三葉木通提取物對(duì)糖尿病小鼠模型炎癥反應(yīng)和糖脂代謝的影響

楊金博，趙晨光，張林鈴，卞國(guó)勇，包春玲，包斌,3,4*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，上海，201306) 3(上海水產(chǎn)品加工與貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)4(上海海洋大學(xué) 海洋科學(xué)研究院，上海，201306)

糖尿病通常被分為4種類型，Ⅰ型和Ⅱ型最為常見，其中Ⅱ型糖尿病患病人數(shù)最多[1]。盡管Ⅱ型糖尿病發(fā)病原因不明確，但是，其與遺傳[2]、年齡[3]、代謝[4]、肥胖[5]、生活方式[6]、機(jī)體免疫力[7]、心情狀態(tài)[8]等因素密切相關(guān)。最新研究發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥反應(yīng)和代謝紊亂會(huì)造成機(jī)體免疫能力下降，導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病以及相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生[9]，暗示著改善炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)代謝紊亂，可能是逆轉(zhuǎn)Ⅱ型糖尿病的有效途徑。

三葉木通[Akebiatrifoliata(Thunb.) Koidz.]是藥食同源植物，廣泛分布于安徽、福建等地，是《本草綱目》和《中國(guó)藥典》的記載品種[10]，具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)腸道微生物菌群等作用[11-12]。三葉木通藤莖和果皮的天然產(chǎn)物不同，藤莖具有58種有效化學(xué)成分，果皮具有高級(jí)脂肪酸、酚酸、黃酮、常春藤皂苷和其他生物活性糖苷等43種化學(xué)成分。藤莖的常春藤皂苷具有抗腫瘤活性[13-14]，果肉萃取物具有顯著的體外抗氧化作用和抑制α葡萄糖苷酶活性，其ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力接近商業(yè)抗氧化劑[15]。本研究以三葉木通藤莖為原料，制備三葉木通乙酸乙酯提取物，研究其與模型動(dòng)物炎癥反應(yīng)和糖尿病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6種小鼠60只，SPF級(jí)，健康雄性，鼠齡4～5周，體重(18±4) g，購(gòu)于GemPharmatech公司[生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2018-0008]，飼養(yǎng)在上海海洋大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，保持環(huán)境溫度(23±2) ℃，相對(duì)濕度45%～65%，自然晝夜。本研究經(jīng)上海海洋大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號(hào)：SHOU-DW-2020-054)并嚴(yán)格按照動(dòng)物使用管理?xiàng)l例進(jìn)行。

1.2 材料與試劑

三葉木通乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract，EAE)，自制；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ),美國(guó)Sigma公司；鹽酸二甲雙胍，上海源葉生物科技有限公司；高脂高糖飼料、基礎(chǔ)飼料，江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor, TNF-α)、白介素6(interleukin-6, IL-6)試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器

免調(diào)碼型血糖儀，三諾生物傳感股份有限公司；Spectra MAX M2 型酶標(biāo)儀，美谷分子儀器有限公司；iChem-340 型全自動(dòng)生化分析儀，深圳市庫(kù)貝爾生物科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 EAE的制備

三葉木通藤莖由溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院贈(zèng)送，經(jīng)上海海洋大學(xué)何培民教授鑒定。將三葉木通藤莖清洗、干燥、粉碎后得到藤莖粉末，粉末用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇提取3 h，此過程重復(fù)6次，提取后抽濾，合并所有濾液，濾液經(jīng)真空濃縮得到浸膏，按體積比1∶1溶解在去離子水中，經(jīng)乙酸乙酯萃取，重復(fù)3次后收集上清液，通過真空干燥得到乙酸乙酯提取物。

1.4.2 小鼠糖尿病模型的構(gòu)建

高脂高糖飼養(yǎng)聯(lián)合STZ注射，建立糖尿病動(dòng)物模型。高脂高糖飼料喂養(yǎng)致小鼠發(fā)生代謝紊亂，胰島素敏感度降低導(dǎo)致出現(xiàn)胰島素抵抗，STZ對(duì)動(dòng)物胰島β細(xì)胞有破壞作用[16]。保持環(huán)境溫度(23±2) ℃，相對(duì)濕度45%～65%，進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分籠出10只小鼠，投喂基礎(chǔ)飼料，其余小鼠投喂高脂高糖飼料。觀察所有小鼠精神狀態(tài)，每周在固定時(shí)間對(duì)所有小鼠進(jìn)行體重稱量。飼養(yǎng)4周后，體重達(dá)標(biāo)小鼠禁食12 h后進(jìn)行STZ注射操作。取STZ粉末溶于濃度為0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中，并在避光條件下進(jìn)行濾膜除菌。一次性腹腔注射STZ，劑量為120 mg/kg，基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)小鼠相同位置注射生理鹽水。觀察3周，根據(jù)體重、血糖指標(biāo)和觀察結(jié)果進(jìn)行判定，選取出現(xiàn)精神萎靡癥狀且空腹血糖值(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)>11.1 mmol/L的小鼠作為糖尿病小鼠模型。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

將糖尿病小鼠模型隨機(jī)分為5組，即空白組(DC)、陽(yáng)性對(duì)照組(PC)和三葉木通乙酸乙酯提取物高(EAE-H)、中(EAE-M)、低劑量(EAE-L)處理組，每組8只小鼠。隨機(jī)從基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)小鼠中選取8只，作為對(duì)照組(NC)分籠飼養(yǎng)，投喂基礎(chǔ)飼料，每日灌胃生理鹽水。DC組投喂高脂高糖飼料，每日灌胃生理鹽水。PC組投喂高脂高糖飼料，每日灌胃250 mg/kg二甲雙胍生理鹽水溶液。EAE-H組、EAE-M組、EAE-L組投喂高脂高糖飼料，每日分別灌胃含500、250、100 mg/kg EAE的生理鹽水溶液，所有小鼠保持飲水自由。

1.4.3.1 血清采集

EAE處理3周后，用酒精棉棒擦拭小鼠眼周，擦拭后立即摘除小鼠眼球取血，檸檬酸鈉抗凝后室溫靜置30 min，靜置后3 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清液并分裝、標(biāo)記，-80 ℃凍存。

1.4.3.2 炎癥指標(biāo)測(cè)定

將凍存血清解凍后，稀釋100倍，根據(jù)試劑盒依次加入樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素抗原、親和素、顯色液和終止液，10 min內(nèi)測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處的吸光度(OD值)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算小鼠血清內(nèi)炎癥因子水平。

1.4.3.3 小鼠肝臟蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)

眼球取血后立即準(zhǔn)確摘取小鼠肝臟，經(jīng)福爾馬林溶液固定后修剪、脫水、包埋、制切片，切片經(jīng)HE染色后進(jìn)行中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.3.4 生化指標(biāo)測(cè)定方法

將凍存血清解凍后，將樣本用渦旋儀渦旋15 s，根據(jù)GPO-PAP法測(cè)定小鼠血清中甘油三酯(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)含量，雙試劑直接法測(cè)定小鼠血清中高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)含量，用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定，上機(jī)檢測(cè)后讀取原始數(shù)據(jù)。

1.4.3.5 FBG和口服葡萄糖糖耐量(oral glucose tolerance test, OGTT)指標(biāo)測(cè)定

小鼠腹腔注射滅菌STZ后，每周固定時(shí)間禁食12 h，飲水自由，尾靜脈取血，血糖儀測(cè)定小鼠血糖水平，記錄結(jié)果。EAE處理3周，小鼠在同一時(shí)間禁食12 h，灌胃葡萄糖溶液，劑量為2 g/kg。尾靜脈取血，在0、30、60、120 min時(shí)測(cè)定小鼠血糖水平。

1.4.3.6 一般藥理與體重測(cè)定

每日定時(shí)觀察小鼠皮毛狀態(tài)、外形變化、進(jìn)食、飲水、排尿、呼吸、自主活動(dòng)、呼吸、心率等情況，每周稱量記錄小鼠體重。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與分析

用GraphPad 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Tukey多重檢驗(yàn)法來分析組間差異，P<0.05時(shí)代表差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖尿病小鼠模型的特征

高脂高糖飼養(yǎng)結(jié)合STZ注射，處理小鼠3周，構(gòu)建糖尿病小鼠模型，糖尿病小鼠模型特征(表1)顯示，模型組血糖16.9 mmol/L，對(duì)照組血糖6.0 mmol/L，2組血糖水平差異顯著(P<0.05),說明糖尿病小鼠模型構(gòu)建成功。模型組小鼠精神狀況萎靡不振，皮毛粗糙毛躁，失去光澤，進(jìn)食量增加，排尿增多，體重減少。

表1 小鼠糖尿病模型的特征指標(biāo)表Table 1 Characteristic index of diabetic mice model

2.2 EAE減輕糖尿病小鼠模型的炎癥反應(yīng)

EAE處理前后小鼠血清的TNF-α水平和IL-6水平如圖1。與NC組相比，DC組小鼠血清中TNF-α從170.46 pg/mg升高至265.96 pg/mg，極顯著升高56%(P<0.01)；IL-6從104.25 pg/mg升高至179.70 pg/mg，極顯著升高72%(P<0.01)，說明與NC組相比，DC組出現(xiàn)炎性特征。

a-TNF-α；b-IL-6圖1 EAE對(duì)糖尿病小鼠模型炎癥反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of EAE on inflammatory response in diabetic mice model注：*表示DC與處理組的統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05；**表示DC與處理組各組的統(tǒng)計(jì)分析，P<0.01；##表示DC組與NC組的統(tǒng)計(jì)分析，P<0.001(下同)

與DC組相比，PC組、高、中、低劑量處理組的TNF-α從265.96 pg/mg分別降低至198.46、217.17、225.52、239.20 pg/mg，極顯著降低25%(P<0.01)、18%(P<0.01)、15%(P<0.01) ，顯著降低10%(P<0.05)；PC組、高、中劑量處理組的IL-6從179.70 pg/mg分別降低至133.08、142.08、151.14 pg/mg，極顯著降低26%(P<0.01)、21%(P<0.01)、16%(P<0.01),低劑量處理組降低11%，但與DC組無顯著差異。

EAE處理前后小鼠肝臟HE染色結(jié)果顯示(圖2)，NC組中小鼠肝小葉、肝竇清楚可見，未出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況，纖維組織未出現(xiàn)增生。與NC組相比，DC組小鼠肝臟肝小葉輪廓界限模糊，肝細(xì)胞發(fā)生明顯的脂肪變性，肝細(xì)胞胞質(zhì)被大脂肪滴擠壓。說明與NC組相比，DC組小鼠肝臟出現(xiàn)炎癥損傷，DC組小鼠體內(nèi)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，符合預(yù)期。

與DC組相比，PC組、高、中、低劑量處理組的小鼠肝臟肝細(xì)胞脂肪變性發(fā)生不同程度緩解，高劑量處理組的緩解效果好于低劑量處理組，說明EAE能夠有效緩解糖尿病小鼠模型肝臟的炎癥損傷。

a-NC；b-DC；c-PC；d-EAE-H；e-EAE-M；f-EAE-L圖2 EAE對(duì)糖尿病小鼠模型肝臟炎癥反應(yīng)的影響(400倍)Fig.2 Effect of EAE on liver inflammation in diabetic mice model (400 ×)

2.3 EAE對(duì)糖尿病小鼠模型血脂代謝的影響

取適量樣本，通過全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定小鼠血清中血脂代謝指標(biāo)(表2)。表2顯示，與NC組相比，DC組小鼠血清中TC水平從2.58 mmol/L升高至5.83 mmol/L，顯著升高126%(P<0.01)；TG水平從0.78 mmol/L升高至1.63 mmol/L，顯著升高108%(P<0.01)；LDL-C水平從0.83 mmol/L升高至1.90 mmol/L，顯著升高128%(P<0.01)；HDL-C水平從1.48 mmol/L降低至0.61 mmol/L，顯著降低58%(P<0.01)，說明與NC組相比，DC組小鼠機(jī)體內(nèi)發(fā)生血脂代謝紊亂。

表2 EAE對(duì)糖尿病小鼠模型血脂代謝的影響Table 2 Effect of EAE on blood lipid metabolism in diabetic mice model

與DC組相比，PC組、高、中、低劑量處理組TC水平從5.83 mmol/L分別降低至3.09、3.29、3.46、3.77 mmol/L，極顯著降低47%(P<0.01)、43%(P<0.01)、40%(P<0.01)，顯著降低35%(P<0.05)；LDL-C水平從1.90 mmol/L分別降低至1.28、1.34、1.42、1.55 mmol/L，顯著降低32%、29%、25%、18%(P<0.01、P<0.05，P<0.05，P<0.05)；PC組、高、中劑量處理組的TG水平從1.63 mmol/L分別降低至0.88、1.00、1.25 mmol/L，顯著降低46%、38%、23%(P<0.01，P<0.01，P<0.05)；HDL-C水平從0.61 mmol/L分別升高至1.27、1.16、1.08 mmol/L，顯著升高108%(P<0.05)、90%(P<0.05)、77%(P<0.05)，說明處理組血脂代謝紊亂有不同程度的改善。

2.4 EAE對(duì)糖尿病小鼠模型血糖的影響

如表3所示，STZ注射3周后，與NC組相比，DC組、PC組、高、中、低劑量處理組小鼠血糖從6.0 mmol/L顯著升高至16.9、17.3、17.5、17.6、17.8 mmol/L(P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01)，說明各模型組糖尿病小鼠模型形成。

表3 EAE對(duì)糖尿病小鼠模型空腹血糖的影響Table 3 Effect of EAE on fasting blood glucose in diabetic mice model

EAE處理6周后，與NC組相比，DC組小鼠血糖從6.5 mmol/L升高至24.0 mmol/L，顯著升高270%(P<0.01)。與DC組相比，PC組、高、中、低劑量處理組血糖從24.0 mmol/L分別降低至14.2、15.5、16.9、17.3 mmol/L，顯著降低40%、35%、29%、27%(P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01)，說明處理組血糖含量有不同程度的減少。

通過尾靜脈取血法測(cè)定0、30、60、120 min時(shí)小鼠空腹血糖水平，EAE處理前后小鼠OGTT水平和血糖線下面積(area under curve,AUC)顯示(圖3)，灌胃葡萄糖30 min內(nèi)，NC組小鼠血糖由6.53 mmol/L升高至13.47 mmol/L，顯著升高106%(P<0.01)，DC組小鼠血糖由24.05 mmol/L升高至28.67 mmol/L，顯著升高19%(P<0.01)，PC組、高、中、低劑量處理組血糖分別從17.26、19.90、21.47、22.55 mmol/L升高至25.55、26.63、25.73、27.12 mmol/L，極顯著升高48%(P<0.01)、33%(P<0.01)、19%(P<0.01)、20%(P<0.01)。第120 min時(shí)，NC組小鼠血糖下降至8.67 mmol/L，DC組小鼠血糖下降至25.83 mmol/L，PC組、高、中、低劑量處理組血糖分別降低至18.27、20.91、23.06、24.32 mmol/L。

a-OGTT；b-AUC圖3 EAE對(duì)糖尿病小鼠模型口服糖耐量和血糖曲線下面積的影響Fig.3 Effect of EAE on oral glucose tolerance and area under the glucose curve in diabetic mice models

與NC組相比，DC組AUC值從1 282.10 mmol/L顯著升高至3 113.81 mmol/L(P<0.01)。與DC組相比，PC組、高、中、低劑量處理組AUC值從3 113.81 mmol/L分別顯著降低至2 581.76、2 775.43、2 819.63、2 918.77 mmol/L(P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.05)，說明EAE可緩解餐后血糖含量升高。

2.5 EAE對(duì)糖尿病小鼠模型體重的影響

每周稱量記錄小鼠體重，EAE處理前后小鼠體重水平如圖4所示，經(jīng)過3周干預(yù)，與NC組相比，DC組小鼠體重從28.16 g降低至25.45 g，顯著降低9%(P<0.01)。第6 周時(shí)，與NC組相比，DC組小鼠體重從29.08 g降低至24.91 g，顯著降低14%(P<0.01)，說明Ⅱ型糖尿病導(dǎo)致DC組小鼠體重下降。

從第3周開始，與DC組相比，PC組、高、中、低劑量處理組體重從24.91 g分別升高至27.43、27.11、26.46、25.94 g，顯著升高10%、8%、6%、4%(P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01)。第3 周與第6 周相比，DC組小鼠體重從25.45 g降低至24.91 g，極顯著降低2%(P<0.01)，PC組、高、中、低劑量處理組體重分別從26.04、26.01、25.11、24.92 g顯著升高至27.43、27.11、26.46、25.94 g(P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01)，說明EAE可以緩解Ⅱ型糖尿病模型小鼠體重下降情況。

圖4 EAE對(duì)糖尿病小鼠模型體重的影響Fig.4 Effect of EAE on the body weight of diabetic mice models注：第1～3周為建立糖尿病小鼠模型，第4～6周為EAE處理

3 結(jié)論與討論

糖尿病通常會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)飲食量和排尿量增加，體重不正常降低等癥狀[17]。高脂高糖喂養(yǎng)結(jié)合STZ注射構(gòu)建糖尿病小鼠模型，EAE處理3周后，與NC組相比，DC組小鼠飲食量增加，排尿增多，體重下降，說明高脂高糖喂養(yǎng)結(jié)合STZ注射導(dǎo)致DC組小鼠出現(xiàn)糖尿病相關(guān)癥狀。

TNF-α和IL-6是由炎癥類細(xì)胞分泌的炎癥因子[18]，糖尿病患者機(jī)體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生慢性炎癥。EAE處理3周，與DC組相比，PC組、高、中劑量處理組的TNF-α、IL-6水平顯著降低(P<0.01)，低劑量處理組的TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，IL-6水平有所下降，但無顯著性差異，肝臟損傷有不同程度的緩解，結(jié)果顯示EAE能降低糖尿病小鼠模型血清的TNF-α、IL-6水平，減輕炎癥反應(yīng)，說明三葉木通所含成分具有抗炎作用，與前人研究結(jié)果一致[19]。

TC、TG、LDL-C、HDL-C含量異常說明機(jī)體出現(xiàn)血脂代謝紊亂情況[20-23]。與DC組相比，PC組、高、中、低劑量處理組經(jīng)相應(yīng)處理后，TC、LDL-C含量顯著減少(P<0.05)，PC組、高、中劑量處理組TG含量顯著減少(P<0.05)，HDL-C水平顯著升高(P<0.05)，結(jié)果表明EAE能降低模型組小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，緩解DC組小鼠體內(nèi)的代謝紊亂。

機(jī)體血糖水平是判定糖尿病指標(biāo)之一[24]。在高脂高糖飲食聯(lián)合STZ注射作用下，第3周時(shí)DC組、PC組、高、中、低劑量處理組小鼠血糖值均>11.1 mmol/L，與NC組相比均顯著升高(P<0.01)，說明糖尿病動(dòng)物模型構(gòu)建成功。EAE處理3周后，與DC組相比PC組、高、中、低劑量處理組血糖水平均顯著降低(P<0.05)，降低效果PC組>EAE-H組>EAE-M組>EAE-L組。

OGTT與AUC可以表明機(jī)體的糖負(fù)荷能力，AUC與機(jī)體胰島素敏感度呈負(fù)相關(guān)[25]。根據(jù)圖3，各糖尿病小鼠模型的血糖-時(shí)間曲線均在NC組之上，在30 min時(shí)達(dá)到最高值，在120 min時(shí)趨于平穩(wěn)。DC組AUC顯著高于NC組(P<0.01)，說明糖尿病小鼠模型體內(nèi)的胰島素敏感度低于正常組。與DC組相比，PC組、高、中、低劑量處理組AUC顯著降低，說明EAE可以調(diào)節(jié)餐后血糖。

不明原因的體重降低是糖尿病患者最明顯的體征變化[26]，經(jīng)飲食和STZ注射聯(lián)合作用后，與NC組相比，模型組小鼠體重顯著降低(P<0.01)，EAE處理3周后，與DC組相比，PC組、高、中、低劑量處理組體重顯著升高(P<0.01)，說明EAE可以改善糖尿病小鼠模型體重減少的現(xiàn)象。EAE可減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，緩解肝臟炎癥損傷，調(diào)節(jié)血脂代謝，抑制糖尿病血糖升高，改善機(jī)體體重減少現(xiàn)象。

糖尿病患者往往伴隨著機(jī)體免疫力的下降。減輕炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂可提升抗氧化能力，而抗氧化能力與機(jī)體的免疫力有關(guān)[27]。EAE可降低TNF-α、IL-6水平，提升抗氧化能力，進(jìn)而幫助機(jī)體有效調(diào)節(jié)血脂代謝途徑，改善紊亂，最終表現(xiàn)為血糖值下降，體重下降速度減緩。