基層非洲豬瘟熒光定量PCR檢測技術(shù)研究

文│黃麗非 李桂花 秦桂清（廣西壯族自治區(qū)崇左市動物疫病預(yù)防控制中心）

2018—2019年，非洲豬瘟病毒導(dǎo)致我國養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重虧損，尤其是采用傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式的中小型豬場。當(dāng)豬只感染這種外來病毒時，臨床表現(xiàn)多樣，有急性型、亞急性型、慢性型，該病毒傳染性很強，傳播方式有直接接觸、間接接觸和蜱蟲叮咬。因此，非洲豬瘟在我國被列為一類動物疫病。熒光定量PCR是一種靈敏度高、特異性強、便捷快速的檢測技術(shù)。其反應(yīng)是在PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)上添加含有熒光因子的特異性探針，再利用具有熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶切斷探針，釋放熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，因此熒光信號的強弱代表模版DNA的擴增量。目前我國主要使用該方法檢測非洲豬瘟病毒，該方法也是OIE國際貿(mào)易指定試驗方法。

為切實做好非洲豬瘟防控工作，我國正逐步完善基層動物疫病防控基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)，要求各縣（市、區(qū)）建設(shè)病原學(xué)PCR實驗室，以及各屠宰企業(yè)設(shè)立非洲豬瘟實驗室，開展非洲豬瘟檢測工作。由于各方面的原因，縣級和屠宰企業(yè)非洲豬瘟實驗室條件參差不齊，包括實驗室布局、儀器設(shè)備、檢測環(huán)境、實驗室檢測人員等方面。廣西壯族自治區(qū)崇左市地處邊境與越南接壤，7個縣（市、區(qū)）中就有4個邊境縣，非洲豬瘟防控形勢復(fù)雜多變，因此，當(dāng)前非洲豬瘟防控工作的一項重要任務(wù)就是規(guī)范開展非洲豬瘟熒光定量PCR檢測，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度。目前，崇左市獲得廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳在授權(quán)范圍內(nèi)開展非洲豬瘟檢測業(yè)務(wù)的有市級獸醫(yī)實驗室1個、縣級獸醫(yī)實驗室7個、屠宰企業(yè)非洲豬瘟實驗室7個和養(yǎng)殖企業(yè)非洲豬瘟實驗室5個，現(xiàn)根據(jù)實地調(diào)查中發(fā)現(xiàn)的問題及實驗室工作經(jīng)驗，簡單論述如何提高基層非洲豬瘟實驗室熒光定量PCR檢測技術(shù)。

一、規(guī)范實驗室條件

實驗室存在的主要問題有實驗室功能區(qū)設(shè)置不合理、人員流向不合理、物品流向不合理、未配備生物安全柜等。建設(shè)規(guī)范的非洲豬瘟實驗室相匹配的硬件要求主要有以下兩點。

1.實驗室功能分區(qū)。設(shè)置不少于3個基本的實驗室功能分區(qū)，包括樣品處理區(qū)、試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)、擴增和產(chǎn)物分析區(qū)。實現(xiàn)各工作區(qū)域之間的單向流通，形成單向氣流、物流、人流，避免各區(qū)域相互干擾，減少氣溶膠污染。

2.配備必要的儀器設(shè)備。為滿足基本熒光PCR檢測，實驗室至少應(yīng)配備的儀器設(shè)備有熒光PCR儀、二級生物安全柜、高壓滅菌器、離心機、水浴鍋、微量移液器、冰箱/冰柜、紫外燈和空調(diào)等。各類儀器設(shè)備應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程進行維護，保證其在規(guī)定參數(shù)內(nèi)正常運行。根據(jù)職能所需，在基本滿足實驗室儀器設(shè)備要求的條件上應(yīng)有所增加，如配備核酸提取儀、組織破碎儀、低溫離心機、電腦、打印機、洗眼設(shè)施、自動水開關(guān)等。此外，一些使用頻率比較高的儀器設(shè)備如熒光PCR儀可以多購置一套以備不時之需。

二、管控樣品和試劑

1.做好樣品管控。采樣過程應(yīng)遵循無菌操作原則，選擇合理的采樣方法避免交叉污染，同時做好樣品編號與采樣記錄。全血樣品暫時放4℃冰箱保存，血清樣品放-20℃凍存，PCR檢測用的樣品需盡可能新鮮并低溫保存。所采集的樣品以最快最直接的方式送往實驗室，如果樣品能在24小時內(nèi)送達，則可以放于4℃左右的容器中運送。樣品送達實驗室后應(yīng)做好登記，盡快進行檢測，48小時內(nèi)無法開展檢測或需要留樣的應(yīng)-20℃冷凍保存。

2.嚴(yán)格管控試劑。使用的檢測試劑要符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部相關(guān)要求，按照試劑盒要求妥善保存。試劑存放時溫度偏高不僅容易揮發(fā)還導(dǎo)致產(chǎn)品有效活性降低，非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑通常需要保存在-20℃的環(huán)境中，并在試劑有效期內(nèi)使用。如果單次實驗檢測數(shù)量較少且不經(jīng)常檢測時，建議將試劑進行小體積分裝后-20℃存放，因為反復(fù)凍融也會導(dǎo)致試劑活性下降。分裝試劑也要遵循無菌操作原則，避開PCR產(chǎn)物擴增區(qū)，在潔凈的生物安全柜內(nèi)使用已滅菌消毒的耗材開展分裝操作，避免試劑被污染。分裝試劑應(yīng)做好相關(guān)標(biāo)記，如名稱、時間、含量等，方便準(zhǔn)確使用。推薦有條件的非洲豬瘟實驗室使用加長帶濾芯的槍頭，可以在一定程度上規(guī)避核酸交叉污染的風(fēng)險。不同試劑廠家生產(chǎn)的非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑盒檢測程序與擴增循環(huán)會略有不同，應(yīng)嚴(yán)格按照試劑使用說明書的要求進行操作?？梢愿鶕?jù)不同的對象和要求對檢測樣品進行混樣檢測，但混樣比例不宜過高，容易出現(xiàn)因被檢樣品核酸濃度小于最低檢測限值而出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。

三、提高檢測技術(shù)人員素質(zhì)

不同機構(gòu)性質(zhì)的非洲豬瘟檢測實驗室對檢測技術(shù)人員的學(xué)歷及人員數(shù)量要求有所不同，要求至少具備大學(xué)專科以上獸醫(yī)相關(guān)專業(yè)技術(shù)人員不少于2名。同時建立人員培訓(xùn)及考核制度，檢測人員應(yīng)經(jīng)過相關(guān)法律、法規(guī)、實驗室管理制度、實驗室生物安全防護、檢測技術(shù)規(guī)范、實驗操作技能、儀器設(shè)備使用和維護等相關(guān)培訓(xùn)，且考核合格后再上崗。定期對實驗室檢測人員進行考核、培訓(xùn)和檢測能力比對，也可選擇參加更高級別的實驗室培訓(xùn)或跟班學(xué)習(xí)，全面提升檢測人員的檢測技能。

四、強化實驗室管理

1.加強實驗室指導(dǎo)工作。按照相關(guān)文件要求，市級、縣級疫控系統(tǒng)獸醫(yī)實驗要充分發(fā)揮示范帶頭作用，開展非洲豬瘟病毒檢測項目，完善質(zhì)量手冊、管理手冊有關(guān)內(nèi)容，規(guī)范實驗操作流程，做好管理臺賬等各項工作。各檢測室充分利用樣品比對、儀器比對、抽樣復(fù)核等檢測實驗，強化、細化實驗室檢測技術(shù)員的操作能力，提高檢測精準(zhǔn)度，避免因操作不規(guī)范而導(dǎo)致的污染和結(jié)果偏差。養(yǎng)殖企業(yè)及屠宰企業(yè)開展非洲豬瘟檢測必須獲得省級部門授權(quán)，實驗室條件、設(shè)施設(shè)備、人員等按文件規(guī)定配備，同樣對檢測人員專業(yè)素質(zhì)有要求。省級實驗室應(yīng)加強對市級、縣級、養(yǎng)殖企業(yè)及屠宰企業(yè)實驗室的指導(dǎo)、督導(dǎo)和培訓(xùn)工作，定期開展檢測能力比對實驗，確保轄區(qū)范圍內(nèi)的非洲豬瘟實驗室都能準(zhǔn)確、可靠的給出實驗結(jié)果。

2.實驗室日常消毒與通風(fēng)。檢測實驗操作前后都要先對環(huán)境進行消毒滅菌，去除環(huán)境中可能存在的核酸污染因子。檢測操作前，打開紫外線燈照射整個操作空間20分鐘左右。檢測操作過程中應(yīng)把使用后的槍頭打入盛有一定量有效消毒劑的燒杯中。檢測操作完成后要及時清理操作臺面，選擇合適的消毒藥品進行清潔，可以是堿類、氯化物、酚化合物等，待環(huán)境干燥后再打開紫外線燈照射半個小時。實驗室廢棄物離開實驗室前需經(jīng)高壓滅菌處理，再進行下一步無害化處理，避免污染環(huán)境。很多基層實驗室沒有達到負壓的檢測條件，為減少氣溶膠污染，需要在消毒后定期給實驗室通風(fēng)換氣。

五、結(jié)語

目前用于非洲豬瘟檢測的主要方法是熒光定量PCR、普通PCR法、核酸等溫擴增法、ELSIA法、病毒分離法、熒光抗體法等多種方法，其中熒光定量PCR方法特異性強、靈敏度高，更適合開展快速檢測實驗，因此，在非洲豬瘟診斷和監(jiān)測工作中普遍使用熒光定量PCR檢測方法。由于部分縣級獸醫(yī)實驗室、養(yǎng)殖企業(yè)和生豬屠宰企業(yè)接觸實驗室病原學(xué)檢測比較晚，非洲豬瘟實驗室建設(shè)時間較為倉促，易出現(xiàn)實驗室布局不合理、生物安全方面考慮不夠周全等問題，因此，還需進一步加強管理、強化培訓(xùn)和規(guī)范檢測操作，以整體提升非洲豬瘟檢測技術(shù)，讓熒光定量PCR檢測方法在非洲豬瘟防控工作中發(fā)揮重要的作用。