產(chǎn)2,3-丁二醇霍氏腸桿菌的篩選及其發(fā)酵優(yōu)化

王杰明，盧艷波，楊小雁，馬忠瑪，李國輝，鄧禹*

1(糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(山東省油脂油料精深加工技術(shù)重點實驗室 山東渤海實業(yè)集團有限公司，山東 濱州，256500)

作為重要的平臺化合物，2,3-丁二醇(2,3-butanediol，2,3-BD)的應(yīng)用遍及航空航天、食品、醫(yī)藥、化工和燃料等領(lǐng)域[1]。1906年HARDEN等[2]首次發(fā)現(xiàn)了2,3-BD在微生物中的積累，但隨后由于化石基燃料的大量應(yīng)用，生物法合成2,3-BD逐步被化學(xué)法所替代[3]。然而化學(xué)法存在工藝繁瑣、不易操作、原材料昂貴等諸多弊端，生物法以可再生資源為發(fā)酵原料，具有環(huán)境友好、低碳排放和綠色環(huán)保等優(yōu)點[4]。近年來，伴隨著石油資源緊缺、化石燃料價格上漲以及環(huán)境惡化等問題的不斷加劇，生物法合成2,3-BD重新受到廣泛關(guān)注[5]。

目前2,3-BD的生產(chǎn)菌株主要以克雷伯氏菌為主，生產(chǎn)菌株種類偏少，并且克雷伯氏菌是條件致病菌，嚴重限制了2,3-BD的開發(fā)利用[6]?；羰夏c桿菌具有可利用多種碳源、生長速度快等優(yōu)點，且在底物利用等特性上均與克雷伯氏菌類似，然而截至目前并未見相關(guān)報道[7]。本研究以篩選獲得的霍氏腸桿菌為宿主，通過發(fā)酵工藝優(yōu)化，以期得到高產(chǎn)2,3-BD的菌株，為后續(xù)相關(guān)研究奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

本研究所采用的菌株為霍氏腸桿菌，來源于土壤(江蘇，無錫)，被命名為WM11，16S rRNA序列已上傳至NCBI，編號為OL636379.1。

1.2 試劑和主要儀器

氨水，上海泰坦科技股份有限公司；非離子型T-F復(fù)合型發(fā)酵用消泡劑，上海生工生物工程有限公司；玉米芯水解糖液，易高環(huán)保投資集團。除上述外，本研究其它試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

UV-1800分光光度計，上海翱藝儀器有限公司；QWZY-C3組合式搖床，太倉市強文實驗設(shè)備有限公司；ZQZY-CT振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；GT80T高溫高壓滅菌鍋，致徽儀器有限公司；T&J-AType 5 L發(fā)酵罐，迪必爾生物工程有限公司；1260Ⅱ高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；TSQ-8000型E重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，賽默飛世爾(中國)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

平板及斜面保藏固體培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，瓊脂粉20，pH 7.0。

種子富集培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基

SOC培養(yǎng)基(g/L)：Na2HPO46.78，KH2PO43，NaCl 0.5，NH4Cl 1，MgSO42 mmol/L，CaCl20.1 mmol/L，pH自然；

SOB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨20，酵母膏5，MgCl2·6H2O 2.03，NaCl 0.5，KCl 0.186，pH自然；

TB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨12，酵母膏24，KH2PO42.31，K2HPO4·H2O 16.43，pH自然；

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，pH自然。

上述培養(yǎng)基均121 ℃滅菌20 min。

1.4 培養(yǎng)條件

搖瓶：裝液量50 mL，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速250 r/min。發(fā)酵需添加初始糖時，葡萄糖和玉米芯水解液均額外添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為2%(體積分數(shù)，下同)。

5 L發(fā)酵罐：裝液量2 L，溫度30 ℃，通氣量1 vvm，接種量為5%，發(fā)酵過程中用純氨水調(diào)節(jié)罐內(nèi)pH使其保持在7.0～7.2。消泡劑為非離子型T-F復(fù)合型發(fā)酵用消泡劑。

1.5 實驗方法

1.5.1 菌株篩選

初篩：將采集到的土壤樣品于種子富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，取不同稀釋度菌液涂布平板。大量挑取單菌落發(fā)酵培養(yǎng)，48 h后離心取上清液置于酶標板中進行乙偶姻顯色反應(yīng)。將顯紅色的陽性菌株保藏復(fù)篩備用。

復(fù)篩：從斜面上挑取菌株接種到富集培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期，按2%接種量接入含4 g/L葡萄糖的SOB發(fā)酵培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48 h。收集發(fā)酵液，離心取上清液用于HPLC檢測。

1.5.2 2,3-BD定性和定量

定性：將發(fā)酵上清液用乙酸乙酯萃取，再用Na2SO4吸干萃取液中剩余水分后抽濾、氮吹。干燥后加入硅烷化試劑再次氮吹，用正己烷復(fù)溶用于GC-MS鑒定。

定量：取發(fā)酵液12 500 r/min離心，上清液用0.22 μm的水系濾膜過濾用于HPLC檢測。

1.5.3 菌株鑒定

16S rRNA測序由天霖生物科技有限公司完成，結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中與已有序列進行比較分析，并使用MEGA7.0繪制進化樹。

1.5.4 搖瓶及補料分批發(fā)酵

搖瓶發(fā)酵：菌株平板劃線分離，挑取單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代2次，最后按2%接種量搖瓶發(fā)酵。

補料分批發(fā)酵：發(fā)酵罐空消后加入液體培養(yǎng)基，插入溶氧及pH電極，密封發(fā)酵罐，115 ℃滅菌30 min。使用火焰接種法接種上罐，打開攪拌待穩(wěn)定后開啟pH及消泡自控。

1.6 分析方法

乙偶姻在堿性含α-萘酚環(huán)境中能與胍基化合物快速反應(yīng)生成紅色物質(zhì)，將發(fā)酵上清液和顯色劑按體積比1∶2添加進行顯色測定[8]。細胞密度通過紫外可見分光光度計進行測定，波長為600 nm。發(fā)酵液各成分含量使用液相檢測，液相檢測條件：Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)柱，參考ZHAO等[9]的方法檢測。產(chǎn)物定性使用GC-MS檢測，GC-MS檢測條件：色譜柱SP-5，參考孫興云等[10]的方法檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選及產(chǎn)物鑒定

初篩以采集的樣品土壤為菌源，從其制備的平板中挑選出823個單菌落進行發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，收集樣品進行乙偶姻顯色反應(yīng)，得到78個備選菌株，部分顯色反應(yīng)結(jié)果如圖1-a所示。對其進行復(fù)篩，通過HPLC檢測，發(fā)現(xiàn)編號WM11菌株產(chǎn)量最高。2,3-BD積累量在48 h達到1.12 g/L(圖1-b)，該產(chǎn)量是丁昊等[11]篩選出的釀酒酵母2,3-BD積累量的5倍。

a-菌株顯色反應(yīng)；b-菌株2,3-BD產(chǎn)量及摩色轉(zhuǎn)化率圖1 產(chǎn)2,3-BD菌株的篩選Fig.1 Screening of 2,3-BD-producing strains

對其發(fā)酵上清液進行GC-MS測定，結(jié)果如圖2所示，發(fā)酵液樣品的出峰時間和特征離子(m/z73.1、m/z117.1、m/z147.1)與2,3-BD標樣皆相同[10]。由此可以斷定，WM11確實可以用于2,3-BD的生產(chǎn)。此外，在發(fā)酵液樣品中還檢測到乳酸、乙酸等副產(chǎn)物，這為后期的發(fā)酵優(yōu)化指明了方向。

a-發(fā)酵液氣相圖譜；b-發(fā)酵液質(zhì)譜圖；c-2,3-BD標樣氣相圖譜；d-2,3-BD標樣質(zhì)譜圖圖2 GC-MS結(jié)果Fig.2 Results of GC-MS

2.2 菌株的鑒定

在上述基礎(chǔ)上對菌株WM11進行鑒定，通過比對16S rRNA序列，發(fā)現(xiàn)研究菌株和霍氏腸桿菌(Enterobacterhormaechei)相似性達到了99.79%。通過MEGA7.0繪制了研究菌株的16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示，WM11菌株與E.hormaecheisubsp.xiangfangensisstrain OSUKPC4-L親緣關(guān)系更近，因此將其命名為E.hormaecheiWM11。

圖3 WM11菌株的16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rRNA sequences of WM11

2.3 搖瓶發(fā)酵實驗

獲得WM11菌株后，首先在搖瓶水平優(yōu)化了發(fā)酵產(chǎn)2,3-BD的最佳培養(yǎng)基。本實驗選取了SOB、SOC、TB和LB培養(yǎng)基進行研究，初始糖質(zhì)量濃度4 g/L，發(fā)酵結(jié)果如圖4所示。初始糖濃度相同的情況下，TB培養(yǎng)基中菌體的生長密度和產(chǎn)量遠遠高于其他培養(yǎng)基。菌體最高OD600為14.02，48 h時2,3-BD積累量最高為1.23 g/L，實際產(chǎn)率為0.3。TB培養(yǎng)基中2,3-BD積累量最高主要與其營養(yǎng)成分豐富有關(guān)，在4種培養(yǎng)基中，其含有的酵母粉、蛋白胨和K+含量均最高[12]。其中酵母粉和蛋白胨富含氨基酸和微量元素，能夠促進2,3-BD合成[13]，而K+具有維持細胞新陳代謝、調(diào)節(jié)滲透壓、保持酸堿平衡的作用，從而使菌體能大量積累2,3-BD[14]。綜合以上因素，后續(xù)的實驗均采用TB培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基。

a-生長曲線；b-2,3-BD濃度圖4 搖瓶發(fā)酵結(jié)果Fig.4 Results of shake flask fermentation

2.4 葡萄糖為碳源5L上罐發(fā)酵

2.4.1 分批發(fā)酵實驗

根據(jù)搖瓶發(fā)酵結(jié)果，以TB為發(fā)酵培養(yǎng)基分批上罐，發(fā)酵結(jié)果如圖5所示。菌體穩(wěn)定期OD600達到28，是搖瓶2倍，表明5 L罐條件更有利于菌體生長。發(fā)酵11 h時2,3-BD產(chǎn)量最高，但僅有0.8 g/L，分析原因是該發(fā)酵條件下碳源主要用于菌體生長或副產(chǎn)物的合成。乙酸作為主要的發(fā)酵副產(chǎn)物，在發(fā)酵前期迅速積累，最高達到9 g/L，后隨碳源缺乏逐漸降低。2,3-BD產(chǎn)量在乙酸積累量降低時逐漸升高，乙酸耗盡時達到最高。表明乙酸的合成利用了大量碳源，抑制了2,3-BD的合成，即使發(fā)酵后期菌體可利用乙酸，但產(chǎn)生的能量都被用于維持菌體生長，而不是2,3-BD的合成[15]。因此，提高碳源濃度和抑制乙酸合成是提高2,3-BD產(chǎn)量的主要策略。

a-產(chǎn)量和底物濃度；b-菌株的生長情況及發(fā)酵液溶氧圖5 分批上罐結(jié)果Fig.5 Results of batching on the tank

2.4.2 補料分批實驗

根據(jù)分批發(fā)酵結(jié)果，上罐為提高碳源的供給，采用補料分批的方式發(fā)酵。針對乙酸積累過快的問題，菌體生長階段選擇通過降低攪拌以降低菌體的比生長速率來控制乙酸的積累[16]。同時在菌體產(chǎn)2,3-BD期間通過加大葡萄糖的供給、增大攪拌轉(zhuǎn)速來加快2,3-BD的產(chǎn)出速率。最后為了彌補發(fā)酵中后期C/N失衡，選擇補加氮源來維持C/N的平衡，發(fā)酵結(jié)果如圖6所示。補料分批上罐最高OD600為33，2,3-BD在72 h的積累量達到了65.23 g/L，是分批上罐產(chǎn)量的81.5倍，糖醇轉(zhuǎn)化率達到了41%，并且發(fā)酵過程中副產(chǎn)物積累量始終保持在相對較低的水平。

a-產(chǎn)量和底物濃度；b-菌株生長情況及發(fā)酵液溶氧圖6 葡萄糖補料分批發(fā)酵結(jié)果Fig.6 Fermentation results of glucose supplement batch

2.5 玉米芯水解液為碳源5L上罐發(fā)酵

玉米芯水解液(corn cob hydrolysate，CCH)原料廉價易得，是一種綠色可持續(xù)的“負碳”原料。CHH由葡萄糖、木糖和乙酸等物質(zhì)組成，其中木糖是木質(zhì)纖維素的水解產(chǎn)物，乙酸是由半纖維素中的乙?；撍纬傻腫17-18]。如前文所述，乙酸滲透到細胞膜后可以減少細胞內(nèi)的質(zhì)子梯度，解除質(zhì)子動力的耦合，從而抑制ATP合成和細胞的生長，與SUO等[19]的研究結(jié)果一致。

結(jié)合上述情況，進行了CCH補料分批發(fā)酵。為了控制乙酸的積累，結(jié)合葡萄糖補料分批的發(fā)酵經(jīng)驗，采用兩階段補料策略進行發(fā)酵[20]。在8～24 h內(nèi)，首先用低濃度的CCH以22 mL/h的速度流加補料，然后用高濃度的葡萄糖以20 mL/h的速度流加。在8～24 h內(nèi)，糖主要用于細胞生長，因此補加低濃度的CCH，但在這之后，流加高濃度的CCH，主要用于生產(chǎn)2,3-BD。如圖7所示，在兩階段的補料策略下，2,3-BD的產(chǎn)量達到42.92 g/L，乙酸含量12.57 g/L，生產(chǎn)強度0.60 g/(L·h)。結(jié)果表明，在細胞生長階段降低糖的濃度(即CCH)足以支持細胞生長，并減少了最終的乙酸積累。最重要的是，兩階段補料策略可以將細胞生長和2,3-BD生產(chǎn)分為兩個階段，從而合理地補加不同階段所需碳源，這不僅能節(jié)約資源，而且也為其他木質(zhì)纖維素原料的規(guī)?；l(fā)酵利用提供了借鑒。

a-產(chǎn)量和底物濃度；b-菌株的生長情況及發(fā)酵液溶氧圖7 玉米芯水解液補料分批發(fā)酵結(jié)果Fig.7 Fermentation results of corn cob hydrolysate supplementation batch

3 結(jié)論

研究從自然環(huán)境中篩選獲得了一株生產(chǎn)2,3-BD的野生型霍氏腸桿菌。首先通過搖瓶優(yōu)化確認了最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基，其次在發(fā)酵罐中進行發(fā)酵條件優(yōu)化，菌株最終積累了65.23 g/L的2,3-BD。考慮到原料環(huán)保、2,3-BD的工業(yè)化和底物種類等因素，本研究又采用玉米芯水解液為碳源發(fā)酵生產(chǎn)2,3-BD，其產(chǎn)量在72 h達到42.92 g/L。本研究所使用的菌種是未經(jīng)過基因改造的野生型霍氏腸桿菌，該菌種自帶2,3-BD合成途徑。倘若后續(xù)對其進行基因改造，例如抑制2,3-丁二醇脫氫酶基因催化2,3-BD合成乙偶姻的反應(yīng)；敲除乙酸、乳酸等副產(chǎn)物的合成途徑；以及增強目標途徑中的α-乙酰乳酸脫羧酶、α-乙酰乳酸合成酶和2,3-丁二醇脫氫酶基因的表達，2,3-BD產(chǎn)量將會得以進一步提升。