17β-雌二醇降解微生物篩選及環(huán)境因素的影響

謝文驍,來超超,黃斌,潘學軍

（昆明理工大學 環(huán)境科學與工程學院，昆明 650500）

類固醇雌激素（Steroid estrogens, SEs）對生態(tài)環(huán)境與人體健康的危害廣受關注。17β-雌二醇（E2）是一種典型的SEs，僅在1 ng/L環(huán)境濃度時即可使水生生物產(chǎn)生慢性毒性，使其產(chǎn)生畸變或致癌[1]。課題組前期對昆明市8家城市污水處理廠研究時發(fā)現(xiàn)，污水處理廠中E2的去除率僅為30%～40%，日環(huán)境負荷量高達7.8 g/d，城市生活污水已成為水環(huán)境中E2的重要來源之一[2]。而E2的環(huán)境累積對人類的危害日漸顯現(xiàn)，最近有研究報道[1]，在飲用水及蔬菜水果中均檢出了E2，且最大檢出濃度分別達到1.7、2.2 μg/L。因此，急需尋求高效去除污水處理廠中E2的方法，而提高生化法對E2的處理效率受到了廣泛關注[3]。

大多傳統(tǒng)的生物法與物理化學法污水處理技術可去除一部分SEs[4-5]，其中，光催化等高級氧化法處理水中的SEs已有研究[6]。然而，這些方法都存在高能耗和高成本的缺陷，因而，研究人員正探尋更有效且經(jīng)濟的方法來控制污水中的SEs。SEs在水環(huán)境中的半衰期從幾周到幾年不等[7]。相關研究表明，在自然環(huán)境中，微生物和光化學作用均能有效削減SEs濃度[8-9]，但吸附在水中沉積物上的SEs難以接收光照，表明生物降解在SEs的自然削減中產(chǎn)生了關鍵作用。同時，微生物去除污染物也是一種廉價且環(huán)境友好的技術[10]。因此，研究分析微生物降解SEs的過程及關鍵影響因素，對污水中SEs的去除尤為重要。

微生物去除污染物有兩種方法，即生物吸附和生物降解[11]。生物吸附是一種利用微生物細胞在水生環(huán)境中的一系列物理化學作用吸收污染物的過程[12]。而生物降解是指水中污染物被微生物轉化成中間代謝產(chǎn)物，并最終被礦化的過程。然而，盡管之前一些文獻中已經(jīng)報道了SEs的生物轉化，但生物吸附及生物降解過程對SEs去除的貢獻尚不清楚，復雜的環(huán)境因素對去除SEs的影響也尚不明確，包括碳源、pH值、腐殖質（HS）、重金屬和溶解氧等。為了提高SEs的微生物去除效率，筆者選擇類固醇雌激素化合物E2作為目標污染物，并從洱海底泥中提取富集E2降解微生物進行生物吸附和生物降解實驗，以探究自然過程中微生物對E2的生物吸附和生物降解過程及不同環(huán)境因素對該過程的影響，并分析微生物高效降解E2的最佳環(huán)境條件。

1 材料與方法

1.1 材料準備

E2和標準品腐殖酸（HA）購買自Sigma-Aldrich公司。沉積物來自中國云南省大理市洱海，干燥后使用4.0 mm篩子篩分，用去離子水沖洗。采用國際腐殖酸物質學會的堿溶酸析法提取湖泊沉積物腐殖酸（LHA）和富里酸（LFA）[13]。最后，將制備的LHA和LFA儲備溶液儲存在聚乙烯容器中，在黑暗中以4 ℃保存，并在3周內使用。如未另外說明，所有其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 E2降解微生物Y2的分離與鑒定 稱取100 g洱海底泥樣品與150 mL無機鹽培養(yǎng)基（MSM）混合置于500 mL錐形瓶中，充分振蕩20 min后取上清液。其中，MSM成分為600 mg/L K2HPO4·12H2O、800 mg/L KH2PO4、1 000 mg/L NaCl、800 mg/L NH4NO3、200 mg/L MgSO4、50 mg/L CaCl2·2H2O和10 mg/L酵 母 提 取 物[14]。取5 mL上清液到擴大培養(yǎng)基中（含有10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl），在30 ℃的旋轉振蕩器上以160 r/min的速度培養(yǎng)24 h，以獲得微生物懸浮液。將1.0 mL微生物懸浮液移至含1.00 mg/L E2的250.0 mL MSM中，培 養(yǎng) 至E2濃 度 穩(wěn)定、不被降解為止。E2濃度用高效液相色譜儀（HPLC）檢測。將上述過程循環(huán)7次，以獲得E2降解菌。此后，將1.0 mL微生物懸浮液涂抹至瓊脂平板，并在30 ℃下培養(yǎng)12 h。用新瓊脂將發(fā)育良好的菌落劃線3次后，對培養(yǎng)的菌株進行微生物種類鑒別。

1.2.2 生物吸附實驗 為闡明E2降解微生物對E2的吸附過程，進行了吸附平衡實驗。生物量為1.00 g/L，E2濃度為1.00 mg/L，吸附時間為5 h。生物吸附在30.0 mL MSM中進行，并在30 ℃的旋轉搖床上以160 r/min培養(yǎng)。在溶液中加入濃度為650 mg/L的疊氮化鈉以抑制微生物活性。此后，取1.0 mL樣品于離心管中，以12 000 r/min的速度離心10.0 min。離心后取樣品上清液，使用高效液相色譜儀對E2進行分析。如無額外說明，所有吸附實驗均在此條件下進行。

等溫吸附實驗使用1.00 g/L的生物量吸附不同 濃 度 的E2溶 液（0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、1.75、2.00 mg/L）。E2吸附在微生物上，吸附量G（mg/g） 可用式（1）計算。

式中：C0為E2的初始濃度，mg/L；Ce為E2的平衡濃度，mg/L；Cb為微生物濃度，g/L。

為評估pH值、生物量對E2生物吸附的影響。分別對初始pH值范圍為4.0～10.0和初始生物量為0.08～1.20 g/L的樣品進行吸附實驗。

1.2.3 生物降解實驗 為了評估碳源、H2O2、腐殖質及重金屬對E2生物降解的影響，將1.00 mg/L E2和1.00 g/L微生物加入30 mL MSM的燒瓶中后，在避光條件下以160 r/min的轉速在30 ℃的旋轉搖床上培養(yǎng)。如無額外說明，所有生物降解實驗均在此條件下進行。實驗中，所加碳源為葡萄糖與甲酸鈉，濃度為0.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0 mg/L。H2O2的濃度為0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、8.0、10.0、15.0、20.0 mmol/L，HA濃 度 梯 度 設 為 從0.0到50.0 mg/L不等。

為確定重金屬（Zn2+、Cu2+、Pb2+和Cd2+）存在條件對微生物去除E2的影響，選擇初始濃度分別為0.5、1.5、3.0、5.0、8.0、10.0、12.0、15.0 mg/L的重金屬與1.00 mg/L E2 培養(yǎng)72 h，以闡明重金屬對E2生物降解的影響。

所有實驗在相同條件下進行，試劑及容器均在高壓滅菌鍋中以121 ℃滅菌30 min后使用。所有操作重復3次。

1.2.4 分析方法 采用配備 Waters symmetry-C18 反相柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）和熒光檢測器的高效液相色譜儀（Agilent Technologies1260）對E2進行定量分析。E2以1.00 mL/min的速度用流動相洗脫，在283 nm/345 nm的激發(fā)/發(fā)射波長下檢測。流動相由含有0.1%三氟乙酸的乙腈和超純水以60:40的比例混合而成。E2的檢測限值為0.01 mg/L，所有樣品的相對標準偏差在5%以內。吸附數(shù)據(jù)使用SigmaPlot 12.5進行擬合。

2 結果討論

2.1 E2降解微生物Y2的鑒定

在對底泥樣本中E2降解微生物Y2進行富集篩選后，對培養(yǎng)的菌株進行微生物種類鑒別，鑒別結果如圖1所示，Y2為大腸桿菌。因此，以下實驗均以從底泥樣本中富集的大腸桿菌為降解菌種。

圖1 E2降解菌Y2鑒定層次聚類樹Fig. 1 The phylogenetic tree of E2 degrading bacteria Y2 identification

2.2 生物吸附和生物降解過程的鑒別

為明確生物吸附和生物降解過程對水溶液中E2去除率的貢獻，首先，在30 ℃下進行了1.00 g/L大腸桿菌對1.00 mg/L E2的生物吸附實驗，結果如圖2所示。在最初15 min內，大腸桿菌吸附E2的速率較快，已達到吸附平衡總量的75%，隨后吸附速率變緩，并在60 min時達到吸附平衡，在接下來的4 h內，E2的濃度幾乎沒有變化。大腸桿菌對E2最高吸附量為0.20 mg/g。因此，生物吸附是污水中E2去除的重要過程之一，對該過程的研究具有重要的工程指導意義。

圖2 大腸桿菌對E2的吸附平衡曲線Fig. 2 E. coli adsorption equilibrium curve for E2

為了更好理解大腸桿菌對E2的生物吸附作用，在30 ℃下進行等溫吸附實驗。并根據(jù)E2兩種不同的吸附模型，分別使用Freundlich和Langmuir等溫線吸附模型進行擬合，結果見圖3，具體參數(shù)見表1。這兩種吸附等溫線模型都較好地擬合了生物吸附E2過程。因此，研究中的生物吸附過程主要是細胞表面與E2之間的單層吸附過程[15-16]。在后續(xù)實驗中，使用Langmuir等溫方程計算不同時間細胞上的吸附量。

表1 兩種不同的吸附模型擬合結果Table 1 Fitting results of two different adsorption models

圖3 兩種不同的吸附模型擬合曲線Fig. 3 The fitting curves of two different adsorption models

在72 h的1.00 g/L大腸桿菌對1.00 mg/L E2生物去除實驗中，生物降解率為生物去除率減去生物吸附率，結果如圖4所示，表明在初期8 h內E2的去除主要歸因于生物吸附作用。這可能是由于初期大腸桿菌處于適應期，生物降解速率較慢。隨后生物降速率變快，E2濃度持續(xù)下降。72 h后生物降解率為63.74%，E2的剩余濃度約為0.30 mg/L。因此，生物對E2的去除是初期的快速生物吸附和生物降解的共同作用過程[17]。

圖4 E2的總去除率、生物吸附率及生物降解率Fig. 4 Total removal efficiency, biosorption efficiency and biodegradation efficiency of E2

2.3 pH值與生物量對E2生物吸附的影響

不同pH值和生物量對1.00 mg/L E2的生物吸附率如圖5所示。圖5（a）中，在酸性條件下，1.00 g/L大腸桿菌的生物吸附量隨著pH值的增大逐漸從0.05 mg升高至0.12 mg。當pH值為8時，吸附效率突增至0.28 mg，pH值繼續(xù)升高，吸附效率又急劇下降至0.06 mg。這是由于在酸性條件下高濃度的質子會與E2形成競爭吸附，且質子會與細胞表面的官能團結合成鍵，從而降低生物吸附率[18]。而pH值過高時，溶液中陰離子可能會與E2絡合，導致生物吸附效率下降。因此，將pH值調整為8更有利于微生物對E2的吸附，進而促進微生物降解。在圖5（b）中，生物量與E2的生物吸附效率呈明顯正相關。生物量在0.08～1.20 g/L時，1 h內E2吸附效率從0.08 mg增加至0.21 mg。因此，增加生物量可以有效提高E2的生物吸附率。

圖5 pH值與生物量對生物吸附的影響Fig. 5 Effect of pH value and biomass on the biosorption

2.4 E2的生物降解

2.4.1 碳源對E2生物降解的影響 持久性有機污染物流入水生環(huán)境，可抑制微生物的生長[19]。微生物需要一定時間去適應被污染的環(huán)境。然而，營養(yǎng)物質和SEs會形成共代謝機制來影響水環(huán)境中SEs的生物降解[20-21]。為加速E2的生物降解，研究了不同類型及濃度的碳源對E2生物降解的影響。由于培養(yǎng)72 h后殘留E2濃度太低，無法區(qū)分有機碳源對生物降解的影響，因而選擇48 h作為培養(yǎng)周期，結果見圖6。在碳源的濃度范圍為0.0～50.0 mg/L時，生物降解率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。其中，當達到10.0 mg/L甲酸鈉和40.0 mg/L葡萄糖時，對E2的微生物降解促進效果最明顯，分別提升26.31%和57.47%。主要是由于低濃度外界碳源的增加使微生物活性增加，加速了對E2的代謝過程。但是，降解率并不會隨著碳源的增加而繼續(xù)增大?？赡艿脑蛑皇钱敶嬖诟邼舛鹊耐庠从袡C碳時，微生物將主要代謝有機碳源，而減少了對污染物的代謝降解活動。因此，目標污染物的降解變得難以進行[22]。與甲酸鈉相比，葡萄糖作為碳源更有利于微生物降解E2，降解率最高達到90.50%，這是因為大腸桿菌可以直接利用葡萄糖，而大腸桿菌需要適應甲酸鈉后才能依靠其生長[23]。

圖6 碳源對生物降解率的影響Fig. 6 Effect of carbon sources on the biodegradation efficiency

2.4.2 H2O2對E2生物降解的影響 已有研究表明[24]，溶解氧對水生環(huán)境中SEs的微生物代謝過程非常重要。但精確定量溶解氧相對困難，為了控制溶解氧濃度梯度，選用H2O2作為補充氧源進行48 h實驗[25]，評估H2O2對E2降解可能造成的影響，結果見圖7。結果表明，0.0～20.0 mmol/L H2O2僅可氧化 約0.50%～6.60% E2，而0.0～3.0 mmol/L H2O2與大腸桿菌存在協(xié)同作用，當達到3.0 mmol/L H2O2時，大腸桿菌和H2O2對E2的協(xié)同去除率達到最大值49.44%。當更高濃度的H2O2和大腸桿菌同時存在時會對生物降解產(chǎn)生明顯抑制作用。當H2O2濃度增加到15.0 mmol/L時，E2的降解率僅為1.97%。添加低濃度H2O2后，由于溶解氧的增加提高了微生物的活性，從而獲得更好的生物性能與更高的E2去除率。但H2O2濃度過高時，對細菌的強氧化作用破壞了細胞內的酶，從而抑制了生物活性，導致E2的生物降解率降低[26-27]。

圖7 H2O2對生物降解率的影響Fig. 7 Effect of H2O2 on the biodegradation efficiency

2.4.3 腐殖質對E2生物降解的影響 E2具有穩(wěn)定的芳香結構，表現(xiàn)出較強的疏水性和極低的水溶性，很難被生物體利用，從而限制了生物降解技術的應用[28]。而腐殖質可能作為一種天然表面活性劑促進E2的生物降解[29-30]。因此，研究了72 h內不同濃度腐殖質對E2生物降解率的影響，見圖8。結果表明，當LFA濃度在0.0～10.0 mg/L時，生物去除率最高提升了7.53%，總去除率為77.95%。而相同濃度下LHA對E2生物去除的促進效果更明顯，最高提升21.91%，總去除率達到92.33%。標準品HA效果與其相似。主要存在以下原因：1）腐殖質可以調節(jié)細胞表面的疏水性，增強E2降解菌株的親和力，使生物吸附和代謝得到改善；2）由于腐殖質中具有的親水性和親油性基團能在水溶液中形成聚合物膠團，使E2溶解在其中，增加其在水相中的溶解度，從而提高多環(huán)芳烴的生物可利用性[29]。不同腐殖質在0.0～10.0 mg/L濃度范圍內對E2生物降解的促進作用排序如下： LHA＞HA＞LFA。這是由于它們各自的芳香結構不同，在其他多環(huán)芳烴降解研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結果[31]。而當腐殖質濃度的繼續(xù)增加時，E2的生物降解率迅速下降，這主要由兩方面導致：一方面，當更高濃度的腐殖質與MSM共存時，它們將與E2吸附結合形成包裹態(tài)物質，以抑制細胞和E2之間的直接接觸；另一方面，高濃度的腐殖質會破壞各種生物酶，從而導致E2的生物降解率降低[25]。因此，與低濃度的腐殖質相比，高濃度的腐殖質對E2的去除具有抑制作用。

圖8 腐殖質對生物降解率的影響Fig. 8 Effect of humic on the biodegradation efficiency

2.4.4 重金屬對E2生物降解的影響 微量元素是維持微生物生長發(fā)育所必需的，可刺激微生物活動。但當單一微量元素過量時，對微生物具有很高毒性。研究了72 h內不同重金屬對生物降解率的影響，見圖9。由于污水中重金屬含量相對自然水體較高，因此，實驗濃度采用了高于自然水體的濃度水平。結果表明，較低濃度的Zn2+和Cu2+對E2降解有促進作用。因為Zn2+和Cu2+是許多生物學過程和酶活性過程的重要輔因子，對大腸桿菌的生長活性和穩(wěn)定性至關重要[32]。但是，高濃度的Zn2+能顯著抑制E2的微生物降解。這是由于高濃度的Zn2+能抑制微生物的代謝過程，并形成與E2的競爭性生物吸附，從而導致E2的生物吸附率及降解率下降[33]。而且高濃度的Zn2+比Cu2+有更明顯的抑制作用，這與之前的研究有相似的趨勢[34]。相比之下，即使Pb2+和Cd2+的濃度很低也會強烈抑制E2的微生物降解。這是因為它們對水生動物、植物及微生物有較大的毒性，會抑制微生物的生長和酶的活性，從而降低E2的生物降解率[35-36]。不僅如此，除了抑制代謝外，Pb2+和Cd2+的同步生物吸附同樣會與E2形成競爭關系，使得E2的生物去除率降低[33]。

圖9 重金屬對生物降解率的影響Fig. 9 Effect of heavy mental on biodegradation efficiency

3 結論

1）大腸桿菌是洱海底泥中的E2降解優(yōu)勢菌種，E2的生物去除過程由生物吸附及生物降解兩部分組成。

2）生物吸附過程主要受pH值、生物量和E2濃度限制。其中吸附過程對pH值具有明顯的依賴性，與生物量和E2濃度則呈明顯正相關。弱堿性下（pH=8）吸附效率最為顯著，約是酸性和強堿性的2～5倍，可達0.28 mg/g。

3）當 葡 萄 糖、甲 酸 鈉、H2O2、腐 殖 質、Zn2+和Cu2+濃 度 分 別 為40.0 mg/L、10.0 mg/L、3.0 mmol/L、2.0～15.0 mg/L、0.5 mg/L及0.5 mg/L時，E2的生物降解率提高近12.41%～57.47%。而當濃度過高時即產(chǎn)生明顯抑制作用。另外，Pb2+或Cd2+在低濃度就會產(chǎn)生強烈抑制效果。