放入冰箱中4 ℃保存。

2.3 測定指標(biāo)與方法

土壤全氮測定采用凱氏定氮法、全磷測定采用氫氧化鈉堿熔—鉬銻抗比法、全鉀測定采用氫氧化鈉堿熔—火焰光度法、有機(jī)質(zhì)測定采用重絡(luò)酸鉀—外加熱法(GB7854—87)、土壤pH值采用pH計(jì)測定[13]。土壤微生物測定采用稀釋平板法：細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌用馬丁氏培養(yǎng)基,放線菌用改良高氏I號培養(yǎng)。土壤脲酶活性采用次氯酸鈉比色法測定、土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測定，土壤蛋白酶采用茚三酮比色法測定[14]。脲酶活性以24 h后1 g土壤中NH3-N的質(zhì)量表示；磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法，以24 h后1 g土壤中酚的質(zhì)量表示；蛋白酶活性以24 h后1 g土壤中氨基氮的質(zhì)量表示。

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS10.0、Excel等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 試驗(yàn)林土壤理化性質(zhì)

在試驗(yàn)林內(nèi)隨機(jī)選取8個(gè)樣點(diǎn)采集0～50 cm土樣，然后進(jìn)行理化性質(zhì)的測定(表1)。發(fā)現(xiàn)8個(gè)土樣的理化性質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)偏差值較小，證明試驗(yàn)林土壤本底基本一致。

表1 試驗(yàn)林土壤中各物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較

3.2 轉(zhuǎn)多基因庫安托楊試驗(yàn)林中微生物數(shù)量的變化

土壤中的微生物以細(xì)菌為主，占總數(shù)的90%以上，真菌最少(表2)。在同一月份，4個(gè)轉(zhuǎn)基因庫安托楊株系0～50 cm根際土壤中僅D5-25株系的細(xì)菌、放線菌和真菌的數(shù)量略高于對照，其他轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因株系細(xì)菌、放線菌和真菌的數(shù)量基本相同；轉(zhuǎn)基因株系間、轉(zhuǎn)基因株系與對照間根際土壤中的細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量均無顯著差異(P>0.05)，這與周曉罡，趙蓬暉等[15-17]的研究結(jié)果相一致。在5—11月份的調(diào)查期內(nèi)，轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因株系的細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量大致均呈“增→減→增→減”的變化趨勢，其中5月初由于土壤溫度和水分含量低，微生物處于相對封閉的環(huán)境，養(yǎng)分無法通過水分?jǐn)U散，導(dǎo)致0～50 cm根際土層內(nèi)3大類微生物的平均數(shù)量都低[18-20]；6—9月份是降雨高峰期，也是高溫期，土壤水分充足，利于養(yǎng)分的溶解，易于微生物吸收而使微生物快速繁殖；而10月份地表枯落物增加，可為微生物提供較多養(yǎng)分和能量，使得微生物總數(shù)仍處于較高水平；11月份細(xì)菌、放線菌和真菌的數(shù)量均有下降的趨勢?？傮w上看，根際土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量整體呈現(xiàn)隨降雨、溫度、濕度變化增加而遞增的趨勢[21]，且與非轉(zhuǎn)基因庫安托楊相比，轉(zhuǎn)基因庫安托楊沒有對細(xì)菌、放線菌和真菌產(chǎn)生顯著影響。但由于試驗(yàn)林土壤生態(tài)系統(tǒng)組成、結(jié)構(gòu)、功能復(fù)雜，相關(guān)機(jī)理還有待于做深入的研究和探討。

3.3 轉(zhuǎn)基因庫安托楊對土壤酶活性的影響

同一月份轉(zhuǎn)基因株系與對照株系0～50 cm土壤脲酶、磷酸酶和蛋白酶活性差異不顯著(表3)。3種酶活性隨季節(jié)的變化表現(xiàn)基本一致。其中，土壤脲酶、磷酸酶活性在5月份為最低值，分別介于0.09～0.13和2.86～3.22 mg/(g·d)之間，此后隨著進(jìn)入楊樹生長旺期，轉(zhuǎn)基因楊與對照楊土壤內(nèi)的土壤脲酶活性均迅速上升且變化規(guī)律一致，均在9月份達(dá)到最高值，分別介于0.37～0.46和5.98～6.52 mg/(g·d)之間，之后隨著氣溫的降低開始下降，在整個(gè)調(diào)查期內(nèi)，5個(gè)株系0～50 cm根際土壤中的脲酶、磷酸酶活性大致呈“增→減”的倒“V”字型變化趨勢；而蛋白酶活性6月份最低，變化范圍為1.6～1.8 mg/(kg·d)，而10月份蛋白酶活性最高，介于4.91～5.25 mg/(kg·d)，之后隨著氣候的降低蛋白酶活性逐漸下降。在5—11月份調(diào)查期間，轉(zhuǎn)基因庫安托楊與對照0～50 cm土壤蛋白酶活性均呈減→增→減的倒“S”型變化趨勢。5—11月的土壤脲酶(8月份除外)、磷酸酶、蛋白酶活性與對照均無顯著差異(P>0.05)。表明調(diào)查期內(nèi)轉(zhuǎn)基因楊對土壤脲酶、磷酸酶、蛋白酶活性影響不明顯，但是長期種植轉(zhuǎn)基因庫安托楊是否會造成影響，還需要進(jìn)一步研究。

表2 轉(zhuǎn)基因株系土壤根際微生物數(shù)量季節(jié)動(dòng)態(tài)變化

月份放線菌/106個(gè)·g-1D5-4D5-9D5-21D5-25D5-05月18.16±1.7815.16±1.6614.15±0.5414.56±3.0514.57±0.296月18.16±3.0118.00±3.3719.75±1.9523.39±2.0922.26±2.517月18.16±4.1837.43±6.2223.95±5.1925.44±7.0133.32±4.868月18.16±3.5322.23±3.7122.03±1.1420.07±1.2119.88±1.099月18.16±3.2433.77±2.8736.45±3.7635.62±4.0139.97±2.7810月18.16±2.7320.98±4.3224.96±1.9926.14±2.2321.85±1.3111月18.16±2.1513.79±3.0912.34±2.1217.38±3.2217.98±1.76

月份細(xì)菌/107個(gè)·g-1D5-4D5-9D5-21D5-25D5-05月18.16±0.100.49±0.230.38±0.170.31±0.090.58±0.186月18.16±0.523.10±0.413.60±0.363.92±0.694.62±0.677月18.16±0.252.80±0.473.05±0.312.82±0.373.24±0.308月18.16±0.563.47±0.494.32±0.614.86±0.714.38±0.519月18.16±0.672.27±0.713.07±0.574.25±0.922.63±0.6610月18.16±0.301.93±0.212.55±0.282.75±0.422.69±0.4111月18.16±0.100.37±0.140.19±0.890.11±0.160.37±0.18

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

4 結(jié)論與討論

一直以來，轉(zhuǎn)基因植物對土壤生態(tài)系統(tǒng)可能造成的影響一直是人們進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物安全性評價(jià)的焦點(diǎn)。研究者們在轉(zhuǎn)基因林木對土壤微生物數(shù)量、酶活性的影響方面存在不同意見[22-26]。有些學(xué)者認(rèn)為由于植物殘?bào)w及根際分泌物帶給土壤的Bt毒蛋白需要一定的時(shí)間才能消解，可能對土壤微生物區(qū)系、酶活性產(chǎn)生影響，使根際土壤的磷酸酶活性、脫氫酶和堿性磷酸酶活性顯著降低[27]。但大部分研究結(jié)果尚未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物、酶活性產(chǎn)生明顯影響。如對轉(zhuǎn)基因的棉花、轉(zhuǎn)雙價(jià)抗真菌基因水稻、轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因水稻等從生長繁殖到衰老過程中根際部位土壤中的土壤脲酶、過氧化氫酶、酸性磷酸酶、脫氫酶、多酚氧化酶和蛋白酶等酶的活性與對照相比均無顯著差異；轉(zhuǎn)基因小黑楊根際分泌物不會對土壤多酚氧化酶、脲酶及磷酸酶活性產(chǎn)生顯著性影響等[28-29]。

本文將試驗(yàn)林內(nèi)轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因根際土壤中的細(xì)菌、放線菌和真菌3類微生物進(jìn)行了比較，初步證明庫安托楊轉(zhuǎn)基因植株根際土壤3類微生物數(shù)量與非轉(zhuǎn)基因植株之間雖在不同時(shí)期存在一定差異，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平。這與胡建軍等先后對轉(zhuǎn)基因歐洲黑楊、轉(zhuǎn)基因銀腺楊(P.alba×P.glandulosa)和轉(zhuǎn)抗蟲基因(BtCry3A)741楊試驗(yàn)林土壤微生物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其根際土壤微生物區(qū)系未發(fā)生明顯的變化相一致[30-31]。

表3 轉(zhuǎn)基因株系土壤酶活性季節(jié)動(dòng)態(tài)變化 mg·g-1·d-1

月份磷酸酶D5-4D5-9D5-21D5-25D5-05月3.22±0.143.20±0.043.11±0.112.86±0.112.93±0.116月3.71±0.124.00±0.174.03±0.093.78±0.173.93±0.197月4.28±0.184.60±0.214.21±0.244.12±0.224.36±0.228月4.54±0.194.71±0.354.45±0.314.94±0.314.91±0.329月5.98±0.196.42±0.496.29±0.396.16±0.286.52±0.2710月4.60±0.384.19±0.274.11±0.423.51±0.464.51±0.3311月2.89±0.423.61±0.184.02±0.393.03±0.533.17±0.38

月份蛋白酶D5-4D5-9D5-21D5-25D5-05月2.09±0.121.92±0.221.81±0.191.90±0.202.14±0.116月1.65±0.071.8±0.161.60±0.091.75±0.121.76±0.107月1.97±0.071.93±0.031.80±0.051.84±0.091.99±0.098月1.83±0.152.14±0.052.21±0.182.06±0.162.24±0.229月3.71±0.193.14±0.253.30±0.093.35±0.173.40±0.3110月4.91±0.135.01±0.095.25±0.114.93±0.235.11±0.2311月4.05±0.194.28±0.174.54±0.214.44±0.404.58±0.31

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；8月份土壤脲酶與對照比差異顯著(P<0.05)。

土壤酶在土壤有機(jī)物分解和營養(yǎng)元素循環(huán)過程中起到不可或缺的作用，影響土壤生態(tài)系統(tǒng)中的能量轉(zhuǎn)化、土壤微生態(tài)的環(huán)境質(zhì)量和作物產(chǎn)量。本文研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因庫安托楊試驗(yàn)林土壤脲酶、磷酸酶和蛋白酶活性與非轉(zhuǎn)基因庫安托楊之間同一月份不存在顯著性差異，且3種土壤酶活性存在明顯的季節(jié)性變化。但引起土壤微生態(tài)的波動(dòng)的因素較多，此僅為1 a的調(diào)查數(shù)據(jù)，因此，需要繼續(xù)進(jìn)行長時(shí)間的跟蹤調(diào)查研究，獲得較全面的轉(zhuǎn)基因樹木安全性的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，以評估其大面積釋放的安全性。

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Effect of TransgenicPopulus×euramericana‘Guariento’ on the Microorganism and the Enzyme Activity in the Rhizosphere Soil

Li Yongjin, Tang Yuxi, Tang Jie, Wu Min, Yang Yan(Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, P. R. China)/Journal of Northeast Forestry University，2015,43(2)：55-58.

TransgenicPopulus×euramericana‘Guariento’; Rhizosphere soil; Soil microorganisms; Soil enzyme activity

1) 湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(12JJ3031)；國家林業(yè)局科技發(fā)展中心項(xiàng)目(JJ-11-01)。

李永進(jìn)，男，1980年 9 月生，湖南省林業(yè)科學(xué)院，助理研究員。 E-mail：youngon@126.com。

2014年9月23日。

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責(zé)任編輯：潘 華。