熱處理對駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸組成與含量的影響

明亮，那琴，吳曉云，吉日木圖*

1(內蒙古農(nóng)業(yè)大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，內蒙古 呼和浩特，010018) 2(內蒙古駱駝研究院，內蒙古 巴丹吉林，737300)

動物乳具有較高的營養(yǎng)價值，能提供大量對人體有益的物質，如蛋白質、鈣、維生素和礦物質等[1]。其中，乳蛋白質是動物乳中的主要營養(yǎng)成分，其氨基酸含量和構成比例基本同人體蛋白合成時所需要的數(shù)量、比例接近[2]。乳中氨基酸是構成乳蛋白大分子的基礎物質，能夠維持機體組織生長更新、參與多種化學反應、提供生理活動所需熱能，并具有抗癌、降低膽固醇、強化免疫、抑制脂肪沉積及抗糖尿病等功能[3]。評價食品中營養(yǎng)價值的一項重要指標就是食品中氨基酸含量與種類是否豐富與齊全。從動物乳產(chǎn)品的多樣化、安全性和貨架期等方面考慮，生產(chǎn)廠家會對原料乳進行不同程度的熱處理，使其符合相關的衛(wèi)生標準，同時保證產(chǎn)品質量穩(wěn)定。原料乳在不同的加熱過程中會發(fā)生一系列的理化反應，導致蛋白質和脂肪的解離，破壞了原有的結構，形成一些新的游離物質會造成體系不穩(wěn)定、營養(yǎng)成分流失等[4]。

牛乳是目前乳及乳制品最主要的來源，也是人類利用率最高的動物乳，占乳制品消費量的95%[5]。牛乳主要由水、蛋白質、脂肪、乳糖、礦物質等組成，是人們膳食結構的重要組成部分，也為人體提供必需營養(yǎng)物質。山羊乳的基本營養(yǎng)成分與牛乳類似[6]，其酪蛋白的組成更接近人乳，β-乳球蛋白的含量較低(相比牛乳低50%)，不易發(fā)生致敏反應[7]；此外，羊乳脂肪球顆粒直徑小，更容易被人體消化吸收[8]。被譽為“沙漠白金”的駝乳不含β-乳球蛋白，富含胰島素和類胰島素生長因子、不飽和脂肪酸等，具有極高的營養(yǎng)價值[9]；此外，駝乳含有乳鐵蛋白、免疫球蛋白、溶菌酶和維生素C等功效因子，具有一定的醫(yī)療保健作用[10-11]。熱處理是原料乳及其乳制品加工保存最主要的方法。近年，隨著人們對非牛乳營養(yǎng)、藥用保健價值的研究興趣逐漸增加，駝乳、羊乳及其乳制品的開發(fā)利用也迅速發(fā)展。然而，熱處理條件對駝乳、牛乳和山羊乳中營養(yǎng)成分的影響至今還未得到科學、系統(tǒng)地研究。

目前，HPLC[12]和氨基酸分析儀[13]是檢測食品中氨基酸的重要方法。HPLC與氨基酸分析儀法相比，具有檢測限與靈敏度高、衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定、重復性好、簡便可靠等優(yōu)點[14]。然而，動物乳氨基酸組成的研究主要采用氨基酸分析儀[15-17]，基于HPLC的駝乳、牛乳和山羊乳氨基酸組成的分析極為有限[18]；且常見乳源(駝乳、牛乳和山羊乳)氨基酸組成與熱處理條件的關系并不清楚。因此，本研究分別收集駝乳、牛乳和山羊乳樣本，采用HPLC法對不同熱處理條件下的3種乳進行氨基酸組成的檢測和比較分析，進而解析乳中氨基酸的組成與熱處理程度的關系，以期為不同熱處理條件下的乳中氨基酸的進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 乳樣的采集及處理

本研究所用到的駝乳、牛乳和山羊乳均采自內蒙古阿拉善左旗一牧場。采集后迅速用冰袋保存，運輸至實驗室。對駝乳、牛乳和山羊乳分別進行低溫長時巴氏殺菌[(low temperature long time，LTLT)65 ℃、30 min]、高溫短時殺菌[(high temperature short time，HTST)85 ℃、15 s]和超高溫瞬時滅菌[(ultra-high temperature instantaneous sterilization，UHT)135 ℃、5 s]處理；同時設一組未處理組(對3種畜乳不做任何處理)。分別將不同熱處理過的乳樣和未處理的樣本在-20 ℃冷凍保存，備用。

1.2 實驗材料

甲醇、乙腈(均為色譜純)，美國Fisher Scientific公司；Na2B4O7·10H2O、Na2HPO4·12H2O、磷酸(均為分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸(優(yōu)級純)，北京化工廠；移液器及吸液頭，德國Eppendorf公司；水解管，pyrex，產(chǎn)品貨號：60827-023 13 mm×100 mm；17種氨基酸混合標準品(純度≥99%)、氨基酸衍生化試劑盒，日本島津公司。

1.3 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜系統(tǒng)、Lab Solution色譜工作站、RF20A熒光檢測器，日本島津公司；DHG-9123A型鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；BS210S型電子天平，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；vortex zx3漩渦振蕩器，美國SI公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品處理

取3 mL的乳樣于水解管中，加入等體積的6 mol/L鹽酸，滴入新蒸餾的苯酚4滴，溶解；并充入高純N22～3 min，反復置換3次后，在充N2狀態(tài)下封口。將水解管置于(120±3) ℃的恒溫干燥箱中，水解22～24 h。取出水解管，冷卻至室溫，用去離子水多次沖洗水解管，將水解液全部轉移至容量瓶中，用1 mol/L的鹽酸定容。再用0.45 μm尼龍濾膜過濾，準確吸取濾液于瓶中，在40～50 ℃真空干燥器中干燥，干燥后的殘留物用去離子水溶解，再干燥，反復進行2次，最后蒸干。

1.4.2 流動相的配制

流動相A：Na2HPO4·12H2O 9.0 g， Na2B4O7·10H2O 9.5 g，加水2 000 mL，用36%鹽酸(約3 mL)調pH至8.2，用0.45 μm濾膜過濾。流動相B：甲醇450 mL，乙腈450 mL，水100 mL，混勻，超聲脫氣。

1.4.3 衍生用樣品溶液的配制

準確量取樣品溶液500 μL，置于2 mL樣品瓶中，準確加入內標溶液50 μL混勻，作為衍生用樣品溶液。取鄰苯二甲醛(phthalaldehyde reagent,OPA)衍生試劑A液1支，加入OPA衍生試劑B液60 μL混勻；作為OPA衍生試劑。

1.4.4 衍生用混合氨基酸標準溶液

準確量取氨基酸分析方法組件包中的氨基酸標準溶液100 μL，置于2 mL樣品瓶中，準確加入內標溶液50 μL、0.1 mol/L鹽酸400 μL，混勻，作為衍生用混合氨基酸標準溶液(表1)。

表1 氨基酸標準物質濃度Table 1 Concentration of amino acid standards

1.4.5 色譜條件

色譜柱：島津AJS-01氨基酸專用分析柱(C18，3 μm，4.6 mm×150 mm)；RF檢測器激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長450 nm，柱溫50 ℃。流動相A的梯度變化為：0～6 min(95%～90%)，6～8 min(90%)，8～10 min(90%～84%)，10～23 min(84%～60%)，23～30 min(60%～50%)，30～31 min(50%～0%)，31～34 min(0%)；流動相B的梯度變化為：0～6 min(5%～10%)，6～8 min(10%)，8～10 min(10%～16%)，10～23 min(16%～40%)，23～30 min(40%～50%)，30～31 min(50%～100%)，31～34min(100%)；進樣量2 μL；流速1.6 mL/min。為了檢測到檢測樣中的脯氨酸(Pro)，反應27 min后將檢測器激發(fā)波長和發(fā)射波長分別調整至266、305 nm。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標準差來表示。采用SPSS 24.0對氨基酸數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；并利用R語言、SPSS和SIMCA 14.1進行聚類和主成分分析(principal component analysis，PCA)。所有檢驗的統(tǒng)計學顯著性標準均為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸的色譜圖與聚類分析

通過HPLC的FR檢測器測定氨基酸標準液(圖1-a)。

a-氨基酸標準液；b-駝乳；c-牛乳；d-山羊乳圖1 氨基酸標準液、駝乳、牛乳和山羊乳的HPLC圖Fig.1 The HPLC chromatogram of amino acid standard solution, camel, cow and goat milk

圖1可以看出FR檢測器對于17種氨基酸均有很好的響應值，能夠有效分離。重復3組平行樣，其結果重現(xiàn)性好，說明FR檢測器對氨基酸種類的檢測具有良好的效果。在此基礎上，采用FR檢測器對未處理過的駝乳、牛乳和山羊乳樣品進行氨基酸含量的檢測，并采用內標法進行定量，如圖1所示，3種原乳中所有氨基酸均被檢出，各色譜峰峰形尖銳，且無雜峰干擾，分離度良好。

未處理組的駝乳、牛乳和山羊乳氨基酸色譜圖，結合氨基酸標準品對3種畜乳中17種氨基酸含量進行分析，并借助聚類熱圖完成了可視化展示(圖2)。3種乳均獲得了17種氨基酸，且不同乳中的氨基酸含量差異較大。所有的檢測乳樣中Glu的聚類顏色最深(紅色)，說明含量最高；其次是Leu和Pro；而Glu的聚類藍顏色最深，說明在3種乳中其含量最低。從整體聚類特性來看，3種乳均按照重復次數(shù)聚為1簇；且駝乳和山羊乳先聚在一起，然后再與牛乳聚類；說明相比牛乳，駝乳和山羊乳中的氨基酸含量更接近。

CM-駝乳；NR-牛乳；YR-山羊乳圖2 駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸組成聚類圖Fig.2 Cluster analysis of amino acid composition in camel, cow and goat milk注：1、2和3分別為試驗的3次重復

2.2 駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸含量比較分析

乳中氨基酸含量及組成是評價蛋白質營養(yǎng)價值高低的主要因素，會直接影響到乳中蛋白質營養(yǎng)價值[15]。由表2可知，駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸組成和相對含量差異顯著。3種原乳中，總氨基酸(total amino acid，TAA)的含量具有顯著差異(P<0.05)；其中駝乳中TAA含量最高，為46.47 mg/g，牛乳最低，為30.37 mg/g。必需氨基酸(essential amino acid，EAA)的含量也存在顯著差異(P<0.05)；駝乳中的含量最高，其次是山羊乳，而牛乳中EAA的含量最低。3種原乳中含量最高的EAA為Leu。Leu可促進機體內肌肉蛋白質的合成，原料乳中較高含量的Leu，可提高機體肌肉蛋白質的代謝[19]。此外，研究表明Leu具有降低血糖的作用；相比牛乳和山羊乳，駝乳中Leu的含量分別高出1.5倍和0.8倍，這也許是駝乳具有降糖作用的另一證據(jù)。3種畜乳的EAA含量占據(jù)第2位的為Lys，尤其在駝乳中，其含量達到了3.40 mg/g，顯著高于牛乳和山羊乳(P<0.05)。Lys作為人體第一限制氨基酸，在調節(jié)人體新陳代謝、增強抗病力等方面起著重要作用[20]。因此，推測駝乳具有的醫(yī)療保健作用，可能與乳中較高含量的Lys有關。此外，駝乳中的非必需氨基酸(non essential amino acid，NEAA)總量顯著高于牛乳和羊乳(P<0.05)，其中除了Gly和Ala的含量顯著低于山羊乳(P<0.05)，其余NEAA的含量均高于山羊乳。而駝乳中所有的NEAA含量均高于牛乳。

表2 駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸含量比較 單位：mg/g

采用SIMCA軟件對未處理的駝乳、牛乳和山羊乳中17中氨基酸進行了PCA。由圖3可見，主成分1和主成分2很好區(qū)分3種畜乳，且同一種乳的3次重復明顯的聚在一起，表明不同畜乳中氨基酸含量存在一定差異性。PCA的結果再次證實了表3的結果，且與楊惠茹等[16]的研究結果一致。

圖3 駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸含量的PCAFig.3 PCA of amino acid of camel, cow and goat milk

2.3 熱處理對駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸組成的影響

2.3.1 熱處理對駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸組成的比較分析

目前，原料乳不同程度的熱處理殺菌是保證產(chǎn)品質量、延長產(chǎn)品保質期最主要的方式。不同熱處理方式對原料乳營養(yǎng)價值有不同程度的影響，對其氨基酸含量也有不同程度的影響。在不同熱處理(LTLT、HTST和UHT)條件下，駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸組成變化見表3。與未處理組相比，加熱處理會增加3種畜乳中TAA和EAA的含量(表2和表3)；眾所周知，原料乳中存在多種酶類物質，在加熱過程中耐熱酶會使乳中蛋白質酶解，導致TAA的含量增加。此外，相比未處理組鑒定到的7種EAA，Thr、Ile、Phe和Leu氨基酸含量在3種熱處理條件下都有所增加，而其余氨基酸(除Asp外)含量在加熱處理過程中呈現(xiàn)了增加或減少的無規(guī)則變化(表2和表3)。研究表明，原料乳在加熱過程中，蛋白質會酶解或氨基酸之間的化學鍵會斷裂，使得氨基酸自身會發(fā)生裂解，或與乳中的糖類物質發(fā)生美拉德反應，導致游離氨基酸含量增加或減少[21-22]。

從表3可知，3種乳經(jīng)過LTLT熱處理后TAA和EAA的含量均有上升趨勢，而相比LTLT熱處理，HTST和UHT熱處理對3種乳的影響各不相同。駝乳和山羊乳經(jīng)過HTST和UHT熱處理后，乳中TAA和EAA的含量顯著降低(P<0.05)，而3種熱處理條件對牛乳中TAA和EAA含量的影響差異不顯著(P>0.05)。

表3 不同熱處理駝乳、牛乳和山羊乳的氨基酸組成 單位：mg/g

3種乳在不同熱處理條件下，其EAA的種類變化也各異。與LTLT處理相比，HTST和UHT處理駝乳中Val、Phe、Lys和Leu的含量均顯著降低(P<0.05)，而HTST和UHT2個處理組之間無顯著差異(P>0.05)。在3種熱處理條件下，駝乳中Met和Ile的含量都發(fā)生了顯著的變化(P<0.05)。與LTLT處理相比，HTST和UHT處理后牛乳中7種EAA的含量均無顯著變化(P>0.05)。此外，熱處理對山羊乳中Met和Leu的含量影響最大；與LTLT相比，HTST和UHT加熱處理會顯著降低山羊乳中Met的含量，而Leu的含量隨著溫度的升高，呈先降低后上升的趨勢(P<0.05)。此外，與原料乳相比，熱處理條件會增加3種畜乳中的鮮味氨基酸的含量，如Glu和Asp。因此，推測鮮味氨基酸含量的增加，是提高原料乳中乳香味、使其具有獨特風味的主要原因。

2.3.2 熱處理對駝乳、牛乳和山羊乳氨基酸相對含量分析

由圖4可知，駝乳、牛乳和山羊乳中EAA/TAA均達到了40%以上，分別是41.16%、40.07%和40.46%；且EAA/NEAA也均達到了65%以上，分別是69.97%、66.83%和67.93%，均符合并高于FAO/WHO理想蛋白相應指標(40%和60%)的標準[23]。3種乳在不同熱處理條件下，由于氨基酸含量的改變，EAA/TAA和EAA/NEAA發(fā)生了不同程度的改變。駝乳在3種不同熱處理條件下，乳中EAA/TAA>40%，且EAA/NEAA也處于較高值，其中LTLT和UHT處理條件下EAA/NEAA均達到了70%以上。對于牛乳來說，加熱處理對其EAA的含量影響較大，因此LTLT和HTST處理條件下EAA/TAA的含量均<40%；而3種熱處理條件下，牛乳EAA/NEAA均大于65%。羊乳在3種熱處理條件下EAA/TAA和EAA/NEAA均高于40%和65%，且UHT處理條件下EAA/NEAA達到了70%以上。

圖4 不同熱處理條件下3種乳中Met+Cys、Phe+Tyr、EAA/NEAA和EAA/TAA相對含量分析Fig.4 Content of Met+Cys, Phe+Tyr, EAA/NEAA and EAA/TAA in camel, cow and goat milk under different heated treatment

Met和Cys是乳中含硫的EAA，含硫氨基酸是在熱處理過程中對食品風味影響較大的一類氨基酸。其在加熱過程中分解產(chǎn)生乙醛、半胱胺等物質，是乳香味的重要組成部分。相比未處理組，LTLT和HTST熱處理條件下，3種乳中Met+Cys的含量升高，而在UHT熱處理條件下，其含量有所降低，說明LTLT和HTST處理使乳中的乳香味得到進一步改善。

2.4 熱處理對駝乳、牛乳和山羊乳氨基酸組成的PCA的影響

為了進一步分析加熱處理對3種畜乳中氨基酸組成的影響，采用SPSS軟件對3種熱處理條件下的駝乳、牛乳和山羊乳中17種氨基酸進行PCA。如表4所示，從17種氨基酸組分中提取出2個主成分(特征值>1)，主成分1的特征值為14.60，特征貢獻率為85.87%，主要影響因子為Asp、Ser和His(表5)；主成分2的特征值為1.34，特征貢獻率為7.90%，主要影響因子為Gly和Ala；主成分1和主成分2的累計貢獻率為93.77%。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

表5 PC系數(shù)向量值Table 5 Vectors of principle components

3種熱處理條件下的駝乳、牛乳和山羊乳中17種氨基酸組成的PCA圖如圖5所示，3種熱處理條件下的駝乳的云圖分布于同一相區(qū)，共同聚類于三維圖右方，且與牛乳和山羊乳的距離較遠，再次驗證了圖3的結果，表明未處理組或即使經(jīng)過了加熱處理，3種乳中氨基酸的含量存在一定的差異。LTLT和UHT熱處理條件下的駝乳氨基酸，從空間上聚類的更近一些，說明LTLT和UHT處理對駝乳氨基酸含量的影響更相似。對于牛乳和山羊乳，LTLT和HTST處理條件下的聚類更近一些，而UHT處理產(chǎn)生了較大的聚類距離；說明UHT加熱處理對牛乳和山羊乳中的氨基酸組成影響較大。以上結果表明不同熱處理方式對3種畜乳的氨基酸組成有明顯的影響。利用17種氨基酸組成繪制PCA圖，可很好地區(qū)分不同熱處理樣品。

圖5 不同處理條件下駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸組成的PCA圖Fig.5 Principal component analysis plot of amino acid composition in camel, cow and goat milk under different heated treatment

3 結論

本研究基于HPLC技術，對駝乳、牛乳和山羊乳在3種不同熱處理條件下(LTLT，65 ℃、30 min；HTST，85 ℃、15 s；UHT，135 ℃、5 s)的氨基酸組成進行了比較分析。HPLC的FR檢測器對乳中17種氨基酸均有很好的響應值，且各色譜峰峰形尖銳、無雜峰干擾。對3種乳中的氨基酸組成進行分析發(fā)現(xiàn)，未處理和加熱處理的駝乳、牛乳、山羊乳中氨基酸組成和相對含量差異顯著，且UHT加熱處理的牛乳和山羊乳中氨基酸的組成差異較大；而相比牛乳和山羊乳，加熱處理對駝乳中氨基酸的影響較低。同時，加熱處理會不同程度的增加3種乳中Glu、Asp、Met和Cys的含量，說明加熱處理使乳中的乳香味得到進一步改善。因此，生產(chǎn)廠家通過加熱處理，不僅殺滅乳中微生物、增加其保質期，而且還可提高產(chǎn)品的風味，增加消費者的購買欲。由此可見，不同的熱處理方式對駝乳、牛乳和山羊乳中氨基酸的組成和含量產(chǎn)生不同的影響。本研究為生產(chǎn)加工不同熱處理品質的駝乳、牛乳和山羊乳產(chǎn)品提供依據(jù)。