黑曲霉果膠酯酶在畢赤酵母中異源表達、性質分析及脫酯工藝優(yōu)化

孫瑩，吳丹，鄭璞，陳鵬程

(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

果膠又稱聚甲氧基半乳糖醛酸，以原果膠、果膠酸和果膠的形式存在于植物中，具有良好的膠凝性、乳化性和增稠性。這3種果膠類物質的區(qū)別與甲酯的含量有關[1]。果膠分子主鏈上的半乳糖醛酸殘基在C-6位可被酯化為甲酯，甲酯化半乳糖醛酸與總半乳糖醛酸摩爾數(shù)之比稱為酯化度(degree of esterification，DE)[2]。食品化學法典規(guī)定：DE>50%的果膠稱為高酯果膠(high methoxyl pectin，HMP)，反之稱為低酯果膠(low methoxyl pectin，LMP)。LMP可以通過將HMP進行脫酯得到，脫酯法有化學法和酶法。化學法具有成本高、工藝控制繁瑣、污染環(huán)境等缺點。與化學法相比，酶法脫酯制備的LMP具有質量高，得率高和綠色環(huán)保等優(yōu)點[3]。HMP和LMP在工業(yè)中最重要的應用是凝膠作用，二者的凝膠機理不同[4]。HMP在含糖量高于55%和pH在2.0～3.5的條件下才可形成凝膠，通常用于高糖含量食品的生產，不利于糖尿病患者等特殊人群的使用，應用受到限制[5]。LMP則不受體系pH和可溶性固形物含量影響，在較低糖含量甚至無糖條件下，只要Ca2+等二價金屬陽離子存在即可形成凝膠，主要用于低糖食品的生產，符合現(xiàn)代人們降油降糖、健康飲食的需求，因而具有廣闊的市場前景[6]。

果膠酯酶(pectinesterase，PE，EC 3.1.1.11)，屬于羧酸酯水解酶系，是果膠酶三大組分之一[7]。PE能夠從果膠分子的還原性末端或者鄰近的游離羧基開始，定向攻擊甲氧基，進行去甲基化反應，生成果膠酸，從而將HMP轉化為LMP，屬于皂化酶[8]。PE廣泛存在于植物和微生物中，在植物中，主要存在于根、莖、葉和果實等中，在微生物中，PE主要存在于真菌(如曲霉菌)和細菌(如假單胞菌)[9]，此外，在一些植物致病菌(如導致植物軟腐病的歐氏桿菌)中也發(fā)現(xiàn)了PE[10]。PE被廣泛應用于食品加工，改善果膠在水中的溶解度，提高果蔬汁的出汁率，提高果汁果酒的澄清度等，還用于化妝品、制藥、造紙等行業(yè)。此外，PE也是一些植物病原體侵染植物的關鍵酶[11]。

20世紀60年代起，國內開始進行PE的來源、生物學特性、酶學性質及工業(yè)應用等方面的研究。盡管對PE已有了一定的研究，但目前國內外仍未實現(xiàn)酶法制備LMP的工業(yè)化生產，主要原因是國內目前研究的PE存在表達量低、酶活力低、熱穩(wěn)定性差等缺點[12]，限制了酶法制備LMP的工業(yè)化生產。目前尚未有專門用于脫酯的商品PE，市售的果膠酶大多是PE、聚半乳糖醛酸酶和果膠酸裂解酶的混合物，國內的PE市場受到Sigma等國外大型公司的限制，昂貴的價格也限制了我國酶法脫酯的工業(yè)發(fā)展[13]，因此對PE進行重組表達以提高其表達量及改善其酶學性質具有重要的意義。

本研究根據(jù)畢赤酵母(Pichiapastoris)X33的密碼子偏好性，對黑曲霉(Aspergillusniger)來源的PE基因進行密碼子優(yōu)化，并實現(xiàn)其在P.pastorisX33中的異源表達，分離純化獲得純PE，研究了其酶學特性，并對該酶的脫酯工藝條件進行優(yōu)化，以期為促進酶法制備LMP的工業(yè)化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

菌株EscherichiacoliJM109、PichiapastorisX33、質粒pPICZαA均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：HMP，上海麥克林生化科技有限公司；博萊霉素(ZeocinTM)，北京索萊寶科技有限公司；PrimeSTAR?Max DNA Polymerase、Premix TaqTM，大連寶生物工程有限公司；一步克隆試劑盒、T4 DNA連接酶、核酸分子質量Marker，諾維贊有限公司；質粒小提中量試劑盒、PCR產物純化試劑盒、膠回收試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司；其他試劑均為國產分析純或化學純。

主要儀器：PCR儀、蛋白電泳系統(tǒng)，美國伯樂生命醫(yī)學產品有限公司；電轉儀，德國艾本德股份公司；核酸電泳儀，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；堿式滴定管，揚州市葵花玻璃廠。蛋白純化系統(tǒng)，美國通用電氣醫(yī)療集團。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)、酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YPD)、酵母浸出粉胨甲醇(yeast extract peptone methanol，YPM)、BSM培養(yǎng)基均參照Invitrogen公司操作手冊推薦的方法進行配制。

1.2 實驗方法

1.2.1 表達載體pPICZαA-pe的構建

根據(jù)P.pastorisX33的密碼子偏好性，對黑曲霉PE基因(Genbank：XP_025519631.1)進行密碼子優(yōu)化，由天霖生物科技(上海)有限公司合成，并克隆至pUC57質粒中得到pUC57-pe重組質粒，以該重組質粒為模板，通過PCR反應得到優(yōu)化后的果膠酯酶基因pe。同樣地，以質粒pPICZαA為模板進行PCR擴增，通過膠回收獲得載體片段。使用一步克隆試劑盒將pe基因與pPICZαA進行連接，連接產物轉化感受態(tài)細胞E.coliJM109，涂布LB平板(含0.1 g/L ZeocinTM)，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取單克隆進行菌落PCR反應，挑取陽性轉化子接種至LB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)12～16 h后提取質粒進行酶切驗證，將酶切結果正確的質粒送天霖生物公司進行測序，測序無誤的質粒命名為pPICZαA-pe。

1.2.2 重組菌株X33的構建與搖瓶發(fā)酵

本研究采用P.pastorisX33作為表達宿主，使用SacⅠ將重組質粒pPICZαA-pe進行線性化，用PCR產物純化試劑盒回收純化片段，隨后電擊轉化至P.pastorisX33感受態(tài)細胞中，涂布YPD平板(含0.1 g/L ZeocinTM)，30 ℃培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落即為重組菌株X33。挑取重組菌單菌落接種至YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)24 h 后于4 ℃，5 000 r/min離心10 min，去除上清液得到菌體。轉接至YPM培養(yǎng)基中進行PE的誘導表達，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)72 h，每隔12 h添加終體積分數(shù)為1%的甲醇。誘導結束后，發(fā)酵液經4 ℃，7 000 r/min離心5 min后取上清液即得到PE粗酶液，對粗酶液的酶活力和蛋白濃度進行測定，通過篩選，選擇酶活力最高的1株重組菌株用于3 L罐高密度發(fā)酵。

1.2.3 酶活力的測定

參考GONZALEZ等[14]的方法并做出改進，采用堿滴定法。將30 mL 1 g/L的果膠溶液(pH 5.0 0.1 mol/L檸檬酸-0.2 mol/L Na2HPO4緩沖液)在37 ℃水浴搖床預熱10 min，加入1 mL待測PE液，置于37 ℃水浴搖床反應10 min，煮沸10 min滅活，用0.01 mol/L NaOH溶液滴定pH至9.0。以煮沸滅活的酶液作對照。酶活力定義為：在37 ℃、pH 5.0條件下，每分鐘作用果膠產生1 μmol羧基所需的酶量定義為1個酶活力單位。

1.2.4 酶學性質分析

將搖瓶發(fā)酵得到的PE粗酶液經陰離子交換柱分離純化后獲得的純PE進行酶學性質分析。

最適反應條件分析：用0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L檸檬酸緩沖液分別配制pH 2.0～8.0的底物溶液，在37 ℃下測定PE在不同pH體系中的酶活力，以最高酶活力為100%，比較各pH條件下的相對酶活力，確定最適反應pH。在最適反應pH條件下，測定30～85 ℃的酶活力，以最高酶活力為100%，確定最適反應溫度。

穩(wěn)定性分析：將純PE置于不同pH(2.0～8.0)的0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中，4 ℃靜置2 h，用pH 5.0的上述緩沖液調節(jié)pH至5.0后在最適條件下測定殘余酶活力，以未處理的PE的酶活力為100%，分析酶的pH穩(wěn)定性。將純PE分別在35、45、55、65、75 ℃下保溫100 min，每20 min取樣，立即置于冰浴中冷卻，在最適條件下測定殘余酶活力，以未經處理的PE的酶活力為100%，分析酶的溫度穩(wěn)定性。

動力學參數(shù)分析：在最適反應條件下測定PE在不同濃度HMP溶液下的酶活力，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法，以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標、酶活力的倒數(shù)為縱坐標，繪制酶動力學參數(shù)曲線。根據(jù)與坐標軸的交點，其中橫軸截距為-1/Km，縱軸截距為1/Vmax，計算出PE的米氏常數(shù)Km和最大反應速率Vmax。

1.2.5 重組菌株X33的3 L罐高密度發(fā)酵

挑取經篩選得到的1株重組菌單菌落接種至100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600值為10～12后，以10%接種量接種至含900 mL BSM培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐中進行高密度發(fā)酵。生長期的發(fā)酵參數(shù)為：溫度30 ℃、轉速220 r/min、溶氧(dissolved oxygen，DO)20%，使用濃氨水調節(jié)pH至5.5，培養(yǎng)至DO反彈(一般DO>60%)，進入補料分批培養(yǎng)階段，開始使用含有12 mL/L PTM1的500 g/L的甘油進行流加，待OD600達到100時，停止甘油的流加，進行饑餓培養(yǎng)，待DO再次反彈時，開始使用含有12 mL/L PTM1的甲醇進行誘導表達階段，誘導產PE，同時，設置誘導溫度為28 ℃，使用甲醇檢測流加控制器控制甲醇體積分數(shù)在0.5%，甲醇誘導開始后，每隔12 h取樣測定酶活力，誘導96 h后OD600達到500以上時終止發(fā)酵。

1.2.6 果膠酯化度的測定

稱取0.1 g果膠，移入100 mL錐形瓶中，加入0.4 mL乙醇潤濕，加入20 mL ddH2O，封口轉動使其完全溶解(時間不宜過久)，滴3滴5 g/L的酚酞指示劑，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至微紅色，記錄空白和樣品所耗NaOH的體積(V0、V1)，即為原始滴定度。繼續(xù)加入20 mL 0.5 mol/L NaOH溶液，封口后強烈振搖20 min，加入20 mL 0.5 mol/L HCl溶液，充分振搖至紅色消失，然后加入3滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至微紅色，記錄所耗NaOH體積(V2)，按公式(1)計算酯化度[15]。

(1)

1.2.7 PE的脫酯工藝條件優(yōu)化

以脫酯率為指標，采用控制變量法，進行單因素試驗，反應體系為50 mL，分別考察果膠濃度、加酶量、反應溫度、初始pH及脫酯時間對酶法脫酯反應的影響。

選擇10、20、30 g/L三個果膠質量濃度(pH 5.0)，每個果膠濃度分別選擇7個加酶量：32.7、65.4、98.1、196.2、392.4、784.8、981 U/g，65 ℃下水浴振蕩反應3 h，反應結束后，測所得LMP的酯化度。

采用已經優(yōu)化的果膠濃度和加酶量，分別配制pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的果膠溶液，65 ℃下水浴振蕩反應3 h，反應結束后，測所得LMP的酯化度。

采用已經優(yōu)化的果膠濃度、加酶量和初始pH，分別在50、55、60、65、70、75、80 ℃下水浴振蕩反應3 h，反應結束后，測所得LMP的酯化度。

采用已經優(yōu)化的果膠濃度、加酶量、初始pH和溫度，分別水浴振蕩10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120 min，反應結束后，測所得LMP的酯化度。

2 結果與分析

2.1 重組PE的異源表達

以pUC57-pe質粒為模板，通過PCR擴增得到果膠酯酶基因pe，電泳結果如圖1-a所示，在936 bp出現(xiàn)明顯的DNA條帶，與預期一致。以質粒pPICZαA為模板進行PCR擴增，得到載體片段，電泳結果如圖1-b所示，條帶大小與預期一致(3 546 bp)。利用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ對重組質粒pPICZαA-pe進行酶切驗證，結果如圖1-c所示，重組質粒被酶切后出現(xiàn)了與預期大小一致的2個DNA片段，分別為1 700和2 800 bp。構建好的質粒經測序驗證正確無誤后，命名為pPICZαA-pe。

M-DNA marker;a1-pe的PCR產物；b1-質粒pPICZαA的PCR產物；c1-被Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切后的質粒pPICZαA-pea-pe的PCR擴增產物電泳圖；b-質粒pPICZαA的PCR擴增產物電泳圖；c-重組質粒pPICZαA-pe的酶切驗證電泳圖圖1 PCR 擴增和重組質粒酶切驗證電泳圖Fig.1 Identification of PCR amplification production and recombinant plasmid with agarose gel electrophoresis

使用SacI線性化pPICZαA-pe質粒后經電轉化法轉化至P.pastorisX33感受態(tài)細胞，涂布YPD抗性平板，30 ℃培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。隨機挑取9個單菌落進行搖瓶誘導表達后，離心收集發(fā)酵液上清液，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析(圖2)，并測定酶活力(結果見表1)。選定搖瓶酶活力最高的7號菌株，作為3 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵的菌株。

1～9-1～9號重組菌株的發(fā)酵液上清液圖2 不同菌株的發(fā)酵液上清液SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE of supernatants from different strains

表1 重組PE搖瓶水平酶活力Table 1 Recombinant PE activities in shake flask

2.2 PE的3 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵

挑取7號重組菌株的單菌落接種至100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600達到10～12。按照10%接種量，接種至裝有900 mL BSM培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐中，進行高密度發(fā)酵，由于發(fā)酵過程除了初始的甘油培養(yǎng)階段，還有后續(xù)的甘油流加階段以及甲醇的誘導表達階段，一開始裝入太多培養(yǎng)基，后期會導致發(fā)酵液太滿而溢出發(fā)酵罐，無法繼續(xù)進行高密度發(fā)酵；其次，發(fā)酵過程全程自動流加氨水以保障酵母生長的最適pH，培養(yǎng)基太多會限制轉速從而影響溶氧，進而影響酵母的生長和酶的表達。甲醇誘導開始后，每隔12 h取樣，離心保留上清液，誘導96 h后停止發(fā)酵。對經不同誘導的發(fā)酵液上清液進行SDS-PAGE分析(圖3-a)，并測定酶活力和OD600值(圖3-b)。在發(fā)酵過程中，誘導96 h后，OD600達到435，84～96 h的OD600基本不變，重組PE的酶活力隨誘導時間的增加而提高，最終達到85.12 U/mL，相比于搖瓶表達最高酶活力(12.16 U/mL)提高了6倍。

a-不同時間發(fā)酵液上清液SDS-PAGE圖；b-發(fā)酵過程中酶活力和OD600曲線圖圖3 重組畢赤酵母3 L發(fā)酵罐發(fā)酵指標圖Fig.3 Recombinant P.pastoris fermentation process in 3 L bioreactor

2.3 重組PE的酶學性質研究

2.3.1 最適pH及pH穩(wěn)定性

重組PE的最適反應pH如圖4-a所示。重組PE在pH 5.0時的酶活力最高，在pH 4.5～5.5，仍有90%以上的酶活力；當pH從5.5升高至8.0時，酶活力迅速降低，pH 8.0時，僅有8.3%，說明該酶是一種偏酸性酶。pH穩(wěn)定性如圖4-b所示。重組PE即使在pH 3.5～6.5的酸性條件下孵育2 h后，仍具有60%以上的酶活力，但在pH 8.0孵育2 h后，其酶活力下降較多，僅有25%，說明該PE在堿性條件下的穩(wěn)定性較差。

a-最適pH；b-pH穩(wěn)定性圖4 pH對重組PE活性和穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of pH on activity and stability of recombinant PE

2.3.2 最適溫度及溫度穩(wěn)定性

重組PE的最適反應溫度如圖5-a所示。重組PE的最適反應溫度為55 ℃，在45～65 ℃時PE的相對酶活力保持在75%以上，55 ℃時具有最高酶活力，高于65 ℃時，酶活力迅速降低，溫度達到85 ℃時，PE失活。溫度穩(wěn)定性如圖5-b所示，重組PE在35～55 ℃相對比較穩(wěn)定，35 ℃下處理100 min，仍保持60%的酶活力；55 ℃下處理60 min，保持50%的酶活力，65 ℃下處理20 min，酶活力降低至25%，處理60 min，酶活力降低至8%；75 ℃下處理40 min即失去酶活力。說明該PE在低溫(35 ℃)下具有較好的穩(wěn)定性。

a-最適溫度；b-溫度穩(wěn)定性圖5 溫度對重組PE活性和穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity and stability of recombinant PE

2.3.3 PE動力學參數(shù)測定

用0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L檸檬酸緩沖液分別配制質量濃度為2、4、6、8、10、12 g/L的HMP溶液，以其為底物，對純化后的PE液適當稀釋后，與不同濃度的底物在最適條件下進行酶解反應，測定PE的活力。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，得到曲線方程y=1.523 8x+0.110 6，R2=0.998 6。根據(jù)曲線方程可計算出該PE的米氏常數(shù)Km為13.8 mmol/L，最大反應速率Vmax為9.04 μmol/(L·min)。

2.4 PE的脫酯工藝優(yōu)化

2.4.1 果膠濃度和酶量對脫酯的影響

選擇10、20、30 g/L三個果膠質量濃度(pH 5.0)，每個果膠濃度選擇32.7、65.4、98.1、196.2、392.4、784.8、981 U/g，7個加酶量水平，65 ℃下脫酯3 h，由圖6可知，果膠質量濃度為10 g/L時，果膠的酯化度隨加酶量的增加而降低，加酶量為981 U/g時，酯化度最低，為20.4%。果膠質量濃度為20 g/L時，加酶量在32.7～392.4 U/g時，果膠酯化度隨加酶量的增加而降低，加酶量為392.4 U/g時，酯化度最低，為22.2%，此后，隨加酶量的增加酯化度反而提高。果膠質量濃度為30 g/L，加酶量為65.4 U/g時，酯化度最低，為23.5%，此后，隨加酶量的增加，酯化度升高。在較高果膠濃度下，隨著加酶量的增加，酯化度反而增加的原因可能是脫酯果膠的反饋抑制，隨著加酶量增加，脫酯果膠濃度增加，反而抑制了PE的活性。綜上考慮成本及工藝，選擇30 g/L果膠、加酶量65.4 U/g，進行下一步的工藝條件優(yōu)化。

圖6 果膠濃度和加酶量對脫酯的影響Fig.6 Effect of pectin concentration and enzyme amount on de-esterification

2.4.2 初始pH對脫酯的影響

在30 g/L果膠和加酶量為65.4 U/g條件下，選擇pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，65 ℃下脫酯3 h，結果如圖7所示。酶法脫酯的最適pH為5.5。在pH 3.5～5.5范圍內，隨著pH的增加，果膠的酯化度降低，pH 5.5時，酯化度最低，為20.8%，此后，隨著pH的增加，酯化度升高。在pH 4.5～6.0，脫酯效果較好，酯化度在23%左右，這可能與該PE的偏酸性等電點(pI 4.16)有關。在pH 3.5～6.5，酯化度最高，為24.6%，最低為20.8%，酯化度相差較小，表明初始pH對酶法脫酯的影響較小。綜上，選擇pH 5.5進行下一步的工藝條件優(yōu)化。

圖7 初始pH對脫酯的影響Fig.7 Effect of initial pH on de-esterification

2.4.3 反應溫度對脫酯的影響

在30 g/L果膠、加酶量為65.4 U/g、pH 5.5條件下，分別選擇45、50、55、60、65、70、75 ℃脫酯3 h，結果如圖8所示。酶法脫酯的最適溫度為50 ℃。在45～75 ℃，果膠的酯化度呈現(xiàn)V型變化，在50 ℃時脫酯效果最好，此時酯化度為18.2%。此后隨著溫度的升高酯化度增加。原因是隨著溫度的升高，PE活力降低，脫酯率隨之下降，酯化度增加。脫酯溫度對脫酯效果影響較大。綜上，選擇反應溫度50 ℃進行下一步的工藝條件優(yōu)化。

圖8 反應溫度對脫酯的影響Fig.8 Effect of reaction temperature on de-esterification

2.4.4 反應時間對脫酯的影響

在30 g/L果膠、加酶量為65.4 U/g、pH 5.5、50 ℃條件下，分別于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 min進行脫酯。由圖9可知，酶法脫酯的最適反應時間為60 min。在10～120 min，果膠的酯化度呈現(xiàn)V型變化，在60 min時酯化度最低，為13.6%，PE脫脂效果最好。故選擇60 min為最佳反應時間。在10～60 min，酯化度隨時間的增加而降低。60 min后，隨時間的增加酯化度反而提高。該結果與姚小麗[16]的研究一致，在最適脫酯時間的基礎上延長反應時間，酯化度反而增加。猜想脫酯反應可能是可逆反應，時間的延長反而加速了逆反應的進行，但酶法脫酯過程是否是可逆過程還需進一步研究。

圖9 反應時間對脫酯的影響Fig.9 Effect of reaction time on de-esterification

3 討論與結論

本研究將來源于黑曲霉的果膠酯酶基因pe在P.pastorisX33成功實現(xiàn)高水平分泌表達，通過高密度發(fā)酵得到的粗酶液的酶活力達到85.12 U/mL，是目前報道的PE異源表達最高酶活力水平，較好解決了一直以來PE活力較低的問題。同時重組PE廣泛的pH穩(wěn)定性和較好的溫度穩(wěn)定性表明了其在工業(yè)應用方面的良好潛力。本研究所獲得的PE在優(yōu)化的最佳脫酯工藝條件下進行脫脂得到酯化度為13.6%的LMP，是目前所有酶法脫酯制備LMP相關報道中脫酯率最高、酯化度最低的實驗結果，在酶法制備LMP的工業(yè)應用方面具有較好的應用意義。