熒光標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展

蒲玲

(上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 201114)

光致發(fā)光技術(shù)，可以分析物質(zhì)特定的量，如發(fā)射光譜、激發(fā)光譜、量子產(chǎn)率、發(fā)光壽命和發(fā)光各異性，它是材料和生命科學(xué)中最為廣泛使用的工具之一[1-7]。分子發(fā)光包括熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光等類型。熒光是光致發(fā)光的一種，是物質(zhì)從吸收光能躍遷至激發(fā)態(tài)后，又返回基態(tài)能級(jí)時(shí)所發(fā)射的光[8]。在常溫下，熒光生色團(tuán)分子處于基態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)，處于基態(tài)的分子吸收能量(光能、化學(xué)能、電能或熱能)后躍遷至激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快重新衰變回基態(tài)，衰變過程中釋放的能量以光的形式釋放出來，產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。由于發(fā)光物質(zhì)不同，熒光有分子熒光和原子熒光之分，分子熒光為帶光譜，原子熒光為線光譜，通常所說的熒光為分子熒光。通過測定所發(fā)射熒光的特性和強(qiáng)度，可以對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析。

基于熒光檢測的一般程序是將熒光團(tuán)偶聯(lián)到某個(gè)探針上，并測定生物分子中探針的指標(biāo)熒光來達(dá)到檢測的目的。除了熒光偶聯(lián)化學(xué)的發(fā)展外，還開發(fā)了特殊的儀器來檢測這些熒光探針，如流式細(xì)胞儀、數(shù)字熒光顯微鏡、熒光法酶標(biāo)分析儀、流式細(xì)胞儀、熒光定量PCR 等。與常規(guī)儀器方法相比，熒光分析法在生理?xiàng)l件下的應(yīng)用具有許多特點(diǎn)，如有較高的靈敏度、較好的選擇性、操作簡單、成本低、響應(yīng)快、能實(shí)時(shí)檢測等優(yōu)點(diǎn)。

隨著熒光技術(shù)的發(fā)展和熒光類設(shè)備的廣泛應(yīng)用，熒光設(shè)備的性能驗(yàn)證、計(jì)量溯源、日常質(zhì)量控制的需求也越來越多，用于對(duì)熒光設(shè)備計(jì)量性能控制的熒光標(biāo)準(zhǔn)的需求也逐漸增多。建立可靠、可比較的熒光測量需要根據(jù)儀器類型和具體的應(yīng)用，對(duì)儀器的波長和光譜狹縫寬度精度、檢測系統(tǒng)線性、發(fā)射系統(tǒng)的光譜響應(yīng)(檢測系統(tǒng)的響應(yīng)性或發(fā)射光譜校正)、到達(dá)樣品的光譜輻照度(激發(fā)光束強(qiáng)度的光譜校正)、靈敏度(分析物的檢出限)和日常性能進(jìn)行驗(yàn)證。

自1972 年以來，ASTM 已經(jīng)在E13.01 紫外、可見光和發(fā)光光譜小組委員會(huì)的管轄下提供了熒光光譜的標(biāo)準(zhǔn)測試方法，包括波長精度和光譜分辨率的測試(E388)[9]，檢測系統(tǒng)線性度測試(E578)[10]和檢出限測試(E579)[11]等標(biāo)準(zhǔn)方法。目前熒光技術(shù)的應(yīng)用依賴于儀器分析，通過儀器分析可以分析物質(zhì)的特異性熒光信號(hào)，但是目前絕對(duì)熒光強(qiáng)度的測量方法較少且不方便實(shí)施。熒光標(biāo)準(zhǔn)直接影響了熒光測量儀器的表征和性能驗(yàn)證，測量數(shù)據(jù)的溯源性，儀器間數(shù)據(jù)的可比性，因此熒光標(biāo)準(zhǔn)的研究對(duì)于更好的推廣熒光技術(shù)、建立更高標(biāo)準(zhǔn)的測量具有重大的意義，目前比色法和部分流式細(xì)胞術(shù)[12]在標(biāo)準(zhǔn)化方面做得比較好，是大多數(shù)發(fā)光測量技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)建立的范例。

1 熒光標(biāo)準(zhǔn)的分類

熒光標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)其適用范圍和應(yīng)用范圍可分為儀器校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)、熒光儀器性能的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)、特殊應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)所應(yīng)用的場景，這些標(biāo)準(zhǔn)既可以是物理標(biāo)準(zhǔn)也可以是化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。物理標(biāo)準(zhǔn)通常是以設(shè)備的形式出現(xiàn)，如標(biāo)準(zhǔn)光源、校準(zhǔn)過的檢測器等[13]。物理標(biāo)準(zhǔn)通常又被稱為物理傳遞標(biāo)準(zhǔn)(PTS)，在校準(zhǔn)儀器時(shí)，將一個(gè)已知的量值傳遞至儀器?；瘜W(xué)標(biāo)準(zhǔn)是基于發(fā)光團(tuán)的液體或固體參考物質(zhì)。根據(jù)化學(xué)熒光標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用范圍，化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)又分為波長標(biāo)準(zhǔn)、發(fā)射標(biāo)準(zhǔn)和激發(fā)標(biāo)準(zhǔn)等。與物理標(biāo)準(zhǔn)一樣，化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)可用于傳遞熒光強(qiáng)度量值，但是目前都是通過相對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行量值傳遞，絕對(duì)熒光強(qiáng)度仍然是一個(gè)難題?？伤菰吹臏y量是實(shí)現(xiàn)世界范圍內(nèi)可比性的基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)通過形成文件的不間斷的校準(zhǔn)鏈將測量結(jié)果與適當(dāng)?shù)膮⒖紝?duì)象相關(guān)聯(lián)，建立并保持測量結(jié)果的計(jì)量溯源性[14]。一般熒光溯源鏈?zhǔn)堑蜏剌椛溆?jì)和黑體輻射體通過絕對(duì)測量將量值傳遞給物理傳遞標(biāo)準(zhǔn)(如檢測器標(biāo)準(zhǔn)、光源標(biāo)準(zhǔn))、物理傳遞標(biāo)準(zhǔn)又通過絕對(duì)或相對(duì)測量將量值傳遞給參考熒光計(jì)，參考熒光計(jì)通過絕對(duì)或相對(duì)測量將量值傳遞給化學(xué)傳遞標(biāo)準(zhǔn)(如熒光光譜標(biāo)準(zhǔn)、校正的發(fā)射光譜、強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)等)，最后通過校準(zhǔn)的方式將量值傳遞給日常使用的熒光儀器，從而實(shí)現(xiàn)熒光數(shù)據(jù)的可比性。

1.1 儀器校準(zhǔn)用熒光標(biāo)準(zhǔn)

儀器校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)是用來確定和校準(zhǔn)儀器的偏差，保證儀器的計(jì)量技術(shù)性能能滿足測量要求。這類標(biāo)準(zhǔn)可以是物理器具也可以是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，它們可以用來確認(rèn)儀器的性能，從而使得熒光類儀器能得到與儀器無關(guān)但可比較的熒光數(shù)據(jù)。

1.2 熒光儀器性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)

熒光儀器性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)可用于定期對(duì)熒光儀器進(jìn)行性能驗(yàn)證，這類標(biāo)準(zhǔn)可以是物理標(biāo)準(zhǔn)或者化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)需要驗(yàn)證的參數(shù)，它可以與儀器校準(zhǔn)用的標(biāo)準(zhǔn)相同。性能驗(yàn)證和驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)是熒光儀器最廣泛需要的標(biāo)準(zhǔn)，通過性能驗(yàn)證來確保測量的一致性。儀器性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)是在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，熒光強(qiáng)度不隨時(shí)間推移而變化，最好與普通樣品(如試管或96 微孔板)的測量幾何形狀相匹配。與校準(zhǔn)的光譜等傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)不同，非專業(yè)人員也容易掌握這類標(biāo)準(zhǔn)的使用方法。商業(yè)化的固體和液體標(biāo)準(zhǔn)樣品，大多可做成比色皿的形式，以便于開展日常設(shè)備的性能驗(yàn)證。通常固體樣品的光穩(wěn)定性比較好，液體樣品可以應(yīng)用在不同的樣品容器而使得應(yīng)用更加廣泛。熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)在儀器性能驗(yàn)證中應(yīng)用最廣泛，通過(相對(duì))光譜強(qiáng)度的測量來檢查儀器的日常性能和長期穩(wěn)定性，這類標(biāo)準(zhǔn)可以不溯源或認(rèn)證。

1.3 特定用途的熒光標(biāo)準(zhǔn)

特定用途的熒光標(biāo)準(zhǔn)是用于協(xié)助測定某些光致發(fā)光量或通過相對(duì)熒光強(qiáng)度的測量來比較熒光溶液的濃度。這類標(biāo)準(zhǔn)具有與測量范圍相關(guān)的特性，與待測樣品的特性也相似，包含有熒光強(qiáng)度、熒光壽命、熒光各向異性、熒光量子產(chǎn)率、發(fā)射各向異性、熒光壽命等標(biāo)準(zhǔn)。

2 熒光標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量要求

良好的熒光標(biāo)準(zhǔn)必須是能用常規(guī)儀器、常規(guī)設(shè)置來測量，否則在熒光標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用中會(huì)受到很多的限制。通常熒光儀器的參數(shù)應(yīng)考慮狹縫寬度(或光譜帶寬)、檢測器的電壓和檢測模式、單色器、偏振器設(shè)置、測量的幾何模型以及積分時(shí)間(或掃描時(shí)間)，配備有脈沖光源類儀器的脈沖持續(xù)時(shí)間和延遲時(shí)間等。

物理傳遞標(biāo)準(zhǔn)的強(qiáng)度通常高出普通熒光化學(xué)物質(zhì)強(qiáng)度的2～4 個(gè)數(shù)量級(jí)，化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)光團(tuán)與被測樣品有相似的發(fā)射特性，在日常應(yīng)用中化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)用性和適用性更加廣泛。大多數(shù)發(fā)光團(tuán)的吸收和發(fā)射光譜、摩爾吸收系數(shù)、量子產(chǎn)率、發(fā)光壽命、熒光偏振或熒光各異性等光譜性質(zhì)與其溫度、粘度、溶劑、極性、質(zhì)子化、pH 值、離子強(qiáng)度、發(fā)光偏振或各向異性等微環(huán)境有關(guān)[15-16]。完美的化學(xué)熒光標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)易于使用，在溶液中足夠穩(wěn)定，吸收和發(fā)射光譜范圍覆蓋被測化合物的光譜范圍，能夠給出其波長范圍內(nèi)發(fā)射或激發(fā)光譜形狀，具有獨(dú)立于激發(fā)波長的發(fā)射光譜和獨(dú)立于發(fā)射光譜的激發(fā)光譜，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間應(yīng)盡可能少的重疊，具有各向同性發(fā)射(熒光各向異性標(biāo)準(zhǔn)除外)，熒光特性對(duì)溫度的依賴性較小，不易被氧淬滅，易于純化。物理標(biāo)準(zhǔn)需知道特定波長下的光譜輻射亮度或光譜響應(yīng)度?；瘜W(xué)標(biāo)準(zhǔn)則要考慮內(nèi)濾光響應(yīng)、樣品邊界的折射、熒光團(tuán)發(fā)射的各向異性，在選擇熒光團(tuán)和測量條件時(shí)，要盡量考慮減少以上這些因素的影響，以減小對(duì)常規(guī)測量的影響。

3 熒光標(biāo)準(zhǔn)的研究進(jìn)展

3.1 波長準(zhǔn)確性標(biāo)準(zhǔn)

波長準(zhǔn)確性可以通過測量光譜和已知光譜的位置的波長比較來得到。在紫外/可見/近紅外光譜區(qū)域內(nèi)，有各種商品化的標(biāo)準(zhǔn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)燈，可以用來測定發(fā)射探測系統(tǒng)或激發(fā)波長選擇器的波長精度。

常見的波長準(zhǔn)確度標(biāo)準(zhǔn)包括有低壓原子燈[9]、鏑釔鋁石榴石晶體(Dy-YAG)[17]、銪摻雜的玻璃或銪摻雜的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、摻蒽的PMMA、摻有氧化鈥溶液或熒光染料的玻璃[18-19]、氙(Xe)燈[20]、帶有漫反射器或散射器的儀器源[20]、水拉曼等。

低壓原子燈因尺寸和形狀像筆通常被稱為筆燈，它通常被放置在樣品位置用于激發(fā)波長準(zhǔn)確度的測定。鏑釔鋁石榴石晶體可以做成標(biāo)準(zhǔn)比色皿的樣式，能方便的插入到比色皿支架進(jìn)行激發(fā)或發(fā)射波長的準(zhǔn)確度測定，但是標(biāo)準(zhǔn)中靠得太近的不能被儀器分辨的峰不能用于波長準(zhǔn)確度的測量。銪摻雜的玻璃或銪摻雜的PMMA 可以做成標(biāo)準(zhǔn)比色皿的樣式來用于激發(fā)或發(fā)射波長準(zhǔn)確度的測量，此類標(biāo)準(zhǔn)的峰值可能會(huì)因玻璃基質(zhì)和樣品溫度的變化而改變。摻蒽的PMMA、摻有氧化鈥溶液或熒光染料的玻璃也可做成標(biāo)準(zhǔn)比色皿的樣式用于激發(fā)或發(fā)射波長準(zhǔn)確度的測量。氙燈適用于使用高壓氙燈作為發(fā)射光源的熒光儀器的波長準(zhǔn)確度的測量。極窄發(fā)射帶的波長標(biāo)準(zhǔn)，特別是低壓原子放電燈，可以用于測定熒光測量系統(tǒng)的光譜分辨率。校準(zhǔn)高精度熒光光譜儀的波長，通常需要選擇在紫外/可見/近紅外光譜區(qū)有極窄發(fā)射譜線的氣體原子燈，此類燈內(nèi)含有汞、氬氣、氖氣等混合氣體，發(fā)射光譜峰的位置會(huì)受氣體壓力的影響而變化，因此原子燈的標(biāo)準(zhǔn)值需要制造商提供。原子燈的光譜發(fā)射強(qiáng)度比化學(xué)熒光標(biāo)準(zhǔn)品大很多，通常需要使用衰減器來避免檢測器光飽和。對(duì)于光譜分辨率較低的儀器，如微孔板類熒光測量儀器或共聚光譜成像系統(tǒng)(光譜帶寬在5～30 nm 之間)，不需要選擇原子氣體燈作為標(biāo)準(zhǔn)來校準(zhǔn)儀器，選擇基于發(fā)光團(tuán)的化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行波長的校準(zhǔn)就能滿足技術(shù)要求。

3.2 相對(duì)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)

測定熒光儀器的(相對(duì))發(fā)射光譜響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)有經(jīng)校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)燈和發(fā)射標(biāo)準(zhǔn)，這類標(biāo)準(zhǔn)必須有已知的發(fā)射光譜，理想情況下這類標(biāo)準(zhǔn)的波長范圍應(yīng)覆蓋被測樣品所需的波長范圍[21-22]。常用的測定熒光測量儀器發(fā)射光譜的標(biāo)準(zhǔn)有以下幾種：

(1)含有汞和氬氣混合氣體的原子燈，建議用于驗(yàn)證高精度熒光計(jì)的波長確認(rèn)(發(fā)射狹縫寬度不大于0.25 nm)；

(2)摻雜多種稀土金屬離子的熒光玻璃，通常用于低光譜分辨率熒光測量系統(tǒng)的波長精度的測定和驗(yàn)證；

(3)積分球式輻射體，該標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證的光譜輻射度原則上等于其校正后的發(fā)射光譜；

(4)經(jīng)認(rèn)證的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或參考物質(zhì)。

典型的物理光譜輻射傳遞標(biāo)準(zhǔn)，如鎢燈、積分球式輻射體燈等具有非常寬的發(fā)射光譜，但是它們的發(fā)射強(qiáng)度均超過常用熒光樣品的熒光強(qiáng)度至少2～4 個(gè)數(shù)量級(jí)，因此不適用于常規(guī)分析用熒光計(jì)。大多數(shù)熒光測量系統(tǒng)更適合使用經(jīng)認(rèn)證的化學(xué)發(fā)射光譜標(biāo)準(zhǔn)。在分子熒光分析計(jì)量領(lǐng)域，國外主要有美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(NIST)研制的編號(hào)為SRM2940～2944 的一系列熒光校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及德國聯(lián)邦材料檢驗(yàn)研究院(BAM)研制的編號(hào)為BAMF001～F005 的一系列熒光校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，國內(nèi)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有GBW(E)130100 硫酸奎寧熒光標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、GBW(E)136758DCM 正丙醇溶液相對(duì)熒光發(fā)射強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、GBW(E)136757DPA鄰二甲苯溶液相對(duì)熒光發(fā)射強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、GBW(E)136756 羅丹明B 甲醇溶液相對(duì)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)?；瘜W(xué)發(fā)射標(biāo)準(zhǔn)的校正發(fā)射光譜可以在已溯源至物理傳遞標(biāo)準(zhǔn)的熒光計(jì)上測量。發(fā)射標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)具有中高量子產(chǎn)率，以增強(qiáng)信噪比，減少雜散光、溶劑和雜質(zhì)對(duì)熒光光譜的影響。熒光發(fā)射各異性決定了熒光標(biāo)準(zhǔn)是否需要配備偏振片一起使用，當(dāng)熒光發(fā)射各異性小于等于0.05 時(shí)，可以不使用偏振片。

測定熒光儀器的(相對(duì))激發(fā)光譜響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)有經(jīng)校準(zhǔn)的檢測器和激發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。典型的標(biāo)準(zhǔn)有已知光譜響應(yīng)率或已知的校正熒光激發(fā)光譜物理傳遞標(biāo)準(zhǔn)如硅光電發(fā)光二極管和經(jīng)認(rèn)證的化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，若使用稀釋熒光染料做標(biāo)準(zhǔn)，其光程為1 cm 時(shí)吸光度應(yīng)小于等于0.05。

3.3 熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)

熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)是通過比較樣品的熒光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強(qiáng)度來測量熒光物質(zhì)的濃度，熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)大多數(shù)情況下是化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。將化學(xué)濃度與儀器響應(yīng)關(guān)聯(lián)起來，通過比較標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的熒光強(qiáng)度來進(jìn)行定量測量，這種熒光標(biāo)準(zhǔn)通常需要被測樣品與標(biāo)準(zhǔn)有相同的熒光團(tuán)。將化學(xué)濃度與儀器響應(yīng)聯(lián)系起來的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)在相同的測量條件下，將樣品的光譜輻射度或熒光強(qiáng)度與已知熒光團(tuán)濃度的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，從而量化熒光團(tuán)的濃度或數(shù)量[23]。如NIST 提供的熒光素標(biāo)準(zhǔn)溶液SRM1932 旨在用于建立基于等效可溶性熒光團(tuán)(MESF)單元分子的熒光強(qiáng)度參考標(biāo)準(zhǔn)[24]，這種強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)通常依賴于與相同的待量化的熒光團(tuán)。一個(gè)經(jīng)典的例子是使用熒光檢測的高效液相色譜(HPLC)對(duì)熒光分析物，如多環(huán)芳烴(PAHs)進(jìn)行定量分析，是在相同或非常相似的化學(xué)成分的溶液中，對(duì)自由熒光團(tuán)(即未結(jié)合熒光團(tuán))的熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較，待測發(fā)色團(tuán)和標(biāo)準(zhǔn)品處于相同的微環(huán)境中，因此具有相同的熒光光譜、摩爾吸收系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率，可以推導(dǎo)出樣品中熒光團(tuán)的絕對(duì)數(shù)量。

為了比較自由熒光團(tuán)和固定熒光團(tuán)，樣品和標(biāo)準(zhǔn)中染料的微環(huán)境不同如附著在珠、顆粒或大分子和生物分子上的染料，開發(fā)了等效熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)的概念，這個(gè)概念是用一個(gè)簡單而相對(duì)的強(qiáng)度標(biāo)尺，使得在不同的儀器、實(shí)驗(yàn)室和同一種儀器之間的測試具有可比性?；诘刃Э扇苄苑肿訜晒鈭F(tuán)(MESF)開發(fā)的流式細(xì)胞術(shù)[25-27]，是通過在明確定義的微環(huán)境中使用與樣品(即熒光標(biāo)記)相同的熒光團(tuán)來最小化環(huán)境對(duì)熒光團(tuán)定量的影響。這些方法不能提供樣品中熒光團(tuán)的絕對(duì)數(shù)量，但提供一個(gè)近似的數(shù)字從而進(jìn)行更加廣泛的定量測試。NIST 提供的熒光標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM1934 就是其中一個(gè)例子，該標(biāo)準(zhǔn)包含熒光素溶液、尼羅紅溶液、香豆素溶液和別藻藍(lán)熒光蛋白水溶液，可提供可見光譜范圍內(nèi)定量流式細(xì)胞術(shù)的熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)[28]。

3.4 熒光壽命標(biāo)準(zhǔn)

熒光壽命標(biāo)準(zhǔn)，用于校準(zhǔn)或測試發(fā)光壽命測量的時(shí)域和頻域儀器的分辨率[27]。時(shí)間和頻率熒光壽命光譜學(xué)在納秒到更低的皮秒時(shí)間范圍內(nèi)是有價(jià)值的。它們可以用于確定(波長相關(guān)的)檢測系統(tǒng)在同一發(fā)射波長下的時(shí)間響應(yīng)，從而消除色移。合適的壽命標(biāo)準(zhǔn)必須在常使用的發(fā)射波長下，具有與激發(fā)和發(fā)射波長無關(guān)的恒定壽命的單指數(shù)衰減，而且它們的壽命能覆蓋典型測量樣品的壽命，可以使用單一的單指數(shù)衰減熒光團(tuán)，或已知染料的熒光團(tuán)-猝滅劑通過調(diào)整猝滅劑濃度來調(diào)整熒光物質(zhì)的發(fā)射壽命。

由于許多樣品顯示雙指數(shù)、多指數(shù)或非指數(shù)衰減，具有更復(fù)雜的衰減行為，通過混合兩種或兩種以上的熒光溶液，可以得到較好的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。IUPAC關(guān)于時(shí)間分辨熒光方法技術(shù)報(bào)告[27]中介紹了蒽、DPA、香豆素153 等納秒和皮秒熒光壽命物質(zhì)。

3.5 熒光量子產(chǎn)率標(biāo)準(zhǔn)

熒光量子產(chǎn)率標(biāo)準(zhǔn)在熒光測量中經(jīng)常作為參考用于測定分析物的(相對(duì))熒光量子產(chǎn)率[29-31]，通常這些標(biāo)準(zhǔn)與分析物熒光團(tuán)不一樣，但是能覆蓋分析物的激發(fā)和發(fā)射光譜區(qū)域。

熒光量子產(chǎn)率是熒光團(tuán)的一種固有性質(zhì)，它量化了單位面積上吸收激發(fā)光子的數(shù)量所發(fā)射的熒光光子的數(shù)量，可以用熒光光譜儀測定光學(xué)樣品的熒光量子產(chǎn)率。在相同的測量條件下，利用已知樣品或參考樣品的熒光量子產(chǎn)率來確定未知樣品的熒光量子產(chǎn)率，是一種比較容易實(shí)現(xiàn)的相對(duì)測量方法。MAGDE 等[32]為各種溶劑中的羅丹明6G 和熒光素提供了絕對(duì)量子產(chǎn)率，還使用這些數(shù)據(jù)和早期報(bào)告的壽命來計(jì)算輻射和非輻射衰減率，這些數(shù)據(jù)有助于對(duì)一系列熒光標(biāo)準(zhǔn)的測量參數(shù)進(jìn)行交叉檢查。稀高氯酸或硫酸中的硫酸奎寧用作相對(duì)量子產(chǎn)率標(biāo)準(zhǔn)已有50 多年的歷史，Rance 等[33]測定了硫酸奎寧、熒光素、羅丹明B、磺基羅丹明101 在不同溶劑中的量子產(chǎn)率，得到的量子產(chǎn)率穩(wěn)定性均較好。

3.6 熒光各向異性標(biāo)準(zhǔn)

熒光各向異性標(biāo)準(zhǔn)用于校準(zhǔn)或驗(yàn)證儀器的熒光偏振或各向異性的性能。這些標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該在特定的激發(fā)和發(fā)射波長下，具有一組或一定范圍的已知的各向異性。IUPAC 有關(guān)于熒光各向異性的測試方法[34]，文獻(xiàn)中報(bào)道了熒光素、羅丹明、羅丹明101 等物質(zhì)的穩(wěn)態(tài)熒光各向異性和偏振數(shù)據(jù)，可以作為熒光各異性標(biāo)準(zhǔn)的研究參考材料和基礎(chǔ)。

4 結(jié)語

熒光類設(shè)備的計(jì)量溯源、性能確認(rèn)等工作直接影響著實(shí)驗(yàn)室的分析結(jié)果，從而影響生物行業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。隨著熒光技術(shù)的發(fā)展，熒光原理的設(shè)備在各類企事業(yè)單位和科研機(jī)構(gòu)的應(yīng)用越來越廣泛，尤其是在生物領(lǐng)域，近年來隨著生物技術(shù)的發(fā)展和疫情的爆發(fā)，熒光類設(shè)備的量值溯源和質(zhì)量控制需求越來越大，對(duì)于熒光標(biāo)準(zhǔn)研究的重要性也逐漸顯現(xiàn)，未來國家在構(gòu)建熒光體系的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)體系上還有很多值得做的工作。