毛韌革菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)表征、抗氧化活性研究及發(fā)酵條件優(yōu)化

李興愷，張耀根，姚皓昱，丁一飛，王詩雨，王燕玲，孫濤，雷鵬，徐虹，王瑞

(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京，211816)

毛韌革菌(Stereumhirsutum)，屬擔子菌綱、多孔菌目、革菌科、韌革菌屬。通常情況下，作為宿主菌株，被一些大型食用真菌寄生后形成相應(yīng)的子實體，特別是在金耳[Naemateliaaurantialba(Bandoni & M.Zang) Millanes & Wedin]的菌絲發(fā)育和出菇過程中發(fā)揮著重要的作用[1-2]。毛韌革菌伴隨在金耳的整個發(fā)育周期，金耳出菇后，其本質(zhì)上仍然是與毛韌革菌組成的異質(zhì)復(fù)合體。金耳作為一種傳統(tǒng)食用真菌，其安全性已經(jīng)得到了廣泛的認可，因此與其共生的毛韌革菌在理論上也具有食用安全性。

金耳子實體，作為一種金耳與毛韌革菌的異質(zhì)復(fù)合體，具有藥食同源的特性，多糖是其主要活性成分。國內(nèi)已針對金耳多糖開展了大量研究，發(fā)現(xiàn)其具有降血糖[3-4]、抗氧化[5]、降血脂[6]、抗腫瘤抗病毒[7]等生物活性。而有關(guān)毛韌革菌是否也產(chǎn)生具有類似生物活性的多糖則鮮有報道。因此，本研究從新鮮金耳子實體內(nèi)分離到1株毛韌革菌(Stereumhirsutum) NX-22，通過液體深層發(fā)酵研究其是否合成胞外多糖，并對其分泌胞外多糖進行發(fā)酵優(yōu)化。同時本研究還對毛韌革菌胞外多糖的單糖組成進行初步分析并評價其活性。

1 材料與方法

1.1 菌株

StereumhirsutumNX-22，本實驗室保藏，保藏培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯葡萄糖肉湯(potato dextrose broth,PDB)培養(yǎng)基初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0，玉米粉10.0，KH2PO41.0，MgSO40.4，胰蛋白胨1.0[8]。

1.3 菌株培養(yǎng)及發(fā)酵條件優(yōu)化

用接種勺從PDA固態(tài)培養(yǎng)基上挖取3～4塊米粒大小的菌絲體轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，于25 ℃培養(yǎng)3 d，在無菌環(huán)境下將長好的種子液用80目細胞篩過濾后，按照體積分數(shù)10%的接種量轉(zhuǎn)接至初始發(fā)酵培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)5～6 d。

培養(yǎng)條件優(yōu)化：發(fā)酵過程每24 h取樣，繪制發(fā)酵過程多糖產(chǎn)量及菌絲生物量隨時間變化曲線，連續(xù)取樣7 d，確認最佳發(fā)酵時間；分別更改初始發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值(4、5、6、7、8)和溫度(22、25、28、30、32、35 ℃)，確認最優(yōu)發(fā)酵pH及溫度。

培養(yǎng)基優(yōu)化：在初始培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，將碳源葡萄糖、玉米粉更換為20 g/L的阿拉伯糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、玉米粉，研究不同碳源對產(chǎn)糖和菌絲生長的影響，并對最優(yōu)碳源濃度進一步優(yōu)化；在獲得最優(yōu)碳源的基礎(chǔ)上，將氮源胰蛋白胨替換為1.0 g/L的NH4Cl、魚粉蛋白胨、(NH4)2SO4、尿素、豆粕粉、酵母粉，研究不同氮源對產(chǎn)糖和菌絲生長的影響，并對最優(yōu)氮源濃度進一步優(yōu)化；在獲得最優(yōu)碳氮源的基礎(chǔ)上，對培養(yǎng)基中的鹽離子濃度(K+，Mg2+)進行優(yōu)化，并確認最佳培養(yǎng)基成分。

1.4 毛韌革菌多糖的提取及純化

發(fā)酵液于8 000×g離心10 min，取上清液加入3 g/L的活性炭攪拌1 h進行脫色，隨后濃縮至其體積的20%。將濃縮后上清液加入3倍體積的無水乙醇，靜置12 h。分別用體積分數(shù)為75%和50%的乙醇洗滌沉淀后，加入不多于其旋蒸后體積的蒸餾水復(fù)溶，醇沉，以此重復(fù)3次，凍干，即得毛韌革菌胞外多糖(Stereumhirsutumpolysaccharide，SHPS)。

1.5 毛韌革菌多糖結(jié)構(gòu)表征

分子質(zhì)量測定：使用HPLC法[9]進行測定。分析柱為2根串聯(lián)的凝膠滲透色譜(gel permeation chromatograph, GPC)柱(OHpak SB-806M HQ，8.0 mm×300 mm，日本Shodex)。流動相為2 mmol/L乙酸銨(pH 4.0)，流速1.0 mL/min。檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD-16)，漂移管溫度60 ℃，通氣量3.0 L/min。根據(jù)不同分子質(zhì)量的葡聚糖標準品(Sigma公司，分子質(zhì)量分別為670 000、270 000、150 000、80 000、50 000、25 000、12 000、5 000 Da)建立的標準線性方程計算SHPS的分子質(zhì)量。

結(jié)構(gòu)表征：分別用傅里葉變換紅外光譜儀、紫外光譜儀、掃描電鏡對多糖的光譜結(jié)構(gòu)和形態(tài)結(jié)構(gòu)進行表征。

單糖組分分析：準確稱取3 mg SHPS，2 mL 2 mol/L三氟乙酸在100 ℃的沸水浴中水解4 h。反應(yīng)結(jié)束后，水解產(chǎn)物和各種單糖標準品用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, PMP)衍生化，然后利用HPLC分析。色譜柱為Sepax GP-C18柱(4.6 mm×250 mm)，流動相由PBS緩沖液(0.1 mol/L，pH 6.80)和乙腈按8∶2(體積比)混合配制，流速為1.0 mL/min，柱箱溫度35 ℃，檢測器為紫外檢測器，波長設(shè)置為250 nm。用標準單糖的保留時間測定單糖的組成，用響應(yīng)因子的峰面積計算單糖之間的比值。

1.6 毛韌革菌多糖抗氧化活性測定

參考ZHANG等[10]的方法分別研究毛韌革菌多糖對于超氧陰離子、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基、羥自由基(·OH)清除能力，并均以抗壞血酸作為陽性對照。

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(1)

式中：A0，空白對照吸光度；A1，樣品吸光度。

清除DPPH自由基的能力：在室溫下，將2 mL不同濃度的SHPS溶液和2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液均勻混合。反應(yīng)時間為30 min，在517 nm處測量吸光度。DPPH自由基清除能力按公式(2)計算：

(2)

式中：A0，空白對照吸光度；A1，樣品吸光度。

清除·OH的能力：反應(yīng)體系為3.0 mL，分別含有0.2 mmol/L EDTA-Fe螯合物、3.0 mmol/L H2O2和2.0 mmol/L水楊酸在37 ℃水浴中反應(yīng)15 min，然后在37 ℃水浴中加入0.8 mL不同濃度SHPS溶液反應(yīng)60 min。在510 nm處測量吸光度。·OH清除能力按公式(3)計算：

(3)

式中：A0，空白對照吸光度；A1，樣品吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛韌革菌多糖結(jié)構(gòu)表征

圖1 SHPS-GPC色譜圖Fig.1 SHPS-GPC chromatogram

SHPS經(jīng)掃描電鏡放大20 000倍后的形態(tài)如圖2-a所示，SHPS呈蜂窩網(wǎng)狀，表明多糖分子間存在相互作用并且緊密聚集。SHPS的紫外光譜表征如圖2-b所示，在260及280 nm附近的紫外吸收強度幾乎沒有變化，表明SHPS中的核酸及蛋白質(zhì)含量較低，符合多糖的紫外吸收特征，也證明純化效果較好。SHPS的紅外光譜表征結(jié)果如圖2-c所示，3 330.40 cm-1處的吸收峰是由多糖分子間或分子內(nèi)的O—H的伸縮振動引起的；2 931.30 cm-1處的吸收峰是糖類不對稱C—H的伸縮振動吸收峰；1 676.45 cm-1處的是羧基的C—O鍵的伸縮振動吸收峰，表明SHPS中有糖醛酸；1 198.75和1 126.78 cm-1處的吸收峰是由于C—O—C和C—O的伸縮振動；1 095.77 cm-1的吸收峰證明SHPS中有吡喃糖環(huán)存在；894.41 cm-1處的吸收峰則表明SHPS中具有β-糖苷鍵構(gòu)型，而在830 cm-1處無吸收峰，表明可能不存在α-糖苷鍵。

a-掃描電鏡圖;b-紅外光譜;c-紫外光譜圖2 SHPS的結(jié)構(gòu)表征Fig.2 Structural characterization of SHPS

2.2 毛韌革菌多糖的單糖組分分析

單糖組分分析結(jié)果如圖3所示，其單糖組成及物質(zhì)的量比為：M(甘露糖)∶M(葡萄糖醛酸)∶M(氨基半乳糖)∶M(半乳糖)∶M(木糖)=0.37∶21.43∶1.01∶76.93∶0.28。由結(jié)果可知，半乳糖的摩爾分數(shù)在SHPS占比高達76.93%，表明SHPS的骨架結(jié)構(gòu)為多聚半乳糖。此外，SHPS中葡萄糖醛酸的摩爾分數(shù)為21.43%，表明其為一種酸性多糖。

2.3 毛韌革菌多糖的抗氧化性評價

抗氧化活性被認為是多糖最重要的生物活性之一，大部分的天然多糖都具有或高或低的抗氧化能力[11]。本研究對SHPS抗氧化活性進行了初步評價。如圖4所示，在實驗所取的濃度范圍內(nèi)，SHPS對·O2-無明顯清除作用，但對DPPH自由基、·OH具有一定的的清除能力。SHPS的質(zhì)量濃度達到1.2 g/L時具有最好的抗氧化效果，DPPH自由基清除率達到38.42%，·OH的清除率達到53.72%。綜上，這意味著SHPS在抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、抗炎癥、抗糖尿病活性等方面具有潛在的應(yīng)用前景[11-13]。

2.4 毛韌革菌多糖的發(fā)酵制備優(yōu)化

2.4.1 最適發(fā)酵條件的確定

不同的菌株有其獨特的生長曲線，發(fā)酵時間過短會導(dǎo)致菌體的生長量還未達到最高，產(chǎn)糖效率低下；發(fā)酵時間過長，菌體則會由于代謝產(chǎn)物的累積，發(fā)生菌體衰亡。由圖5-a可知，最佳發(fā)酵時間為5 d時，多糖產(chǎn)量為1.196 g/L，菌絲體生物量為10.532 g/L。由圖5-b可知，毛韌革菌在25 ℃內(nèi)培養(yǎng)效果最好，多糖產(chǎn)量為1.235 g/L，菌絲體生物量為10.612 g/L。隨著溫度的升高，產(chǎn)量逐漸上升，但在25 ℃時達到最大值后隨著溫度升高產(chǎn)量逐漸下降。培養(yǎng)基初始pH對多糖產(chǎn)量的影響見圖5-c，毛韌革菌發(fā)酵培養(yǎng)基的最適初始pH=7，與實驗初設(shè)條件一致，此條件下多糖產(chǎn)量達到1.231 g/L，菌絲體生物量為10.527 g/L。

a-時間；b-溫度；c-初始pH圖5 培養(yǎng)條件對SHPS產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of fermentation conditions on SHPS production

2.4.2 最優(yōu)培養(yǎng)基的確定

2.4.2.1 碳源對多糖產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵過程中，一些可以直接被菌體利用的單糖或雙糖往往能夠節(jié)省菌體生長所需的能量，且有利于代謝產(chǎn)物的積累。另外，考慮到一些真菌在利用淀粉類碳源時也往往具有優(yōu)勢，因此，分別考察了阿拉伯糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、玉米粉等8種常用碳源對毛韌革菌生長及產(chǎn)糖的影響，結(jié)果如圖6所示。當碳源質(zhì)量濃度為20 g/L時，玉米粉最有利于SHPS的合成。進一步優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，玉米粉最優(yōu)添加質(zhì)量濃度為40 g/L，此時多糖產(chǎn)量達到4.472 g/L，菌絲體生物量為21.235 g/L。

通過NCBI數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，毛韌革菌基因組中存在著3個淀粉酶基因(Gene ID:18798273、18806366、18807072)，這意味著它能夠通過水解淀粉合成多糖。我們猜測其水解效果較好的原因不僅是玉米粉中含有大量的淀粉，還可能是它在溶液中能起到增加液體對菌體的剪切力，促使菌體生長以增加產(chǎn)量的作用[14-15]。楊靜靜[16]也發(fā)現(xiàn)玉米粉對靈芝菌絲體的形態(tài)、生物量等有影響。但在本研究中，盡管SHPS是一種聚半乳糖多糖，但半乳糖并非合成SHPS的最優(yōu)碳源，這意味著SHPS并非通過半乳糖直接聚合而成，而是通過胞內(nèi)復(fù)雜的糖苷轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)拼裝而成[17]。

a-碳源種類(1-阿拉伯糖，2-半乳糖，3-果糖，4-麥芽糖，5-蔗糖，6-甘露糖，7-葡萄糖，8-玉米粉)；b-玉米粉質(zhì)量濃度圖6 不同碳源對SHPS產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of different carbon sources on SHPS production

2.4.2.2 氮源對多糖產(chǎn)量的影響

盡管SHPS多糖中氮含量極低，但菌體的生長以及與多糖合成相關(guān)酶系的表達都需要氮的參與。因此本研究中，考察了4種有機氮源(胰蛋白胨、魚粉蛋白胨、豆粕粉、酵母粉)和3種無機氮源[NH4Cl、(NH4)2SO4、尿素]對菌體生長和多糖產(chǎn)量的影響。由圖7可知，酵母粉、魚粉蛋白胨、胰蛋白胨作為氮源產(chǎn)糖效果較好，這表明在合成SHPS時，有機氮源更為有利。當以3 g/L酵母粉作為氮源時，多糖產(chǎn)量達到最高5.681 g/L，菌絲體生物量為23.723 g/L，所以將其作為最佳氮源。酵母粉作為速效氮源，效果略優(yōu)于蛋白胨，可能是酵母粉中含有豐富的游離氨基酸、維生素、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，能更好地為菌絲體的生長及多糖的產(chǎn)量提供保證。有研究同樣表明酵母粉對靈芝菌絲體的生長以及胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量提高效果優(yōu)于其他氮源[18]。

a-氮源種類(1-胰蛋白胨，2-NH4Cl，3-魚粉蛋白胨，4-(NH4)2SO4，5-尿素，6-豆粕粉，7-酵母粉)；b-酵母粉質(zhì)量濃度圖7 不同氮源對SHPS產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on SHPS production

2.4.2.3 金屬離子對多糖產(chǎn)量的影響

金屬離子能夠維持生物大分子和細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定以及調(diào)節(jié)和維持細胞的滲透壓，能對微生物代謝具有重要影響。有報道表明金屬離子Mg2+和K+能顯著提高中國塊狀菌胞外多糖產(chǎn)量[19]；Ca+有利于蟲草多糖合成以及增加多糖合成酶的活性[20]。

不同金屬離子濃度對多糖產(chǎn)量的影響如圖8所示，各濃度均對多糖產(chǎn)量有積極影響，MgSO4、K2HPO4和KH2PO4的最適質(zhì)量濃度分別為0.6、1.0、1.5 g/L。由此可見，金屬離子在微生物的生長及代謝產(chǎn)物的合成中具有重要的調(diào)節(jié)作用，本實驗中金屬離子能夠提高多糖的產(chǎn)量，可能是由于金屬離子改變代謝途徑中的酶活力從而使得胞外代謝物的產(chǎn)量變化。根據(jù)此條件優(yōu)化后的多糖產(chǎn)量達到5.964 g/L，菌絲體生物量為24.634 g/L。

圖8 不同金屬離子及其濃度對SHPS產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of different metal ions and concentrations on SHPS production

3 結(jié)論